八珍袋泡茶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究

i八珍袋泡茶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究目錄摘要 iiABSTRACT iii前言 11儀器與試藥 11.1儀器 11.2試藥 22方法與結(jié)果 22.1薄層色譜鑒別 22.2含量測(cè)定 4綜述 12致謝 17第13頁(yè)，共=NUMPAGES22-517頁(yè)八珍袋泡茶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究摘要：目的：提升八珍袋泡茶的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜(TLC)法對(duì)制劑中當(dāng)歸、川芎、茯苓和甘草4味中藥進(jìn)行定性鑒別；采用高效液色譜（HPLC）法同時(shí)測(cè)定制劑中芍藥苷和藁本內(nèi)酯的含量。結(jié)果：當(dāng)歸、川芎、茯苓、甘草的薄層色譜斑點(diǎn)清晰，分離度較好，陰性對(duì)照無(wú)干擾；芍藥苷、藁本內(nèi)酯的線性范圍分別為0.159～1.271μg（r=0.9998），0.14～1.12μg（r=0.9996）；芍藥苷、藁本內(nèi)酯的加樣回收率分別為98.64%（RSD=1.36%，n=9）、98.34%（RSD=1.64%，n=9）。結(jié)論：該研究方法簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確，操作性強(qiáng)，可控制八珍袋泡茶的質(zhì)量。關(guān)鍵詞：八珍袋泡茶；薄層色譜法；芍藥苷；藁本內(nèi)酯；高效液相色譜法前言八珍袋泡茶原方出自明代醫(yī)家薛己所著的《正體類(lèi)要》，是由黨參、炒白術(shù)、茯苓、甘草、當(dāng)歸、白芍、川芎、熟地黃八味中藥材組成，都具有補(bǔ)氣益血之功效[1]，適用于氣血虧損，面色發(fā)黃，四肢乏力等癥狀。其中當(dāng)歸屬于補(bǔ)血藥，不僅能夠補(bǔ)血，更有“補(bǔ)而不滯”的特點(diǎn)，得以活血調(diào)經(jīng)，除此之外，當(dāng)歸還能潤(rùn)腸通便；川芎為血中之氣藥，其療效能活血化瘀，行氣開(kāi)郁，止痛；茯苓不僅能利水消腫，健脾補(bǔ)中，還可以安身神，入心經(jīng)的作用；甘草有清熱解毒，健脾益氣，止咳化痰，緩急止痛，并且還可以調(diào)和諸藥的作用；白芍既能養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，柔肝止痛，又能斂陰收汗，平抑肝陽(yáng)。茯苓、白芍、甘草中分別含有茯苓多糖、芍藥苷、甘草酸成分都有免疫調(diào)節(jié)[2-4]作用；白芍中芍藥苷成分研究，臨床治療于肝癌[5],Aβ刺激的神經(jīng)炎癥[6],MRGPRX2引起的假性過(guò)敏[7]等；當(dāng)歸、川芎中藁本內(nèi)酯成分對(duì)婦科疾病[8]、心血管系統(tǒng)[9]有較強(qiáng)藥理活性，在治療循環(huán)系統(tǒng)疾病過(guò)程中，能擴(kuò)張血管、增加冠脈流量[10]，另外血管平滑肌細(xì)胞的增殖有抑制作用[11]。其中當(dāng)歸、川芎在臨床上常配對(duì)伍用，增強(qiáng)養(yǎng)血補(bǔ)血、活血化瘀、調(diào)經(jīng)止痛的作用[12]。在1991年出版的《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中，就有收錄八珍袋泡茶的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，迄今逾三十多年仍在收錄范圍內(nèi)，但其完善與提高的空間很大，目前有關(guān)八珍袋泡茶中的同時(shí)測(cè)定不同成分的含量和薄層色譜定性鑒別相對(duì)較少，八珍袋泡茶方中藥材多，單個(gè)藥材成分的鑒定和含測(cè)較為復(fù)雜，本研究在現(xiàn)在有文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上，結(jié)合《中國(guó)藥典》2020版中當(dāng)歸、川芎、茯苓、甘草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)方法，采用薄層色譜法同時(shí)對(duì)當(dāng)歸和川芎，茯苓和甘草進(jìn)行定性鑒，以高效液相法同時(shí)測(cè)定芍藥苷和藁本內(nèi)酯的含量，以期為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，對(duì)保證其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善和提高具有重要意義。1儀器與試藥1.1儀器高效液相色譜儀（UV檢測(cè)器，美國(guó)瓦里安公司，型號(hào)：VARIAN210）；電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，精度為0.1mg，型號(hào)：BSA124S型）；超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份公司，功率為200W，頻率為40kHz，型號(hào)：SB-5200D型）；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本ShimadzuUV公司，型號(hào)：UV-1240型）；暗箱式四用紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司，型號(hào)：ZF-型）。1.2試藥當(dāng)歸對(duì)照藥材（批號(hào)：120927-201617）、川芎對(duì)照藥材（批號(hào)：120918-201813）、茯苓對(duì)照藥材（批號(hào)121117-201910）、甘草對(duì)照藥材（批號(hào)：120904-202021）、芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736-202044，含量以96.8%計(jì)）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；藁本內(nèi)酯對(duì)照品（上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：Z812557，含量≧99%）；乙腈、磷酸為色譜純?cè)噭疄槌兯?，其余試劑均為分析純?cè)噭?；八珍袋泡茶?批(廣西藥用植物園制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)分別為：210101、210102、210401，規(guī)格：2.4g/袋）。2方法與結(jié)果2.1薄層色譜鑒別2.1.1當(dāng)歸、川芎的鑒別取本品2袋，加入30ml的石油醚，經(jīng)過(guò)超聲處理30min后，取出，濾過(guò)，濾液水浴蒸干，再用1ml環(huán)己烷將剩余的殘?jiān)耆芙?，既得供試品溶液；取?dāng)歸、川芎對(duì)照藥材粉各1g，分別以相同方法制備成對(duì)照藥材溶液；按八珍袋泡茶處方比例取缺當(dāng)歸、川芎的其余藥材，按工藝制備成缺當(dāng)歸、川芎陰性樣品，以上述相同方法制備成陰性對(duì)照品溶液。按2020年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502薄層色譜法[13]試驗(yàn)，吸取上述制備好的4種溶液各5μl，并且點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（9:1）溶液作為展開(kāi)劑，飽和30min，展開(kāi)，取出，晾干后在365nm紫外光下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜與對(duì)照藥材色譜在相應(yīng)的位置上有相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖2.1。123456注：1.當(dāng)歸對(duì)照藥材溶液；2.川芎對(duì)照藥材溶液；3-5.供試品溶液；6.陰性對(duì)照品溶液圖2.1當(dāng)歸、川芎薄層色譜圖2.1.2茯苓、甘草的鑒別以“2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液作為供試品溶液；取茯苓、甘草對(duì)照藥材粉各1g，加入30ml的石油醚，經(jīng)過(guò)超聲處理30min后，取出，濾過(guò)，濾液水浴蒸干，再用1ml環(huán)己烷將剩余的殘?jiān)耆芙?，分別制成對(duì)照藥材溶液；按八珍袋泡茶處方比例取缺茯苓、甘草的其余藥材，按工藝制備成缺茯苓、甘草陰性樣品，以上述相同方法制備成陰性溶液。按2020年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502薄層色譜法[13]試驗(yàn)，吸取上述制備好的4種溶液各10μl，且分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-氯仿-丙酮（10:2:0.7）溶液作為展開(kāi)劑，飽和30min，展開(kāi)，取出并晾干，噴灑10%硫酸乙醇溶液，放置105℃加熱板上至斑點(diǎn)清晰再放置10min，在紫外光（365nm）下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜與對(duì)照藥材色譜在相應(yīng)的位置上有相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖2.2。123456注：1.茯苓對(duì)照藥材溶液；2.甘草對(duì)照藥材溶液；3-5.供試品溶液；6.陰性對(duì)照品溶液圖2.2茯苓、甘草薄層色譜圖2.2含量測(cè)定2.2.1色譜條件色譜柱：KromasilC18色譜柱(250mmx4.6mm，5μm)；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫：0～12min，19%A，81%B；12～13min，19%～27%A，81%～73%B；13～26min，27%A，73%B；26～27min，27%～19%A，73%～81%B；27～30min，19%A，81%B；檢測(cè)波長(zhǎng)：0～15min：230nm（檢測(cè)芍藥苷）、15～40min：280nm（檢測(cè)藁本內(nèi)酯）；流速：1.0ml/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μl；理論塔板數(shù)不低于4000。2.2.2對(duì)照品溶液制備精密稱取芍藥苷對(duì)照品0.0082g、藁本內(nèi)酯對(duì)照品0.0070g，置于50mL容量瓶中，加入70%乙醇溶解至刻度，配制成芍藥苷濃度為0.1588mg/mL、藁本內(nèi)酯濃度為0.1400mg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密量取上液5mL，置10mL棕色容量瓶中，即得混合對(duì)照品溶液。2.2.3供試品溶液精密稱取八珍袋泡茶樣品1g，置于50ml具塞瓶中，用移液管量取25ml的70%乙醇溶液加入，稱重并浸泡1h，經(jīng)過(guò)超聲處理30min后取出并冷卻，再重新稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失重量，充分搖勻且濾過(guò)，取續(xù)濾液，既得。2.2.4陰性對(duì)照溶液按八珍袋泡茶處方比例取缺白芍、當(dāng)歸、川芎的其余藥材，按其工藝制備成缺白芍、當(dāng)歸、川芎陰性樣品，并按“2.2.3”項(xiàng)下相同方法制備陰性樣品溶液，既得。2.2.5專(zhuān)屬性試驗(yàn)分別精密吸取上述配制好的芍藥苷和藁本內(nèi)酯的混合對(duì)照品溶液、八珍袋泡茶供試品溶液及缺白芍、當(dāng)歸、川芎的陰性對(duì)照溶液各10μl，按“2.2.1”項(xiàng)下所研究建立的色譜條件進(jìn)行檢測(cè)分析，記錄色譜圖，見(jiàn)圖2.3。結(jié)果顯示，芍藥苷、藁本內(nèi)酯色譜峰與混合對(duì)照品在相同的保留時(shí)間有相同的色譜峰，峰形良好，前后與其它色譜峰分離度大于1.5，且陰性對(duì)照無(wú)干擾，具有良好的專(zhuān)屬性。1．芍藥苷2。藁本內(nèi)酯A．混合對(duì)照品溶液B。供試品溶液C。陰性對(duì)照品溶液圖2.3高效液相色譜圖2.2.6線性關(guān)系考察分別精密量取2.2.1”項(xiàng)下配制好的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液1，2，3，4，5，6，7，8ml，分別置于10ml容量瓶中，加入70%乙醇定容到刻度線，充分搖勻，微孔濾膜過(guò)濾既得。按“2.2.1”項(xiàng)下所研究建立的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X，μg），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算得芍藥苷、藁本內(nèi)酯回歸方程分別為：Y=33.7046X+35.8124，r=0.9998；Y=6.5671X+4.8128，r=0.9996。結(jié)果表明，芍藥苷、藁本內(nèi)酯線性范圍分別在0.159～1.271μg、0.14～1.12μg與峰面積呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果如表2.1和表2.2所示。表2.1芍藥苷線性關(guān)系考察1ml2ml3ml4ml5ml6ml7ml8ml濃度（mg/ml）0.01590.03180.04760.06350.07940.09530.11120.1271進(jìn)樣量（ug）0.1590.3180.4760.6350.7940.9531.1121.271峰面積41.101046.501352.046857.444162.363167.620373.345678.8002表2.2藁本內(nèi)酯線性關(guān)系考察1ml2ml3ml4ml5ml6ml7ml8ml濃度（mg/ml）0.01400.02800.04200.05600.07000.08400.98000.1120進(jìn)樣量（ug）0.140.280.420.560.700.840.981.12峰面積5.72446.67967.61518.46219.327710.351211.227912.21202.2.7精密度試驗(yàn)取2.2.1”項(xiàng)下配制好的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，按“2.2.1”項(xiàng)下所研究建立的色譜條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積并計(jì)算RSD值，考察芍藥苷、藁本內(nèi)酯混合對(duì)照品峰面積的變化情況。結(jié)果表明，芍藥苷、藁本內(nèi)酯峰面積RSD分別為0.71%、0.82%，表明該儀器精密度良好。2.2.8穩(wěn)定性試驗(yàn)精密稱取八珍袋泡茶（批號(hào)：210101）樣品1g，按“2.2.3”項(xiàng)下相同方法制備樣品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下所研究建立的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別在0、1、2、4、8、12、24h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算RSD值，考察八珍袋泡茶供試品溶液室溫下放置在不同的時(shí)間內(nèi)峰面積變化情況。結(jié)果表明，供試品溶液中芍藥苷、藁本內(nèi)酯峰面積RSD分別為1.18%，1.55%，表明該八珍袋泡茶供試品溶液在24h內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定。2.2.9重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取八珍袋泡茶（批號(hào)：210101）樣品1g，共6份，按“2.2.3”項(xiàng)下相同方法制備樣品溶液，再按2.2.1項(xiàng)下所研究建立的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄6份芍藥苷、藁本內(nèi)酯的峰面積以計(jì)算含量。結(jié)果表明，芍藥苷、藁本內(nèi)酯平均含量分別為1.9076mg/g、1.1873mg/g，RSD分別為0.94%，1.09%。說(shuō)明該方法的重復(fù)性良好。2.2.10加樣回收試驗(yàn)精密稱取芍藥苷對(duì)照品0.0130g、藁本內(nèi)酯對(duì)照品0.0078g，置于25ml棕色容量瓶中，加70%乙醇溶解并稀釋至刻度線，配成含芍藥苷0.5034mg/ml、藁本內(nèi)酯0.3120mg/ml的混合對(duì)照品溶液；精密稱取八珍袋泡茶（芍藥苷含量為1.9076mg/g、藁本內(nèi)酯含量為1.1873mg/g）樣品0.5g共9份，依次精密加入混合對(duì)照品溶液（芍藥苷濃度0.5034mg/ml、藁本內(nèi)酯0.3120mg/ml）1，2，3ml各3份，按“2.2.3”項(xiàng)下相同方法制備樣品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下所研究建立的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算，結(jié)果芍藥苷、藁本內(nèi)酯平均回收率分別為98.64%、98.34%，其RSD分別為1.36%、1.64%，結(jié)果見(jiàn)表2.3。2.2.11樣品含量測(cè)定精密稱取3批不同批號(hào)的八珍袋泡茶樣品1g，按“2.2.3”項(xiàng)下相同方法制備樣品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下所研究建立的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄芍藥苷、藁本內(nèi)酯峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2.4。表2.3加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）成分取樣量（g）樣品中對(duì)照品量（mg）加入對(duì)照品量（mg）測(cè)得對(duì)照品量（mg）回收量（mg）回收率（%）平均回收率（%）RSD%芍藥苷0.52761.00630.50341.49860.492297.7898.641.36%0.52100.99380.50341.49130.497698.840.52310.99780.50341.50460.5069100.690.52951.01001.00682.00330.993398.660.52531.00201.00681.97390.971996.530.52781.00671.00682.00340.996698.990.52461.00061.51022.46491.464396.960.53161.01401.51022.51951.505599.690.52420.99991.51022.50461.504899.64藁本內(nèi)酯0.52760.62640.31200.92960.303297.1798.341.64%0.52100.61860.31200.92920.310799.570.52310.62110.31200.93230.311299.750.52950.62870.62401.25060.622099.670.52530.62370.62401.22540.601796.430.52780.62670.62401.25410.6274100.540.52460.62290.96301.55940.936697.260.53160.63120.96301.55800.926896.240.52420.62240.96301.56980.947598.39表2.4樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）批號(hào)芍藥苷(mg/g)藁本內(nèi)酯（mg/g）2101011.9076187241.19332104011.89941.17503討論八珍袋泡茶方中藥材種類(lèi)較多，為了更有效的控制其質(zhì)量，本研究對(duì)處方中的藥材開(kāi)展薄層鑒別，采用高效液相色譜法對(duì)有效成分進(jìn)行定量測(cè)定。根據(jù)《中國(guó)藥典》2020年版一部藥材項(xiàng)下的相關(guān)方法并結(jié)合近年來(lái)發(fā)表的研究成果[14-16]，采用TLC法同時(shí)對(duì)當(dāng)歸和川芎進(jìn)行定性鑒定、同時(shí)對(duì)茯苓和甘草進(jìn)行定性鑒定，相較于現(xiàn)有的單個(gè)藥材進(jìn)行定性鑒定的方法，該方法更加高效且可行；藁本內(nèi)酯是當(dāng)歸、川芎的主要活性成分之一，含量較高[17-19]，在以HPLC法測(cè)定芍藥苷含量的基礎(chǔ)上，通過(guò)不斷考察不同流動(dòng)相梯度洗脫的方法[20-22]，最終以乙腈-0.1%磷酸梯度洗脫為流動(dòng)相；以此建立了對(duì)藁本內(nèi)酯的含量測(cè)定方法且與芍藥苷同時(shí)進(jìn)行，進(jìn)一步完善了對(duì)八珍袋泡茶的含量測(cè)定依據(jù)。八珍袋泡茶療效明顯，臨床應(yīng)用廣泛，而藥品質(zhì)量安全不容忽視。其現(xiàn)有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究?jī)H收有對(duì)單個(gè)藥材的定性和定量方法，不能很好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，總體來(lái)看，標(biāo)準(zhǔn)還不夠完善，且普遍偏低。本研究提升了八珍袋泡茶的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，將現(xiàn)有較為復(fù)雜的研究方法進(jìn)行了優(yōu)化，研究結(jié)果表明，本研究方法簡(jiǎn)便可行，從生產(chǎn)上來(lái)看，不僅節(jié)約了檢驗(yàn)成本，還為八珍袋泡茶的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)做出了更為有力的參考依據(jù)，以期將其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)更加標(biāo)準(zhǔn)化。參考文獻(xiàn)[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:一部[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2020:485-486.[2]杜曉妍,吳嬌.茯苓的化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2021,38(05):496-500.[3]張育貴,張淑娟,邊甜甜,等.芍藥苷藥理作用研究新進(jìn)展[J].中草藥,2019,50(15):3735-3740.[4]孫娟,莊亦心,胡鋒清,等.甘草酸作為甜味劑的研究進(jìn)展[J].中國(guó)食品添加劑,2020,31(11):144-148.[5]FengZeng,QixinZhong,RulanTan,etal.PaeoniflorinAffectsHepatocellularCarcinomaProgressionbyInhibitingWnt/β-CateninPathwaythroughDownregulationof5-HT1D[J].CurrentPharmaceuticalBiotechnology,2021,22(9).[6]ChoEunJu,KimHyunYoung,LeeAhYoung.PaeoniflorinamelioratesAβ-stimulatedneuroinflammationviaregulationofNF-κBsignalingpathwayandAβdegradationinC6glialcells.[J].Nutritionresearchandpractice,2020,14(6).[7]WangJianli,ZhangYongjing,WangJue,etal.PaeoniflorininhibitsMRGPRX2-mediatedpseudo-allergicreactionviacalciumsignalingpathway.[J].Phytotherapyresearch:PTR,2020,34(2).[8]董晴,陳明蒼.當(dāng)歸化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2016,12(02):32-34.[9]楊志軍,顧寧.藁本內(nèi)酯心血管藥理作用研究概況[J].吉林中醫(yī)藥,2016,36(02):211-213.[10]汪程遠(yuǎn),張燕,譚月晗.含川芎、當(dāng)歸中成藥中藁本內(nèi)酯的檢測(cè)分析[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2012,9(26):119-121.[11]QunLu,Tai-QiuQiu,HongYang.Ligustilideinhibitsvascularsmoothmusclecellsproliferation[J].EuropeanJournalofPharmacology,2006,542(1).[12]李偉霞,唐于平,王歡,等.藥對(duì)研究（Ⅶ）——當(dāng)歸-川芎藥對(duì)[J].中國(guó)中藥雜志,2013,38(24):4220-4226.[13]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共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(zhǔn)提高。隨著經(jīng)濟(jì)水平的提高和科技飛速的發(fā)展，中藥材的分析技術(shù)越來(lái)越精湛，可以為八珍袋泡茶的研究分析提供技術(shù)支撐，讓八珍袋泡茶的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)更加完善。中藥材在我國(guó)具有悠久的歷史，并且在2019年新冠肺炎的襲來(lái)，國(guó)家主張堅(jiān)持“中西醫(yī)并重，中西藥并用”，體