單核細胞增生李斯特氏菌實驗活動風險評估報告

單核細胞增生李斯特氏菌實驗活動風險評估報告生物學特性種類和細菌分型目前，國際上公認的李斯特氏菌共有以下七個菌株：單核細胞增生李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）,綿羊李斯特菌（Listeriaiuanuii）,英諾克李斯特菌(Listeriainnocua),威爾斯李斯特菌(Listeriawelshimeri),西爾李斯特菌(Listeriaseeligeri),格雷李斯特菌(Listeriagrayi),默里李斯特菌(Listeriamurrayi)。其中，單核細胞增生李斯特氏菌是唯一能夠引起人類疾病的，它是一種人畜共患病的病原菌，中毒嚴重的可引起血液和腦組織感染。單核細胞增生李斯特氏菌簡稱單增李斯特氏菌，為革蘭陽性菌，屬厚壁菌門。根據(jù)單核細胞增生李斯特氏菌的菌體（O）抗原和鞭毛(H)抗原，將單核細胞增生李斯特氏菌分成13個血清型，分別是1/2a,1/2b,1/2c,3a,3b,3c,4a,4b,4ab,4c,4d,4e和7。致病菌株的血清型一般為1/2b,1/2c,3a,3b,3c,4a,1/2a和4b，以后兩型居多。該菌與多種革蘭陽性菌有共同抗原，故血清學診斷無意義。(二)來源李斯特氏菌是1926年英國南非裔科學家穆里在病死的兔子體內首次發(fā)現(xiàn)的。為紀念近代消毒手術之父,英國生理學家約瑟夫·李斯特（1827~1912），1940年，在第三屆國際微生物學大會上將其命名為李斯特氏菌。(三)傳染性單核細胞增生李斯特氏菌是一種人畜共患病的病原菌，它能引起人,畜的李斯特菌病，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥,腦膜炎和單核細胞增多癥。(四)傳播途徑單核細胞增生李斯特氏菌主要以食物為傳染媒介，是最致命的食源性病原體之一，造成二至三成的感染者死亡，其致死率甚至高過沙門氏菌及肉毒桿菌。人主要通過食入軟奶酪,未充分加熱的雞肉,未再次加熱的熱狗,鮮牛奶,巴氏消毒奶,冰激凌,生牛排,羊排,卷心菜色拉,芹菜,西紅柿,法式餡餅,凍豬舌等而感染。約85%~90%的病例是由被污染的食品引起的。該菌可通過眼及破損皮膚,黏膜進入體內而造成感染，孕婦感染后通過胎盤或產(chǎn)道感染胎兒或新生兒。棲居于產(chǎn)道,子宮頸的該菌也可引起感染。性接觸也是本病傳播的可能途徑，且有上升趨勢。(五)易感性易感者為新生兒,孕婦及40歲以上的成人。此外，酗酒者,免疫系統(tǒng)損傷或缺陷者,接受免疫抑制劑和皮質激素治療的患者及器官移植者也易被該菌感染。(六)潛伏期單核細胞增生李斯特氏菌在感染后3~70d出現(xiàn)癥狀。健康成人可出現(xiàn)類似流感的輕微癥狀，而易感者的癥狀為突然發(fā)熱,劇烈頭痛,惡心,嘔吐,腹瀉,敗血癥,腦膜炎，孕婦出現(xiàn)流產(chǎn)。(七)劑量一效應關系單增李氏菌進入人體后是否發(fā)病，與該菌的毒力和宿主的年齡,免疫狀態(tài)有關，因為該菌是一種細胞內寄生菌，宿主對它的清除主要靠細胞免疫功能。(八)致病性1.致病機理單核細胞增生李斯特氏菌的抗原結構與毒力無關，該菌誘導以CD8+H和CD4+T介導的特異性免疫應答，破壞宿主免疫。單核細胞增生李斯特氏菌能夠黏附和進入消化道上皮細胞，侵入上皮細胞的單核細胞增生李斯特氏菌被單核巨噬細胞吞噬，并隨其擴散到局部淋巴結，最后到達內臟器官。單核細胞增生李斯特氏菌能在單核巨噬細胞,肝細胞,內皮細胞及成纖維細胞等多種細胞內存活并繁殖，在很大程度上防止了體液免疫如抗體和補體介導的裂解反應。2.所致疾病單核細胞增生李斯特氏菌廣泛分布于自然界，在健康人群中的攜帶率為1%~5%。其致病物質為李斯特溶素o，與鏈球菌溶素o和肺炎鏈球菌溶素的基因具有同源性。此溶血素需細菌被吞噬后在細胞內生長時釋放，這與細菌能在巨噬細胞和上皮細胞內生長及在細胞間轉播有關。本菌所致的新生兒疾患有早發(fā)和晚發(fā)兩種類型。早發(fā)型為宮內感染，常致嬰兒敗血癥，病死率極高，晚發(fā)型在出生后2~3周引起腦膜炎和敗血癥等。本菌致成人感染的癥狀主要是引起腦膜炎和敗血癥等。(九)變異性對于單核細胞增生李斯特氏菌的變異性目前尚未有確鑿證據(jù)資料可以證實。(十)環(huán)境中的穩(wěn)定性單核細胞增生李斯特氏菌能在2~42℃下生存，能在冰箱冷藏室內較長時間進行生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。(十一)藥物敏感性單核細胞增生李斯特氏菌對青霉素,氨芐西林,四環(huán)素,磺胺均敏感。(十二)消毒劑敏感性70%酒精5min，2.5%石炭酸,2.5%氫氧化鈉,2.5%福爾馬林20min可殺死此菌，對堿和鹽的抵抗力強。(十三)物理滅活對理化因素抵抗力較強，60~70℃經(jīng)5~20min可殺死。(十四)在宿主體外存活體外培養(yǎng)菌營養(yǎng)要求不高，在20~25℃培養(yǎng)有動力，最適培養(yǎng)溫度為35~37℃，在pH中性至弱堿性(pH9.6),氧分壓略低,二氧化碳張力略高的條件下該菌生長良好。(十五)與其他生物和環(huán)境的交互作用單增李斯特氏菌廣泛存在于自然界中，不易被凍融，能耐受較高的滲透壓，該菌在土壤,地表水,污水,廢水,植物,青儲飼料,爛菜中均有存在，所以動物很容易食入該菌，并通過口腔—糞便的途徑進行轉播。(十六)預防和治療方案預防單核細胞增生李斯特氏菌在一般熱加工處理中能存活，熱處理已殺滅了競爭性細菌群，使單增李斯特氏菌在沒有競爭的環(huán)境條件下易于存活，所以在食品加工中，中心溫度必須達到70℃持續(xù)2min以上。單核細胞增生李斯特氏菌在自然界中廣泛存在，所以即使產(chǎn)品已經(jīng)過熱加工處理后充分滅活了單增李斯特氏菌，但有可能造成產(chǎn)品的二次污染，因此，蒸煮后防止二次污染是極為重要的。因為單核細胞增生李斯特氏菌在4℃下仍然能生長繁殖，所以未加熱的冰箱食品增加了食物中毒的危險。冰箱食品需加熱后再食用。如果是生魚片之類的海鮮，則專業(yè)酒店都會存放于零下40℃左右的大型冰柜，以確保殺滅寄生蟲及防止病菌感染。治療單核細胞增生李斯特氏菌感染治療可用青霉素,氨芐西林,慶大霉素,紅霉素等。對青霉素過敏的可用紅霉素和其他廣譜抗生素。二,實驗室相關活動風險評估與控制實驗室感染性因子的種類,來源和危害感染性因子的種類單核細胞增生李斯特氏菌的毒力因子主要有李斯特溶血毒素,肌動蛋白聚合蛋白,C型磷脂酶,內化素,細胞壁水解酶,酰胺酶以及毒力調節(jié)因子等。根據(jù)其生物學特性和本中心實驗室檢測能力范圍，實驗室可能的感染因子為單核細胞增生李斯特氏菌病原體本身。感染性因子的來源標本或樣品的采樣,運輸,接收,處理,實驗室檢測操作，菌株保存，銳器及生物安全柜等設備的使用,廢棄物處置等。實驗操作包括樣品制備,細菌分離及培養(yǎng),生化試驗等。感染性因子造成的危害被污染的實驗器材,器皿對實驗室環(huán)境造成污染。實驗室含有病原菌的廢棄物對環(huán)境造成污染。實驗人員被銳器刺傷造成的皮膚黏膜等暴露后感染。實驗室檢測活動工作中，各種原因導致的液體飛濺或微滴濺出及氣溶膠對實驗室環(huán)境造成污染。單核細胞增生李斯特氏菌主要通過糞-口途徑感染，還可通過眼及破損皮膚,黏膜進入體內而造成感染。在實驗室工作中，各種原因導致的液體飛濺或微滴濺出，從而污染器物表面或地面等，造成感染性物質被意外食入而感染；被可能存在的感染性病原體的銳器刺傷,割傷造成皮膚黏膜感染；這是兩種較可能的實驗室獲得性感染方式。積極地預防和防護是實驗室感染的最有效措施。實驗活動風險識別與風險控制試驗方法風險點識別未采用國家標準,行業(yè)標準進行檢測；使用新的或變更的國家標準或行業(yè)標準前，未經(jīng)技術確認，可能存在安全風險。風險控制措施盡量采用國際標準,行業(yè)標準進行檢測，或使用經(jīng)過充分驗證的實驗方法；在使用新的或變更過的國家標準,行業(yè)標準前，必須經(jīng)過嚴格的技術確認。樣品采集食品和水樣等樣品采集主要實驗設備和器材散裝樣品需用剪刀或鑷子,不銹鋼扣蓋飯盒,螺旋蓋塑料采樣罐,螺旋蓋玻璃瓶的容器；定型包裝樣品視產(chǎn)品本身包裝而定。主要風險點識別食品和水樣等樣品中可能存在感染性病原體，采用人員采樣不規(guī)范,盛裝容器密合不嚴,玻璃容器意外破損等，可導致樣品濺灑,溢出,,滲漏而污染環(huán)境；同時，玻璃容器意外破損和剪刀,鑷子的使用不當，存在意外刺傷或劃傷采用人員的風險。風險控制措施食品和水樣等樣品采集容器必須防水,防漏，容器外面要包裹足量的吸收性材料，以便容器打破或泄露時，能吸收溢出的所有液體。在使用剪刀,鑷子,玻璃容器等銳器時必須規(guī)范操作，做好防護，防止刺傷或劃傷。鼻咽部分泌物,腦脊液,糞便,嘔吐物,食品加工環(huán)節(jié)涂抹物等樣本采集主要實驗設備和器材PV螺旋蓋采便盒（管）,玻璃試管或培養(yǎng)皿,采樣消毒棉簽。主要風險點識別鼻咽部分泌物,腦脊液,糞便,嘔吐物,食品加工環(huán)節(jié)涂抹物等樣本中可能存在感染性病原體，采集過程中樣本濺出從而形成小顆粒氣溶膠；工作人員采樣不規(guī)范,個人防護不到位，導致環(huán)境污染和人員感染；破碎玻璃試管或培養(yǎng)皿存在刺傷或劃傷采樣人員的隱患。風險控制措施采集鼻咽拭子時，采用人員應戴手套,口罩,防護眼鏡；采樣動作輕柔，采樣容器盡量使用外螺旋蓋塑料管；發(fā)生污染時應立即進行消毒處理。(3)血液的采集①主要實驗設備和器材一次性采血針和塑料采血管。②主要風險識別點血液樣品可能存在感染性病原體，采血管密封蓋意外脫落或注射器內殘留血滴落，造成血樣濺灑從而污染人員或環(huán)境；采血針頭存在意外刺傷或劃傷采樣人員的風險。風險控制措施使用一次性采血針和真空采血管，采樣人員經(jīng)過正規(guī)培訓，并熟練掌握采血技巧。采血前做好個人防護(防護衣，乳膠手套，口罩)；認真，仔細，謹慎操作，抽血后的針頭直接放入利器盒內，禁止用手直接接觸使用后的針頭或將使用后的針頭重新套上針頭套；采好血后直立與試管架上，防止倒翻；消毒棉簽等污染物放入醫(yī)療廢棄物專用袋中，統(tǒng)一進行消毒處理。樣品的包裝運送主要實驗設備和器材真空密封采血管，外螺旋蓋玻璃瓶，PV螺旋蓋采樣管主容器，95千帕樣品運輸罐，B類標本運輸箱（UN3373冷藏箱），運送車輛。主要風險點識別盛樣容器不堅固，密合不嚴，有可能存在樣品濺灑，溢出，滲漏；使用不合格運輸包裝進行樣本運送，存在玻璃容器或包裝容器意外破碎，刺傷或劃傷采送樣人員的隱患。風險控制措施盛裝樣品容器必須堅固，不易破碎，盡可能選用塑料制品，采樣后必須檢查容器的密合性。樣品的運輸需使用三層合格包裝材料。樣品接收和前處理主要實驗設備和器材剪刀，鑷子，振蕩器，均質器，均質袋，離心機，生物安全柜和潔凈工作臺。主要風險點識別樣品管理員未按實驗室《樣品管理程序》（XJK/CX32）要求接受樣本；樣品前處理時，打開鼻咽部分分泌物,腦脊液,糞便標本等感染性樣品包裝的動作過猛，會造成樣品側翻；對食品等固形物樣品進行剪切時，操作不慎發(fā)生手剪傷，均質器均質樣本時發(fā)生均質袋破裂；離心操作時發(fā)生離心管破裂等意外情況。風險控制措施樣品接收必須在專用的區(qū)域進行，合同評審人員和收樣人員嚴格按照《樣品管理程序》(XJK/CX32)要求交接樣品，不得擅自打開樣品包裝，收樣后及時洗手。開始檢測前，對盛裝感染性材料樣品的容器，必須在生物安全柜中緩慢打開，食品和水樣必須在潔凈工作室內打開，開啟的容器管口不能對著操作者。對食品等固形無樣品取樣，要小心使用剪刀和鑷子，盡可能剪取食物的可食部分，以防止樣品均質時堅硬物質刺破均質袋，從而造成樣液濺灑。對含有感染性的樣品進行離心振蕩時，必須將離心蓋封嚴實，并關上離心機蓋。實驗室應配備應急藥箱，發(fā)生手剪傷等意外事件，應立即進行消毒包扎處理。當發(fā)生離心管或均質袋意外破裂、濺出時，及時對所有涉及污染的部位進行消毒處理，同時按《二級生物安全實驗室建設與管理》實驗室意外事故的處置章節(jié)處置。5．樣本檢測過程（1）主要實驗設備和器材培養(yǎng)箱、水浴箱、細菌鑒定和藥敏測試儀（ATB儀）、全自動快速致病菌檢測儀（miniVIDAS）、生物安全柜、振蕩器、吸管和試管、移液器及吸頭、接種環(huán)、培養(yǎng)皿等。（2）主要風險點識別 ①對食品、水樣、鼻咽部分分泌物、腦脊液、糞便標本等樣品進行單核細胞增生李斯特氏菌菌株分離鑒定、生化試驗、藥敏試驗等實驗活動均涉及活菌操作。在檢測過程中移液或混勻震蕩等操作可能釋放較大顆粒和小液滴，雖然單核細胞增生李斯特氏菌不通過呼吸道感染，但由于樣品可能含有其他未知的病原體，也不應忽視、②離心振蕩過程中容器的破損或滲漏等意外事故，都可能造成感染性物質污染操作者的手、操作臺面、物器表面及地面，從而污染實驗室環(huán)境和人員。實驗室人員通過皮膚接觸或粘膜接觸感染或者意外食入感染。③實驗過程中未正確操作銳器、玻璃實驗器材意外破碎等，造成人員割傷和刺傷而導致的接種感染隱患。品檢測時試管開啟、樣品轉移、稀釋混勻吹打、劃線分離、涂片染色、離心等操作都可產(chǎn)生氣溶膠，但單核細胞增生李斯特氏菌不通過吸入感染。實驗室人員通過氣溶膠感染單核細胞增生李斯特氏菌的風險非常小。風險控制措施開展檢測時檢測人員應按照二級生物安全防護要求做好自身防護措施，若接觸傳染性危險大的病原微生物，工作人員應戴雙層（兩副）手套以增加保護。進行食品、水樣等樣品制備、均質等操作，應在潔凈實驗室內進行；鼻咽部分分泌物、腦脊液、糞便標本、嘔吐物等所有具有感染性材料的操作必須在生物安全柜內進行，必須保證潔凈實驗室和生物安全柜處于正常運行狀態(tài)。實驗結束后對桌面、臺面及時進行消毒處理。進行活菌操作時，應在安全柜工作臺面上放置一塊浸有消毒液的紗布或吸有消毒液的紙，避免感染性物質的擴散；涉及高濃度或大體積的感染性材料離心操作時，應選用密封轉頭或帶安全罩的離心機離心。若有意外污染，應及時消毒、沖洗并檫干飛濺出的液體。實驗結束后必須對桌面、臺面及時進行消毒處理。必須使用移液器或吸球移取樣液，旋蓋和移液操作時動作要輕緩，所有吸管應用棉塞，移液頭盡可能使用帶濾芯的，以減少對移液器或吸球的污染。使用直徑2~3mm且完全封閉、手柄的長度小于6cm的接種環(huán)分離細菌，盡可能使用封閉式微型電加熱器消毒接種環(huán)，避免在酒精燈的命火上加熱而引起的感染性物質的爆濺。盡可能以塑料器皿代替玻璃器皿，若必須使用玻璃器皿，只能用實驗室級玻璃（硼硅酸鹽），且任何破碎或有裂紋的器皿都應丟棄。禁止用手直接接觸使用后的針頭、刀片、玻璃碎片等銳器。嚴禁用帶有注射針頭的注射器吸液，更不可當吸管用，用過的銳器應直接放入利器盒，經(jīng)消毒后廢棄。在任和可能導致潛在的傳染性物質濺出的操作過程中，應保護好面部、眼睛和嘴；發(fā)生液體濺出、溢出等事故或經(jīng)明顯暴露與傳染源時，應立即向科室負責人報告，及時處理并對事故的發(fā)生與處理做記錄，必要時進行適當?shù)尼t(yī)學評估、觀察、治療并保留書面記錄。菌株使用、保存和運輸主要實驗設備和器材接種針、菌株保存管、振蕩器、生物安全柜、95千帕樣品運輸罐、B類標本運輸箱（UN3373冷藏箱）和運輸車輛。主要風險點識別工作人員對陽性菌株保菌操作不規(guī)范、個人防護不到位、磁珠管等保存容器意外破損、磁珠掉落等會導致病原菌污染實驗室環(huán)境和實驗人員。單核細胞增生李斯特氏菌使用和保存未按照《菌（毒）種管理規(guī)程》（XJK/CX37）要求實施管理，存在菌株被惡意使用及污染環(huán)境等生物安全隱患。在單核細胞增生李斯特氏菌陽性菌株上送等運輸過程中如使用不合格包裝進行運輸，容器密封不嚴，或運輸工具無安全保障，可能導致運輸過程中包裝容器意外破損，存在病原體的擴散，甚至樣本丟失的隱患。風險控制措施單核細胞增生李斯特氏菌分離純化及保菌操作應在生物安全柜內進行，若發(fā)生磁珠管破損、磁珠掉落時，應立即對所涉及的器物進行消毒，并按《二級生物安全實驗室建設與管理》中“意外事故處理辦法章節(jié)規(guī)范”處置。單核細胞增生李斯特氏菌標準菌株的使用、保存嚴格按照《菌（毒）種管路規(guī)程》（XJK/CX37）要求進行操作，嚴格實行雙人雙鎖保管，嚴防菌株被惡意使用而造成的生物危害在單核細胞增生李斯特氏菌陽性菌株上送過程中嚴格執(zhí)行B類運輸包裝（同“樣品采集”），攜帶“可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸許可證”，由專車運送，由專業(yè)人員全程護送。7.實驗室的清潔和消毒主要實驗設備和器材70%~75%的酒精、施康清洗消毒液I。主要風險點識別工作完畢后，若不及時對工作臺面、地面和生物安全柜進行消毒，則有可能會對下次的操作人員造成污染或感染。風險控制措施工作完畢后，及時對檢測所涉及的工作臺面、地面和生物安全柜進行消毒，使用稀釋100倍的施康清洗液毒液I擦拭，用消毒液清潔后要干燥20min以上。生物安全柜用70%~75%的酒精擦拭消毒。待實驗和消毒完畢，先脫去手套，在脫去防護服，并正確用肥皂和流水洗手。8.廢棄物處置主要實驗設備和器材醫(yī)療廢棄物專用袋、耐高壓且防滲漏的垃圾桶、高壓滅菌器。主要風險點識別樣品采集和實驗檢測過程產(chǎn)生的感染性廢棄物（食品、水樣等剩余樣品；血液血清及排泄物標本；病原菌的培養(yǎng)基、標本和菌種、毒種保存液及所有實驗過程涉及的用品）釋放前未按照規(guī)范要求處理，導致感染或致病因子外泄而污染環(huán)境。樣品采集和實驗檢測過程產(chǎn)生的被污染的損傷性廢棄物（一次性使用采血用具、載玻片、玻璃試管、玻璃安瓿、培養(yǎng)皿等）未按照規(guī)范處理，存在意外刺傷或劃傷工作人員的隱患。風險控制措施實驗室廢棄物處理應遵循《醫(yī)療廢棄物管理條例》》醫(yī)療衛(wèi)生機構醫(yī)療廢物管理辦法》《醫(yī)療廢物專用包裝袋、容器和警示標志標準》等相關法規(guī)要求，分類收集，規(guī)范處置。所有損傷性廢棄物必須放置于有警示標識的硬質、防漏、防銳器刺破的專用利器盒中；所有感染性廢棄物必須放置于有警示標識的醫(yī)療廢物專用包裝袋中；使用高效消毒液浸泡或高溫高壓滅菌后集中處理，集中存放至中心指定的醫(yī)療廢棄室，由有資質的醫(yī)療廢棄物處理單位上門收集、集中處置。同時，做好廢棄物處理交接記錄，所有相關記錄應定期整理歸檔。（三）實驗過程中其他風險識別和控制1.電力（1）主要風險點識別單核細胞增生李斯特氏菌的分離和鑒定對溫度有明確要求，當實驗過程中突然間隙斷電或電力供應不穩(wěn)定對檢測結果的準確性帶來一定的影響。實驗室沒有布置雙路供電或者相關儀器未配備不間斷電源，當電力供應發(fā)生故障時，可導致設備突然停止工作，實驗活動被迫終止等所帶來的相關安全風險。（2）預防控制措施盡可能在實驗室布置雙路供電，若客觀條件受限制，對單核細胞增生李斯特氏菌檢測所用的關鍵儀器需配備不間斷電源。2.電氣操作（1）主要風險點識別實驗室活動涉及的電氣操作，包括實驗室工作區(qū)內電氣設備的啟動、關閉、安裝和維修；設備層內UPS、空調機組等電器設備的啟動、關閉和維修等。這些電氣操作的過程可能產(chǎn)生觸電、電擊、造成電氣故障等風險。（2）預防控制措施①電氣設備的設計及制造符合相關安全標準的要求。實驗室工作區(qū)內若有380V電源插座，則需明確標識，并由有資質的專業(yè)人員進行操作。②新的、改裝過的或修理過的電氣設備在未經(jīng)專業(yè)人員（如有資質的電工）完成電氣安全測試和設備符合安全使用要求前，不允許使用。③電氣設備使用人員接受正確操作的培訓，操作方式不降低電氣安全性。電氣設備使用人員要定期檢查設備可能引起電氣故障的破損。只有專業(yè)人員才可從事電氣設備和電路工作。禁止未經(jīng)授權的工作。采取措施對設備去污染，以降低維護人員感染的風險。3.實驗室給排水設施設備（1）主要風險點識別實驗室含有給排水的設施設備，包括位于工作區(qū)和洗消區(qū)的高壓滅菌器和洗滌池。水管道意外破裂、排水管道阻塞降低可能導致感染性材料溢出，有污染實驗人員和環(huán)境的風險。（2）預防控制措施實驗室產(chǎn)生的所有染菌物及器具，必須先經(jīng)高壓滅菌或含氯消毒劑浸泡消毒后洗滌，洗消產(chǎn)生的污水集中排入中心污水池進行消毒處理，嚴禁直接排放。按照GB18466要求，檢測總余氯、糞大腸菌群和其他致病菌。4.實驗室設施設備管道（1）主要風險點識別實驗室設施設備管道穿越維護結構的部位可能存在密封不嚴的問題，當感染性材料溢出時，有污染環(huán)境的風險。（2）預防控制措施所有管道穿越維護結構的部位應嚴格密封，定期進行檢查檢測，避免感染性材料外溢從而污染環(huán)境。5.檢測儀器設備（1）細菌鑒定和藥敏測試儀（ATB儀）、全自動快速致病菌檢測儀（miniVIDAS）、顯微鏡、核酸提取儀、PCR儀、凝膠成像儀等設備①主要風險點識別對可疑單核細胞增生李斯特氏菌鑒定時要用到ATB儀、miniVIDAS核酸提取儀等設備，在使用這些設備時如果不按操作規(guī)程進行，則會導致病原體濺出、滲漏而污染實驗環(huán)境。②預防控制措施嚴格按ATB儀、miniVIDAS等設備操作規(guī)程操作和維護，每次使用完畢后對設備箱體及可能污染的實驗環(huán)境進行消毒。（2）離心機①主要風險點識別在分離血清、濃縮菌液等檢測活動中會使用到離心機，離心過程中可能存在離心管破裂、離心管蓋脫落、離心轉子和離心腔被污染的風險。②預防控制措施離心時配備耐離心壓力的且?guī)菪苌w的離心管，離心前做好平衡，選擇正確的離心速度和離心力。規(guī)范正確操作，定期維護，確保離心機能正常，每次做好清潔消毒和使用記錄，定期進行功能檢查。6.生物安全設施設備（1）生物安全柜①主要風險點識別在進行單核細胞增生李斯特氏菌的大量活菌操作時，應在生物安全柜中進行，未對生物安全柜實施年度監(jiān)測，無法有效監(jiān)控奇防護效能；操作時未按照操作規(guī)程或使用說明書進行正確操作和維護，造成生物安全柜的氣溶膠防護效果明顯降低，甚至消失，失去安全防護作用；長時間使用或不及時更換HEPA過濾膜，會使其功能喪失，造成工作窗口氣流速度降低或流向紊亂；生物安全柜使用后未按要求進行徹底消毒處理，會造成使用和維護人員間接接觸污染。②預防控制措施正確選配生物安全柜，操作人員應接受相關的操作、維護培訓，日常操作和維護嚴格按照設備操作規(guī)程或使用說明書進行。每年請有檢測資質的服務機構對生物安全柜進行風速、氣流、塵埃粒子、紫外線強度等關鍵要素的檢測，實驗室定期進行空氣沉降菌檢測，確保其正常性能。一旦生物安全柜的使用造成污染，應及時進行消毒。（2）高壓滅菌器①主要風險點識別單核細胞增生李斯特氏菌檢測過程中，被病原菌污染的玻璃、耐高壓的實驗器材及實驗廢棄物要進行高壓滅菌消毒才可能被移出實驗室。在高壓消毒時，如果沒有按照高壓鍋的操作規(guī)程或使用說明書進行操作、維護，就可能使高壓滅菌器效果明顯降低，甚至失效，失去去污染與無害化的作用。若長時間使用有不定期檢測滅菌效果，則對其滅菌效果無從考證，可能產(chǎn)生功能缺損，存在滅菌不徹底從而引起污染的隱患；在長期關停期間，若內部水分不及時排干，將會使內部器件老化從而失去正常功能。②預防控制措施選擇下排式高壓滅菌器，防止氣溶膠污染，操作人員持證上崗，正確規(guī)范操作，定期維護，確保高壓滅菌器性能正常，做好使用記錄。對壓力滅菌器每次檢測化學指示物，監(jiān)控記錄溫度、壓力、時間等滅菌參數(shù)，每周進行生物監(jiān)測，以保證滅菌質量。（3）個人防護用品主要風險點識別單核細胞增生李斯特氏菌分類屬于第三類，危險程度為II級。進行單核細胞增生李斯特氏菌大量活菌操作時，個人防護如未采取二級生物安全防護水平，儀造成實驗人員感染；個人防護用品若穿戴不規(guī)范、大小不合適或使用過期的防護用品等，將會導致防護效果失效或降低。預防控制措施進行單核細胞增生李斯特氏菌大量活菌操作時個人防護采取二級生物安全防護水平，選擇大小合適、有效的防護用品。應急救治設施和用品主要風險點識別實驗室若沒有配備洗眼器、應急藥箱等必要的應急設施和物品，或配備的應急用品種類不全、不合適或過期，則導致急用時無法發(fā)揮作用。預防控制措施在實驗室內配備洗眼器，確保功能正常。配備的75%乙醇、碘附或其他消毒劑、創(chuàng)可貼等急救物品與實驗活動相適應并在有效期內使用，由專人負責管理，定期維護、清理和更新。消毒滅菌劑主要風險點識別消毒劑產(chǎn)品無生產(chǎn)許可證、過期、配制方法或濃度不正確、種類選擇不合理，將會導致消毒效果降低、生物滅活能力降低或對物品腐蝕性增加、對皮膚造成刺激等問題。預防控制措施選擇符合國家標準的正規(guī)廠家生產(chǎn)的產(chǎn)品，選擇合適的消毒劑，按照規(guī)定的消毒方法、消毒時間、消毒濃度（劑量）進行消毒，避免使用過期產(chǎn)品；消毒過程中消毒人員應做好必要的個體防護，防止發(fā)生意外。根據(jù)單核細胞增生李斯特氏菌特點，選用70%~75%酒精和稀釋10~25倍、50~100倍、200倍的施康消毒劑I（主要成分為次氯酸鈉）作為實驗室常用消毒劑。7.管理體系的風險（1）主要風險點識別管理體系（包括應急預案）是否健全和完善，是否符合實際管理要求，程序文件、作業(yè)指導書和操作規(guī)范是否科學和具有可操作性，是能否確保生物安全的主要因素。如果組織結構不健全、設置不合理，體系文件與實際工作不匹配，以及部門職責不清或銜接不當?shù)?，就都可能帶來安全風險。（2）預防控制措施定期開展對管理體系的評審，發(fā)現(xiàn)問題及時修訂和完善，以確保生物安全管理體系持續(xù)有效運行。（四）工作人員的風險評估與預防控制措施1.人員數(shù)量和素質（1）人員數(shù)量①主要風險點識別人員過少會缺少相互提示監(jiān)督或因工作量增大而導致操作過程中工作失誤增加，風險增加。②預防控制措施采樣和檢測人員的數(shù)量應與工作量相匹配，盡量有2名工作人員同時進行采樣和檢測工作。（2）人員結構①主要風險點識別實驗室檢測人員的結構與資質、職稱分布不合理，新進人員若沒有高資歷人員帶教操作，就不能很好地處理意外事件，風險增加。實驗人員不熟悉實驗檢測方法及操作規(guī)范，在進行實驗前為進行相關的專業(yè)知識培訓，無法保證工作質量和安全。②防控制措施實驗室檢測人員的年齡和資質結構應配備合理，新進人員應由高資歷人員帶教或監(jiān)督操作。（3）職業(yè)操守主要風險點識別單核細胞增生李斯特氏菌檢測存在一定的生物安全風險，若政治思想素質不高、責任心不強的人員參與該項工作，則產(chǎn)生生物危害而危及人員安全、環(huán)境安全與社會安定的可能性較大。預防控制措施加強職業(yè)道德教育，培養(yǎng)工作責任心。2.健康管理（1）主要風險點識別健康狀況主要包括生理、心理素質與免疫狀態(tài)。若實驗室檢測相關人員出現(xiàn)呼吸道或者消化道感染癥狀、機體免疫力低下等其他不合適工作的狀況，職業(yè)暴露風險增加。（2）預防控制措施建立健康申報制度，遇有呼吸道或者消化道感染及其他不合適工作的情況時，應及時向科室負責人報告并暫停工作；若接觸物的傳染性大，應加強防護。3.人員資質（1）主要風險點識別檢測人員不具備衛(wèi)生檢測相關學歷教育背景，不熟悉檢測方法及操作規(guī)范，未執(zhí)行相關的專業(yè)知識培訓和考核并未獲得上崗證，無法保證工作質量和安全。（2）預防控制措施檢測人員必須是檢驗或相關專業(yè)畢業(yè)，經(jīng)過上崗證培訓、考核合格和持證上崗。4.生物安全培訓要求（1）主要風險點識別檢測人員、輔助人員、后勤保障人員、進修實習人員上崗前沒有接受嚴格的生物安全，以及相關生物安全設備操作的技術培訓，易造成生物安全事故的發(fā)生。（2）預防控制措施檢測人員、輔助人員、后勤保障人員每年參加本中心組織的生物安全知識或生物安全操作技術培訓、考核。上崗前熟練掌握生物安全儀器設備、設施操作技術，，具備相關的安全防護能力。進修實習人員參與實驗活動前必須進行生物安全知識的培訓，在帶教老師的監(jiān)督下工作。5.應急事件處理能力（1）主要風險點識別實驗室人員上崗前沒有接受實驗室意外事故處理、職業(yè)暴露后預防等突發(fā)事件處置的培訓，一旦發(fā)生意外事件，就不能有效地進行早期處理和控制生物安全事件。（2）預防控制措施實驗室工作人員必須嚴格按照《實驗室意外事故和職業(yè)性疾病報告制度》和《病原微生物生物安全應急處置技術方案》中規(guī)定的要求進行應急事件的處置，強化職業(yè)暴露的應急處理能力。（五）實驗室非常規(guī)活動中的風險評估與預防控制措施1.主要的實驗室非常規(guī)活動（1）實驗室外專業(yè)人員對實驗室設施設備的維護、維修、檢定、校準、檢測驗證（如主要設施設備的檢測驗證）和更換（如高效過濾器等的更換）等。（2）實驗室后勤保障人員對實驗室及公共環(huán)境的保潔、實驗器材的清洗消毒。（3）實驗室外人員參觀實驗室和上級部門對實驗室的檢查。（4）任何其他人員需要進入實驗室從事實驗活動外的行為（如發(fā)生水災時消防人員、急救人員的進入）。2.主要風險點識別（1）上述人員進入實驗室從事相關活動，特別是不慎打翻、打破標本管或損壞儀器零部件等情況，可能會引起實驗室感染。（2）實驗室運行過程中某些人員需要進入實驗室參觀，存在影響實驗活動正常運行或者導致相關或不相關的設施設備損壞的風險。3.預防控制措施（1）實行人員準入、等級制度。進修實習人員進入實驗室從事檢測活動前，必須先進行生物安全和實驗室規(guī)章制度的培訓。若中心實驗室外專業(yè)人員和實驗室后勤保障人員確實需要進入實驗室進行相關活動，或上級部門需要進入實驗室進行檢查，應由中心實驗室人員協(xié)助和陪同。（2）實驗室外專業(yè)人員和實驗室后勤保障人員必須要有相應的專業(yè)知識，應對其進行生物安全培訓，提供安全指南，實驗室人員應協(xié)助、指導和規(guī)范進入人員在實驗室內的活動并對其安全行為進行監(jiān)督，進入人員必須遵守實驗室的各項管路規(guī)定，以確保人員和環(huán)境安全。（3）進入人員未經(jīng)許可絕對不能私自動用實驗室內有標志的危險品（除非經(jīng)過授權），絕不能將未經(jīng)消毒處理的物品拿出實驗區(qū)。（4）在生物安全全實驗室進行設施、設備維護維修過程中，若發(fā)生意外事故，應立即報告實驗室負責人。實驗室負責人根據(jù)造成的事故進行風險評估，采取應對措施。（5）當需要更換HEPA過濾膜或高效過濾器時，應先對高效過濾器、HEPA過濾膜等作原位消毒后，專業(yè)人員才能進行更換。（6）為確保自己和他人的安全，禁止未穿防護服的人員隨意進出實驗室的防護區(qū)域。同時也禁止穿防護服的人員走出實驗室的防護區(qū)域。（7）對實驗室的設施、設備進行維護工作時動作輕柔，避免產(chǎn)生氣溶膠。（8）離開實驗室前，必須正確洗手。（六）被誤用和惡意使用的風險與預防控制措施1.主要風險點識別陽性標本未明確標識并未嚴格實施雙人雙鎖管理，實驗活動結束后不及時對操作場所進行消毒，工作人員在不知情的情況下可能誤用標本、實驗材料和設施設備等，導致人員感染和實驗室環(huán)境污染、人員受傷或設施設備損壞等事故。2.預防控制措施（1）實行嚴格的人員準入和執(zhí)證上崗制度。（2）所有獲得批準進入實驗室工作的人員，必須嚴格按照規(guī)程操作實驗材料和設施設備，以及其他一切實驗活動，不得私自動用實驗室內任何不熟悉物品。（3）發(fā)生事故時必須及時報告并作必要的處理和記錄。（4）實驗所用材料和試劑等必須有明確標識。（5）陽性標本嚴格實施雙人雙鎖管理，上送的陽性標本必須經(jīng)中心蓋章批準，攜帶“可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸許可證”，由專車運送，并由專業(yè)人員全程護送。（七）相關實驗室已發(fā)生的事故分析和從中得到的啟示目前尚未有明確因單核細胞增生李斯特氏菌檢測導致實驗室人員感染的相關報道，但仍然存在實驗室人員進行采樣檢驗、廢棄物處置等工作過程中，個人防護不到位而導致感染的風險。因此要嚴格遵守實驗室相關規(guī)定，防止職業(yè)暴露風險。三、實驗室理化因素風險評估劑安全防護措施紫外線主要風險點識別二級生物安全實驗室、潔凈實驗室內傳遞窗、生物安全柜均使用紫外線燈進行物體表面消毒。紫外線波長為250~280nm，主要影響眼睛和皮膚，引起急性角膜炎和結膜炎、慢性白內障等眼疾病，還可誘發(fā)皮膚癌。紫外燈開啟時，人員在不知情的情況下進入可受傷害。安全防護措施在實驗室工作應避免紫外線直接照射人體，特別是眼部。生物安全柜表面應張貼紫外線危害的標識，提醒實驗人員小心紫外線危害。在進行紫外線消毒時，實驗人員盡量遠離消毒區(qū)域，基本可以規(guī)避紫外線對人體的危害。輻射主要風險點識別實驗室籌建選址時未對周圍輻射源進行排查，使用含輻射的儀器未嚴格管理，存在輻射源或輻射事故間接導致病原微生物屏障系統(tǒng)破壞的隱患。安全防護措施實驗室籌建選址時對周邊建筑群嚴格排查輻射源，實驗室不使用有輻射源的儀器設備，輻射造成的風險基本不予考慮。施康清洗消毒劑I主要風險點識別施康清洗消毒劑I屬于含氯消毒劑，有效氯的含量為4.55%~5.55%，次氯酸鈉為主要殺菌因子。含氯的消毒液會殘留在空氣中不揮發(fā)，長期使用會使人感到頭疼、惡心，刺激黏膜，對于有體質過敏的人，還容易引發(fā)過敏、哮喘疾病等。高濃度的含氯消毒劑對人的呼吸道黏膜和皮膚有明顯的刺激作用，可使人流淚、咳嗽，并刺激皮膚和黏膜，嚴重者可發(fā)生氯氣中毒。急性中毒者出現(xiàn)躁動、惡心、嘔吐、呼吸困難等癥狀，甚至因窒息而死。安全防護措施按照使用說明，根據(jù)消毒對象不同而配制不同的稀釋倍數(shù)，避免使用不必要的高濃度的消毒劑，稀釋和使用時戴好手套，消毒后可及時開窗通風，基本可規(guī)避消毒液對人體的危害。其他主要風險點識別實驗室內的照明和聲音（生物安全柜等）有可能因強光和噪聲對人員造成損害。安全防護措施對實驗室的照明和聲音等參數(shù)進行檢測，確保合格，避免強光和噪聲對人員的損害。四、實驗室火災風險評估與預防控制措施主要風險點識別超負荷用電，電線過長。電器和電源老化、電器保養(yǎng)不良，列如電纜的絕緣層破舊或損壞。用火不當?shù)纫l(fā)火災。儀器設備在不使用時未關閉電源。(5)使用的儀器設備不是專為實驗室環(huán)境設計。易燃、易爆品處理、保存不當。不相容化學品沒有正確隔離。在易燃物品和蒸汽附近有能產(chǎn)生火花的設備。(9)通風系統(tǒng)不當或不充分。預防控制措施實驗室采取以下預防控制措施以避免火災發(fā)生，保證發(fā)生火災后能夠安全撤離實驗室。定期檢查電器插座、電線絕緣層是否完好，保證用電負荷，對易燃、易爆等危險品進行有效區(qū)域隔離。(2)實驗室配備滅火器。放置在易取的地點，擺放部位張貼滅火器標識。改滅火器用于撲滅可控制的火災，幫助人員撤離火場；對滅火器進行定期檢查和維護，確保其有效使用。(3)實驗室需裝設應急燈，所有出口都有黑暗中可見的“緊急出口”標識；當出現(xiàn)緊急狀況時，實驗室所有出口的鎖必須處開啟狀態(tài)，出口設計應保證在經(jīng)過高危險區(qū)域就能逃脫，所有出口都能通向一個開放空間。(4)走廊、流通區(qū)域不得放置障礙物，不受人員流動和滅火設備移動的影響。在實驗室工作區(qū)顯著位置張貼火警電話標識。實驗室每年對工作人員進行消防知識培訓，包括消防器材的使用、火災發(fā)生時的應急行動等。五、自然災害風險評估與安全防護措施自然災害可能導致的實驗室緊急狀況主要包括水災和地震等。水災風險點識別水災可能導致實驗室維護結構和設施損壞，實驗室內感染性材料隨水外溢。安全防護措施在安全手冊中制訂《實驗室緊急事件應急預案》，并對所有實驗室人員進行培訓。實驗室一旦發(fā)生水災報警時，應立即停止工作。首先，考慮實驗室內感染性物質和人員的轉移。實驗室負責人、中心主任根據(jù)條件及時采取對策，第一時間聯(lián)系相關消防人員。消防人員應有防護措施，并在受過訓練的實驗室工作人員陪同下，進入實驗室完成菌毒種和人員的安全轉移工作。地震風險點識別發(fā)生地震等自然災害會導致實驗室維護結構和設施損壞，存在人員受傷和實驗室感染性材料外溢的風險。安全防護措施實驗室應采取措施降低自然災害帶來的風險，保證發(fā)生后能夠安全撤離實驗室，減少對人員和環(huán)境的影響。發(fā)生地震后，首先設立距實驗室維護結構20m范圍內的封鎖區(qū)。其次，對封鎖區(qū)進行消毒，然后由專業(yè)人員在做好個人防護的前提下對實驗內部環(huán)境邊消毒邊清理，清理到樣品保存地點。如果保藏樣品的容器沒有被破壞，可把它安全轉移到其他安全的實驗室存放。如果保藏樣品的容器已有破壞和發(fā)生外溢，則應立即用可靠方法進行徹底消毒滅菌。六、生物安全及其他緊急事件（事故）處理預案（一）實驗室生物安全事件（事故）處理措施（1）當生物安全柜或潔凈實驗室出現(xiàn)持續(xù)正壓時，室內人員應立即停止操作，通知運行保障人員采取措施恢復負壓。如果不能及時恢復和保持負壓，應停止實驗，按規(guī)程退出。發(fā)生此類事故或發(fā)生意外停電，造成具有傳染性物質暴露潛在危險的事故和污染時，工作人員除了采取緊急措施外，還應立即報告實驗室安全負責人，組織對實驗室進行終末消毒。（二）其他緊急事件（事故）處理措施在制訂的應急預案中應包括消防人員和其他緊急救助人員。應事先告知他們哪些實驗室有潛在的感染性物質，讓他們熟悉實驗室的布局和設備。實驗室人員要熟悉緊急撤離的情況及緊急撤離的路線標識，在實驗室發(fā)生不可控制的火災、水災、爆炸或其他危險情況時，為確保工作人員的安全，要進行緊急撤離。所有實驗室人員需了解緊急撤離的行動計劃、撤離路線和緊急撤離的集合地點，每年至少參加一次緊急撤離演習，包括急救設備使用和采取相應急救措施。生物安全及其他緊急事件（事故）報告和記錄發(fā)生生物安全及其他緊急事件時，在緊急處理的同時必須向中心主管領導和生物安全委員會報告。對于生物安全事件必須進行登記，記錄發(fā)生的時間、地點、詳細經(jīng)過及處理方法等。七、生物安全和生物安全保障風險管理（一）生物安全風險評估依據(jù)標準風險評估所依據(jù)的數(shù)據(jù)及擬采取的風險控制措施、安全操作規(guī)程等均應以國家衛(wèi)生和計劃生育委員會、世界衛(wèi)生組織、國際標準化組織等機構或行業(yè)權威發(fā)布的指南、標準等為依據(jù)。（二）危險發(fā)生的概率評估（見表7-5）表7-5單核細胞增生李斯特氏菌實驗活動危險發(fā)生的概率評估序號潛在危險因素危害程度發(fā)生概率固有風險措施合理性殘留風險風險可控程度1樣品運輸過程中容器意外側翻、泄露、破裂造成污染中度可能中度合理低風險可控2樣品的接收、開啟及加樣等常規(guī)實驗活動中產(chǎn)生的氣溶膠中度較大可能中度合理低風險可控3離心、加樣等實驗活動中意外事故造成盛裝標本容器破裂、溢出瞬間產(chǎn)生的氣溶膠中度可能中度合理低風險可控4檢測未經(jīng)滅活的樣品對儀器與環(huán)境造成的污染中度較大可能中度合理低風險可控5標本、實驗材料、設施設備等被誤用的風險中度可能中度合理低風險可控6陽性標本被惡意使用的風險高度較小可能高度合理低風險可控7實驗器材未經(jīng)規(guī)范消毒造成污染中度可能中度合理低風險可控8廢棄物處理不當造成病原微生物擴散中度較大可能中度合理低風險可控9滅菌裝置不符合要求，滅菌不徹底造成污染中度較小可能中度合理低風險可控10檢測人員和工勤人員被銳器誤傷造成職業(yè)暴露高度可能高度合理低風險可控11檢測人員個人防護不當造成的病原微生物擴散中度可能中度合理低風險可控12非檢測人員、進修實習等外來人員進入實驗室的不當操作中度可能中度合理低風險可控13水、電、火災及自然災害造成的風險中度較小可能中度合理低風險不可控（三）風險評估人員風險評估由中心主任組織檢驗科、質量管理科和熟悉單核細胞增生李斯特氏菌檢驗相關風險的專業(yè)人員進行風險評估并形成風險評估