分子生物學診斷技術概述

分子生物學診斷技術概述（中國器審2024年07月18日）檢驗醫(yī)學是醫(yī)學的重要組成部分，為臨床對疾病預防、診斷、治療和預后判斷等提供重要信息。隨著醫(yī)學技術和醫(yī)療設備的不斷發(fā)展，分子診斷學技術在檢驗醫(yī)學中的應用越來越廣泛。分子診斷學是利用分子生物學理論、技術和方法來研究人體內(nèi)源性或外源性生物大分子及其體系的存在與否及其結構或表達調(diào)控的變化，為疾病的預防、預測、診斷、治療和轉歸提供信息和決策依據(jù)，從而為個體化醫(yī)療提供數(shù)據(jù)支持。經(jīng)過多年的發(fā)展，分子診斷學技術主要分為分子雜交技術、PCR技術、以及基因測序技術等。由于分子診斷學技術在疾病診斷方面有快速、準確的優(yōu)點，其在檢驗醫(yī)學中具有重要地位。一、基于核酸分子雜交技術的檢測技術核酸分子雜交技術是指不同來源的2條核酸單鏈，在一定條件下，按照堿基互補配對原則形成雙鏈的技術，主要包括熒光原位雜交技術(fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH)、菌落原位雜交技術、Northern印跡法、斑點雜交技術、芯片雜交技術、Southern印跡法等。其中，F(xiàn)ISH技術指在人體的染色體?組織或者細胞上，將熒光素標記的探針按照堿基互補配對原則，使得靶基因得以顯示。FISH技術自問世以來，被迅速應用于檢測各種類型的細胞遺傳學的改變，包括染色體拷貝數(shù)異常、復制、擴增、缺失、倒位和易位等。同時，它也是臨床疾病診斷的重要手段，如腫瘤檢測、對染色體非整倍性異常引起的不孕不育檢測等。美國醫(yī)學遺傳學學會于1993年發(fā)布了應用FISH進行產(chǎn)前診斷的相關說明，F(xiàn)ISH技術在我國也應用于臨床多年，主要應用于癌癥輔助診斷、產(chǎn)前診斷等領域等。FISH技術在產(chǎn)前診斷領域作為核型分析技術的補充已成為專家共識?，F(xiàn)批準上市產(chǎn)品有HER-2基因擴增檢測試劑盒、ALK基因重排檢測試劑盒、PML/RARα融合基因檢測試劑盒、13/16/18/21/22/X/Y染色體數(shù)目檢測試劑盒等。基因芯片是利用原位合成或者顯微點樣技術，將很多DNA探針按照順序固定在支持物的表面，然后與進行標記的樣本進行雜交，并且將雜交后獲取的信號進行分析，從而能夠獲得樣品的基因排列順序和基因表達等信息。根據(jù)不同的基因芯片制作方法，基因芯片可以被分為兩大類，一類是原位合成的芯片，另一類是DNA微陣列。根據(jù)基因芯片上探針的種類的不同，基因芯片還可以稱作是寡核苷酸芯片?cDNA芯片?DNA芯片等。具有高密度特性的寡核苷酸芯片，主要采用的方法就是原位合成，具有低密度特性的芯片采用的是點樣方法，而cDNA芯片和DNA芯片只能采用點樣的方法制成。由于基因芯片技術具有自動化程度高?操作簡單?通量高等特點，在基因分型?基因表達?單核苷酸多態(tài)性檢測等方面均有廣泛應用?，F(xiàn)批準上市產(chǎn)品有葡萄糖6磷酸脫氫酶基因突變檢測試劑盒(基因芯片法)、人乳頭瘤病毒分型檢測試劑盒（基因芯片法）、人乳頭瘤病毒（20個型）基因分型檢測試劑盒（PCR-電化學基因芯片法）、電化學基因芯片檢測儀等。二、基于PCR技術的檢測技術聚合酶鏈式反應(PolymeraseChainReaction，PCR)，是以DNA半保留復制機制為基礎，發(fā)展出的體外酶促合成、擴增特定核酸片段的一種方法，包括變性-退火-延伸三個基本反應步驟。PCR技術由于具有速度快?操作方便?靈敏度高?標本要求低以及特異性高等特點，在食品檢驗?醫(yī)學?農(nóng)學等領域均得到廣泛應用。隨著技術的發(fā)展，除常規(guī)聚合酶鏈反應技術外，PCR技術已經(jīng)衍生出很多不同的細分技術，例如實時熒光定量PCR(real-timequantitativepolymerasechainreaction，qPCR)、逆轉錄PCR（ReversetranscriptionPCR（RT-PCR）、逆轉錄實時熒光定量PCR（Real-timequantitativeRT-PCR，real-timeRT-PCR（或RT-qPCR））、數(shù)字PCR(digitalPCR，dPCR)、多重PCR（MultiplexPolymeraseChainReaction，mPCR）也稱復合PCR、反向PCR（Inverse-PCR）等；恒溫擴增的技術還可以細分很多如LAMP、RPA、RCA、CPA、SDA和HDA。按照PCR技術的演進，人們習慣性的將PCR技術劃分為三代：普通PCR技術，實時熒光定量PCR技術（qPCR）和數(shù)字PCR技術（dPCR）。普通PCR技術是經(jīng)典方法，國際和國內(nèi)標準齊全；儀器試劑成本較低，用于定性分析；qPCR技術具有方法成熟，配套儀器試劑齊全，試劑成本中等，操作簡單，檢測敏感性高，特異性高，可實現(xiàn)半定量檢測；dPCR技術可以實現(xiàn)絕對定量，具有更高的敏感性和特異性，可以檢測低拷貝樣品，但dPCR技術所用到的儀器設備和試劑昂貴，操作復雜，檢測時間長。目前三代的PCR技術各有各的優(yōu)缺點，也各有各的應用領域，并不是一代取代一代的關系。技術的不斷進步給PCR技術注入了新的活力，使其能解鎖一個又一個的應用方向，使核酸檢測更方便、更準確。PCR技術在臨床檢測中主要用于癌基因的檢測和診斷及用藥指導、致病病原體的檢測、遺傳病的產(chǎn)前診斷等方面。PCR技術在臨床檢測中被廣泛應用，技術擴展性強?，F(xiàn)批準上市產(chǎn)品有人乳頭瘤病毒(HPV)核酸檢測及基因分型試劑盒（PCR毛細電泳片段分析法）、人SHOX2、RASSF1A基因甲基化DNA檢測試劑盒(PCR熒光法)、α-地中海貧血基因檢測試劑盒（Gap-PCR法）、耳聾易感基因檢測試劑盒（PCR+導流雜交法）、KRAS基因突變檢測試劑盒(TaqMan熔解曲線熒光PCR法)、人Y染色體AZF區(qū)微缺失核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）、淋球菌/沙眼衣原體/解脲脲原體檢測試劑盒（PCR+膜雜交法）、淋球菌/沙眼衣原體/解脲脲原體檢測試劑盒（PCR+膜雜交法）、MTHFRC677T基因檢測試劑盒（PCR-金磁微粒層析法）、人類EGFR突變基因檢測試劑盒（多重熒光PCR法）、BMPR1A/PLAC8基因甲基化檢測試劑盒（數(shù)字PCR法）等。三、基于基因測序技術的檢測技術基因測序就是通過各種測序技術把基因的序列測出來，進而通過生物信息學分析對這些不同的序列進行解讀，1977年由Sanger發(fā)明的DNA雙脫氧鏈末端終止測序法，也被稱作“Sanger法”，這就是第一代基因測序技術，早在2001年完成的人類基因組框圖，采用的就是該方法。該技術直到現(xiàn)在依然被廣泛使用，但是其一次只能獲得一條長度在700～1000個堿基的序列，無法滿足現(xiàn)代科學發(fā)展對生物基因序列獲取的迫切需求。經(jīng)過不斷的技術開發(fā)和改進，以Roche公司的454技術、illumina公司的Solexa和Hiseq技術及ABI公司的Solid技術為標記的第二代測序技術誕生了。第二代測序技術也稱高通量測序(high-throughputsequencing，HTS)技術，也被稱為新一代測序(NextGenerationSequencing,NGS)，是臨床檢測的主力軍，相對于一代測序，它可以實現(xiàn)大規(guī)模平行測序，其具備檢測用時短?靈敏度高?通量高?經(jīng)濟等諸多優(yōu)勢，極大地推動了分子診斷在臨床檢測方面的應用，也推進了基因組學的發(fā)展。第三代測序技術主要是以單分子測序及納米孔測序為代表，如牛津大學的納米測序技術(OxfordNanopore'snanoporesequencing)，PacificBiosciences公司的單分子實時技術(Singlemoleculerealtime,SMRT)等。與前兩代相比，第三代測序技術的最大特點就是單分子測序，測序過程無需進行PCR擴增。目前，臨床用第二代測序技術（NGS）已經(jīng)商業(yè)化，并逐漸走向成熟，國內(nèi)外許多公司正積極開發(fā)和商業(yè)化更多臨床實驗室的應用產(chǎn)品。NGS在臨床應用中的儀器設備復雜，檢測試劑需要根據(jù)不同檢測方法配制，操作技術難度較大，對操作人員技術能力要求高，對結果解釋的臨床水平要求也非常高。第三代測序較第二代測序將讀長提升了萬倍，需克服錯誤率、成本及樣本要求較高以及算法、軟件、數(shù)據(jù)庫等配套的技術問題。第一代基因測序技術因成本高?通量低而限制了其在臨床方面的應用，但由于它的準確率極高，因而被認為是基因測序的“金標準”。未來基因測序技術發(fā)展方向：更快的序列獲取速度；更準確的堿基識別方式；更長的單條測序序列長度；更輕便的測序儀器平臺；更簡便的操作過程；更便宜的測序價格?；驕y序技術是先對基因采取片段化的方式，并在此基礎上構建基因文庫，然后將基因文庫和載體相交聯(lián)，與此同時使其擴增，實現(xiàn)在載體上合成的同時，能夠對數(shù)量龐大的數(shù)據(jù)進行測序。基因測序技術近年來發(fā)展很快，應用日益廣泛，在臨床上主要應用于尋找疾病的候選基因，可用于單基因病、復雜疾?。ㄈ缣悄虿　⒎逝职Y等）甚至癌癥致病基因或易感基因的尋找。同時，極大地促進了胎兒游離DNA的實驗室研究和無創(chuàng)性產(chǎn)前基因診斷的發(fā)展?，F(xiàn)批準上市的產(chǎn)品有：人類9基因突變聯(lián)合檢測試劑盒（可逆末端終止測序法）、呼吸道病原體核酸檢測試劑盒（可逆末端終止測序法）、染色體非整倍體檢測試劑盒（聯(lián)合探針錨定聚合測序法）、基因測序儀等。四、基于核酸質譜技術的檢測技術20世紀80年代出現(xiàn)的基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOFMS)打破了以往質譜僅可進行小分子物質分析的傳統(tǒng)，使得核酸、蛋白質等生物大分子也可應用質譜進行研究，極大推進了基因組學、蛋白質組學的發(fā)展，并且給生物領域及醫(yī)學領域帶來了革命性的突破。核酸質譜，顧名思義是一種能檢測核酸的質譜技術，它是基于MALDI-TOFMS質譜發(fā)展起來的一種多重PCR分析檢測系統(tǒng)。質譜儀的核心構成部分主要包括進樣系統(tǒng)、離子源、質量分析器與檢測器。質譜儀器平臺雖然種類眾多，但可以通過樣品進樣方式、離子源、質量分析器等方面進行簡易分類。質譜技術的基本原理是通過樣品離子化，產(chǎn)生不同質荷比的離子，然后再經(jīng)過質量分析器測定該樣品中不同種類離子的分子量，并按照從小到大的順序依次排列從而得到一幅質量圖譜。由于核酸為極性、非易失性和熱不穩(wěn)定的生物大分子，且基于通量要求和樣品制備的難度，目前核酸質譜主要使用的質譜技術為基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（Matrix-AssistedLaserDesorption/IonzationTimeofFlightMassSpectrometry，MALDI-TOF-MS），其中MALDI為基質輔助激光解吸電離（matrix-assistedlaserdesorptionionization）的縮寫，是一種軟電離方式的離子源，給樣品能量較小，容易獲得能指明相對分子質量的準分子離子，基本不產(chǎn)生碎片峰；TOF-MS為飛行時間分析器（timeofflightanalyzer,TOFanalyzer）其作用為將離子源產(chǎn)生的離子按m/z順序分開并排列成譜。核酸質譜技術具有精準度高、特異性高、靈敏度高等特點，成本經(jīng)濟且高通量，可實現(xiàn)一次實驗檢測多個指標，既具有PCR技術的高敏感性、模板濃度要求低特點，又具備高分辨率和陣列技術的高通量等特點，且直接利用質譜峰值定性定量測定，無需化學發(fā)光、熒光法或其他任何二級標記方法，符合臨床應用上的通量和靈敏度的需求。核酸質譜適合于復雜的、多靶標疾病的分子診斷，可應用于藥物基因組學、病原體檢測等領域。核酸質譜的主要特點是：PCR擴增后的產(chǎn)物，加入SNP序列特異延伸引物，在SNP位點上，延伸1個堿基。然后將制備的樣品分析物與芯片基質共結晶，將該晶體放入質譜儀的真空管，而后用瞬時納秒(10-9s)強激光激發(fā)，由于基質分子經(jīng)輻射所吸收的能量，導致能量蓄積并迅速產(chǎn)熱，從而使基質晶體升華，核酸分子就會解吸附并轉變?yōu)閬喎€(wěn)態(tài)離子，產(chǎn)生的離子多為單電荷離子，這些單電荷離子在加速電場中獲得相同的動能，進而在一非電場漂移區(qū)內(nèi)按照其質荷比率加以分離，在真空小管中飛行到達檢測器。MALDI產(chǎn)生的離子常用飛行時間（Time-of-Flight，TOF）檢測器來檢測，離子質量越小，就越快到達。理論上講，只要飛行管長度足夠，TOF檢測器可檢測分子的質量數(shù)是沒有上限的。現(xiàn)批準上市的產(chǎn)品有：二十項遺傳性耳聾基因突變檢測試劑盒（飛行時間質譜法）、人CYP2C19基因分型檢測試劑盒(飛行時間質譜法)等。五、基于CRISPR-Cas的檢測技術CRISPR/Cas系統(tǒng)是細菌和古細菌的一種適應性免疫應答系統(tǒng)，其通過體內(nèi)小RNA對外來核酸進行序列特異性檢測和沉默，從而阻止病毒?質粒等入侵。該系統(tǒng)發(fā)揮功能的過程主要包括適應?表達和干擾3個階段。當病毒首次入侵時，細菌會將一小段病毒DNA整合到自身CRISPR基因的間隔序列中;當該病毒再次入侵時，之前整合的CRISPR轉錄生成成熟CRISPR序列，即crRNA，在crRNA引導下，Cas蛋白特異性識別并切割外源的基因組變?yōu)榫€性，使得病毒無法進行復制和表達，最終被細菌體內(nèi)的酶降解。該現(xiàn)象最早被CRISPR先驅JenniferDoudna和張鋒報道。CRISPR/Cas系統(tǒng)由兩大部分組成:第一個部分是編碼Cas相關蛋白質的基因，這些Cas蛋白在獲得外源基因片段和剪切外源基因上都起著重要的作用。第二大部分被稱為CRISPRarray，這個部分中包含了repeat序列和spacer序列，這兩種不同的序列是間隔開來的，本著兩個repeat序列夾一個spacer序列，Repeat序列在同一細菌中的堿基組成和長度是相對保守，基本不變的。根據(jù)Cas效應蛋白的結構和功能，CRISPR/Cas系統(tǒng)被分為兩大類:Class1(包含了typeI,III,andIV),和Class2(包含了typeII和typeV和typeVI)，在Class1中,對于外源基因組的剪切需要一個大的Cas蛋白復合物(由不止一種Cas蛋白組成)和引導RNA，在Class2中,對于外源基因的剪切只需要一個單一的剪切蛋白,目前基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的檢測方法包括RNA引導的靶向識別系統(tǒng)(Cas9)，以及靶向識別觸發(fā)的附帶裂解系統(tǒng)(Cas12和Cas13)。根據(jù)檢測原理,可將這些基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的核酸檢測技術分為兩類:典型的靶向識別切割和非典型的非特異性反式切割。根據(jù)檢測信號的方式主要包括四大類:基于熒光信號實時檢測?基于裸眼比色檢測?基于電化學檢測和基于其他信號檢測。其中較常用的為基于熒光信號的檢測方法，即在反應體系中使用末端帶有熒光基團和熒光猝滅基團標記的單鏈DNA或單鏈RNA報告基因，當Cas效應蛋白和crRNA復合物特異性識別切割目標基因后，會對報告基因進行非特異性切割，熒光素得以釋放從而顯示結果。準確、快速、簡便、經(jīng)濟一直是IVD開發(fā)的目標，但就目前已在臨床應用的產(chǎn)品來看，CRISPR技術和傳統(tǒng)的成熟PCR相比還未顯現(xiàn)明顯優(yōu)勢，PCR的最低檢出限和檢測速度甚至可以超越CRISPR。一個新技術需要一定時間的成熟和發(fā)展，也需要越來越多的臨床應用反饋來改進，因此，隨著提取技術、等溫擴增技術的應用以及更新更好的Cas蛋白的發(fā)現(xiàn)，CRISPR技術是否能超越傳統(tǒng)PCR，是否如發(fā)表文獻所說的有專屬的應用場景還有待觀察?，F(xiàn)批準上市的產(chǎn)品有：新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒（恒溫CRISPR法）、新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒（CRISPR免疫層析法）等。六、基于微流控技術的檢測技術微流控(Microfluidics)，是一種精確控制和操控微尺度流體，尤其特指亞微米結構的技術，又稱其為芯片實驗室(Lab-on-a-Chip)或微流控芯片技術。是把生物?化學?醫(yī)學分析過程的樣品制備?反應?分離?檢測等基本