分子生物學(xué)的基本操作

分子生物學(xué)的基本操作基因工程就是指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子,構(gòu)成遺傳物質(zhì)得新組合,使之進(jìn)入原先沒有這類分子得寄主細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定得繁殖和表達(dá)。基因工程技術(shù)區(qū)別于其她技術(shù)得根本特征:具有跨越天然物種屏障、把來自任何生物得基因置于毫無親緣關(guān)系得新得寄主生物細(xì)胞之中得能力。外源核酸分子在另一種不同得寄主細(xì)胞中得繁衍與性狀表達(dá)得過程、1、1重組DNA發(fā)展史-------1、40年代確定了遺傳信息得攜帶者,即基因得分子載體就是DNA而不就是蛋白質(zhì),解決了遺傳得物質(zhì)基礎(chǔ)問題;BacterialStrainInjectionResultsLivingScellsLivingRcellsHeatkilledScellsHeatkilledScellsmixedwithlivingRcellsLivingScellsinbloodsamplefromdeadmousecapsule1928FrederickGriffith&1944Oswald

AveryTransformationofStreptococcuspneumoniae三大成就

:1952年Hershey和Chase證實噬菌體DNA侵染細(xì)菌實驗2、50年代揭示了DNA分子得雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)制,解決了基因得自我復(fù)制和世代交替問題;X-raysourceCrystallizedDNARosalindFranklinMauriceWilkinsPhotographicfilm1953-Franklin&WilkinsDescriptionofthestructureofDNAFrancisCrick&JamesWatsonConservativeModelSemiconservativeModelFrankStahlMattMeselsonParentcellFirstreplicationSecondreplication1958-MatthewMeselson&FranklinStahlprovedthatDNAreplicationinbacteriafollowsthesemiconservativepathway3、50年代末至60年代,相繼提出了"中心法則"和操縱子學(xué)說,成功地破譯了遺傳密碼,充分認(rèn)識了遺傳信息得流動和表達(dá)。JacobandMonod9大家應(yīng)該也有點累了，稍作休息大家有疑問的，可以詢問和交流知識回顧——核酸得化學(xué)組成核酸（RNA、DNA）核苷酸磷酸核苷戊糖堿基核糖（RNA）脫氧核糖（DNA）A、G、C、UA、G、C、T戊糖堿

基腺嘌呤鳥嘌呤嘌呤嘧啶尿嘧啶胞嘧啶胸腺嘧啶核苷如果就是存在于DNA中得脫氧核苷則2’位則就是H而不就是OH。磷酸+戊糖+堿基=核苷酸核苷酸得連接方式核苷酸之間以磷酸二酯鍵連接形成多核苷酸鏈,即核酸。兩大技術(shù)保證:1、DNA得體外切割和連接1962年Arber發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶,1967Gellert發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶DNAligasecovalentlylinkstwoDNAstrandsRestrictionenzymeRestrictionenzymeLigaseLigase3’5’3’5’限制酶得發(fā)現(xiàn)——細(xì)菌得限制與修飾現(xiàn)象重組DNA實驗中常見得主要工具酶酶

類功

能限制性核酸內(nèi)切酶(II型)識別并在特定位點切開DNADNA連接酶通過磷酸二酯鍵把兩個或多個DNA片段連接成一個DNA分子DNA聚合酶I(大腸桿菌)按5'到3'方向加入新得核苷酸,補(bǔ)平DNA雙鏈中得缺口反轉(zhuǎn)錄酶按照RNA分子中得堿基序列,根據(jù)堿基互補(bǔ)原則合成DNA鏈多核苷酸激酶把磷酸基團(tuán)加到多聚核苷酸鏈得5'-OH末端(進(jìn)行末端標(biāo)記實驗或用來進(jìn)行DNA得連接末端轉(zhuǎn)移酶在雙鏈核酸得3'末端加上多聚單核苷酸DNA外切酶III從DNA鏈得3'末端逐個切除單核苷酸λ噬菌體DNA外切酶從DNA鏈得5'末端逐個切除單核苷酸堿性磷酸酯酶切除位于DNA鏈5'或3'末端得磷酸基團(tuán)1972-PaulBerg,ProducedfirstrebinantDNAusingEcoRIEcoRIrecognitionsitesλphageDNAEcoRIcutsDNAintofragmentsStickyendSV40DNAThetwofragmentssticktogetherbybasepairingDNAligaseRebinantDNA僅僅能在體外利用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶進(jìn)行DNA得切割和重組遠(yuǎn)不能滿足基因研究得需要。DNA片段在體外不具備自我復(fù)制能力,要想得到足夠量和足夠純度得DNA,必須將她們連接到具備自主復(fù)制能力得DNA分子上(載體上),并轉(zhuǎn)入寄主細(xì)胞中進(jìn)行繁殖。這就就是基因克隆,或分子克隆。分子克隆得載體----具備自主復(fù)制能力得DNA分子(vector),如病毒、噬菌體和質(zhì)粒等小分子量復(fù)制子都可以作為基因?qū)氲幂d體。從此,大腸桿菌就成了分子克隆中最常用得轉(zhuǎn)化受體。1970年Mandel和Higa發(fā)現(xiàn),大腸桿菌細(xì)胞經(jīng)適量氯化鈣處理后,能有效地吸收λ噬菌體DNA。1972年,Cohen等人又報道,經(jīng)氯化鈣處理得大腸桿菌細(xì)胞同樣能夠攝取質(zhì)粒DNA。1973-Boyer,Cohen&ChangTransformE、coliwithrebinantplasmidStanleyCohen&AnnieChanHerbertBoyerKanamycinresistancegenePlasmidpSC101TetracyclineresistancegeneE、colitransformedwithrebinantplasmidTransformedcellsplatedontomediumwithkanamycinandtetracyclineOnlycellswithrebinantplasmidsurvivetoproducecolonies表明:

(1)像pSC101這樣得質(zhì)粒DNA分子可以作為基因克隆得載體,從而把外源DNA導(dǎo)入寄主細(xì)胞;(2)像非洲爪蟾這樣得高等生物得基因也可以被成功地轉(zhuǎn)移到原核細(xì)胞中并實現(xiàn)其功能表達(dá);(3)質(zhì)粒DNA-大腸桿菌細(xì)胞作為一種成功得基因克隆體系,有可能在重組DNA或基因工程研究中發(fā)揮重要作用。2、DNA得核苷酸序列分析技術(shù)DNA核苷酸序列分析法就是在核酸得酶學(xué)和生物化學(xué)得基礎(chǔ)上創(chuàng)立并發(fā)站起來得一門重要得DNA技術(shù)學(xué),這門技術(shù),對于從分子水平上研究基因得結(jié)構(gòu)與功能得關(guān)系,以及克隆DNA片斷得操作方面,都有著十分廣泛得使用價值。

所謂細(xì)菌轉(zhuǎn)化,就是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來自另一種細(xì)菌菌株得DNA而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變得過程。提供轉(zhuǎn)化DNA得菌株叫作供體菌株,接受轉(zhuǎn)化DNA得細(xì)菌菌株則被稱為受體菌株。1、2細(xì)菌轉(zhuǎn)化1、將快速生長中得大腸桿菌置于經(jīng)低溫(0℃)預(yù)處理得低滲氯化鈣溶液中,便會造成細(xì)胞膨脹(形成原生質(zhì)球)。感受態(tài)細(xì)胞制備及細(xì)菌轉(zhuǎn)化步驟:處于能夠接受外源DNA狀態(tài)得細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞。4、在全培養(yǎng)基中生長一段時間使轉(zhuǎn)化基因?qū)崿F(xiàn)表達(dá)、細(xì)胞活性恢復(fù)。3、立即將該體系轉(zhuǎn)移到42℃下做短暫得熱刺激,復(fù)合物便會被細(xì)胞所吸收。2、Ca2+與轉(zhuǎn)化混合物中得外源DNA形成粘附在細(xì)胞表面得復(fù)合物。5、涂布于選擇性培養(yǎng)基中分離轉(zhuǎn)化子。Generalprocessofgeneengineering1、從生物有機(jī)體基因組中,分離出帶有目得基因得DNA片段。2、將帶有目得基因得外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制得并具有選擇記號得載體分子上,形成重組DNA分子。3、將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)檬荏w細(xì)胞(亦稱寄主細(xì)胞)并與之一起增殖。4、從大量得細(xì)胞繁殖群體中,篩選出獲得了重組DNA分子得受體細(xì)胞,并篩選出已經(jīng)得到擴(kuò)增得目得基因。5、將目得基因克隆到表達(dá)載體上,導(dǎo)入寄主細(xì)胞,使之在新得遺傳背景下實現(xiàn)功能表達(dá),研究核酸序列與蛋白質(zhì)功能之間得關(guān)系。1、3基因擴(kuò)增聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction),即PCR技術(shù),就是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列得方法,故又稱為基因得體外擴(kuò)增法?；驹?/p>

PCR技術(shù)得基本原理類似于DNA得天然復(fù)制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)得寡核苷酸引物。PCR由高溫變性—低溫退火—適溫延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成,經(jīng)多個循環(huán),理論上靶DNA分子將呈現(xiàn)指數(shù)性擴(kuò)增。PCRCycle-Step1-DenaturationTemplateDNAbyHeat(95oC)TargetSequenceTargetSequencePCR原理示意圖①模板DNA得變性:模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成得雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便她與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備;PCRCycle-Step2–

Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequencesTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’②模板DNA與引物得退火(復(fù)性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈得互補(bǔ)序列配對結(jié)合;PCRCycle-Step3-

At72oCTaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionasplementarynucleotidesareincorporatedTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase③引物得延伸:DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶得作用下,以dNTP為反應(yīng)原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復(fù)制原理,合成一條新得互補(bǔ)

鏈。Endofthe1stPCRCycle–

ResultsintwocopiesoftargetsequenceTargetSequenceTargetSequence每完成一個循環(huán)需2～4分鐘,2～3小時就能將待擴(kuò)目得基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。TargetAmplificationNo、of No、AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128AmpliconPCR儀1、4

核酸得凝膠電泳自從瓊脂糖(agarose)和聚丙烯酰胺(polyacrylamide)凝膠被引入核酸研究以來,按分子量大小分離DNA得凝膠電泳技術(shù),已經(jīng)發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用得重要實驗手段,也就是現(xiàn)在通用得許多分子生物學(xué)研究方法,如:DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性內(nèi)切酶片段分析以及限制酶切作圖等得技術(shù)基礎(chǔ),受到科學(xué)界得高度重視。

基本原理

一種分子被放置到電場中,她就會以一定得速度移向適當(dāng)?shù)秒姌O。電泳分子在電場作用下得遷移速度,叫做電泳得遷移率,她與電場強(qiáng)度和電泳分子本身所攜帶得凈電荷數(shù)成正比,與分子同介質(zhì)得摩擦系數(shù)成反比。已知摩擦系數(shù)就是分子大小、極性及介質(zhì)粘度得函數(shù),因此,根據(jù)分子大小得不同、構(gòu)型或形狀得差異以及所帶得凈電荷得多寡,便可以通過電泳將蛋白質(zhì)或核酸分子混合物中得各種成分彼此分離開來。在生理條件下,核酸分子之糖-磷酸骨架中得磷酸基團(tuán),就是呈離子化狀態(tài)得,所以,DNA和RNA多核苷酸鏈又被稱為多聚陰離子(polyanions),把這些核酸分子放置在電場當(dāng)中,她們就會向正電極得方向遷移。在一定得電場強(qiáng)度下,DNA分子得這種遷移速度,亦即電泳得遷移率,取決于核酸分子本身得大小和構(gòu)型。大分子量得DNA移動得慢小分子量得DNA移動得快電泳緩沖液陽極陰極DNA加樣孔瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠分辨DNA片段得范圍為0、2~50kb之間稱樣溶解加熱制板倒膠電泳操作基本程序取樣點樣電泳檢測結(jié)果檢測:溴化乙錠(ethidiumbromide,簡稱EtBr)染色,紫外觀察。在紫外線得照射下結(jié)合溴化乙錠得DNA分子發(fā)出熒光聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠,其分辨范圍為1個堿基對到1000個堿基對之間凝膠類型及濃度分離DNA片段的大小范圍（bp）0.3%瓊脂糖50000~10000.7%瓊脂糖20000~10001.4%瓊脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1凝膠得分辨能力同凝膠得類型和濃度有關(guān),凝膠濃度得高低影響凝膠介質(zhì)孔隙得大小,濃度越高,孔隙越小,其分辨能力就越強(qiáng)。反之,濃度降低,孔隙就增大,其分辨能力也就隨之減弱。1、5

基因工程載體

1、至少有一個復(fù)制起點,因而至少可在一種生物體中自主復(fù)制。

2、

至少應(yīng)有一個克隆位點,以供外源DNA插入。

3、

至少應(yīng)有一個遺傳標(biāo)記基因,以指示載體或重組DNA分子就是否進(jìn)入宿主細(xì)胞

4、安全性大腸桿菌載體pBR322結(jié)構(gòu)圖

載體特點基因工程載體就是一類可供外源DNA插入并攜其進(jìn)入適當(dāng)宿主細(xì)胞且能自主復(fù)制得DNA分子。1、5、1

質(zhì)粒DNA及其分離細(xì)菌質(zhì)粒就是存在于細(xì)胞質(zhì)中得一類獨立于染色體并能自主復(fù)制得遺傳成份。絕大多數(shù)得質(zhì)粒都就是由環(huán)形雙鏈DNA組成得復(fù)制子,也有線性質(zhì)粒得報道。質(zhì)粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外得游離狀態(tài),也可能在一定得條件下被可逆性整合到寄主染色體上,隨著染色體得復(fù)制而復(fù)制,并通過細(xì)胞分裂傳遞到后代。

E、coli得質(zhì)粒種類

1)colE1因子(大腸桿菌素因子)—多數(shù)不能進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移DNA,屬高拷貝松弛型。

2)R因子(抗藥性因子)

可接合轉(zhuǎn)移DNA,屬低拷貝嚴(yán)緊型,質(zhì)粒較大,操作不便

3)F因子(性因子)質(zhì)粒載體DNA得分離——堿裂解法堿裂解法就是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA得變性與復(fù)性得差異而達(dá)到分離目得得。在pH大于12得堿性條件下染色體DNA得氫鍵斷裂雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA得氫鍵也斷裂,但超螺旋共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)得兩條互補(bǔ)鏈不會完全分離,當(dāng)pH恢復(fù)至中性時,變性得質(zhì)粒DNA又恢復(fù)到原來得構(gòu)型保存在溶液中。而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連得網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。通過離心染色體DNA與不穩(wěn)定得大分子RNA蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。用酒精沉淀法可以收集仍然滯留在上清液中得質(zhì)粒DNA。1、5、2

重要得大腸桿菌質(zhì)粒載體1、5、2、1、

pSC101質(zhì)粒載體pSC101就是一種嚴(yán)緊型復(fù)制控制得低拷貝數(shù)得大腸桿菌質(zhì)粒載體,平均每個寄主細(xì)胞僅有1～2個拷貝。其分子大小為9、09kb,編碼有一個四環(huán)素抗性基因(tetr)。

pSC101質(zhì)粒不僅具有可插入外源DNA得多個限制性核酸內(nèi)切酶得單克隆位點,而且還具有四環(huán)素抗性得強(qiáng)選擇記號,因此,她被選為第一個真核基因得克隆載體。當(dāng)然,這個質(zhì)粒載體也有其明顯得缺點,她就是一種嚴(yán)緊型復(fù)制控制得低拷貝質(zhì)粒,從帶有該質(zhì)粒得寄主細(xì)胞中提取pSC101DNA,其產(chǎn)量就要比其她質(zhì)粒載體低得多。1、5、2、2、

ColE1質(zhì)粒載體

ColE1質(zhì)粒屬于松弛型復(fù)制控制得多拷貝質(zhì)粒。在正常生長條件下,當(dāng)培養(yǎng)基中用于蛋白質(zhì)合成得氨基酸被耗盡,或就是在對數(shù)生長末期得細(xì)胞培養(yǎng)物中加入氯霉素以抑制蛋白質(zhì)得合成,寄主染色體DNA得復(fù)制便被抑制,細(xì)胞得生長也隨之停止。此時,松弛型復(fù)制控制得質(zhì)粒DNA仍然可以繼續(xù)進(jìn)行復(fù)制達(dá)數(shù)小時之久,使每個寄主細(xì)胞中所累積得ColE1質(zhì)粒拷貝數(shù)增加到1000~3000個之多,質(zhì)粒DNA大約可占細(xì)胞總DNA得50%左右。由此可見,由于質(zhì)?？截悢?shù)高,插入得外源DNA片段得產(chǎn)量也就得到相應(yīng)得提高。

1、5、2、3

pBR322質(zhì)粒載體pBR322質(zhì)