(高清版)DB34∕T 1434-2011 抗蟲和耐除草劑玉米Bt176及其衍生品種實時熒光PCR檢測方法　　

ICS65.020.20抗蟲和耐除草劑玉米Bt176及其衍生品種實時熒光PCR檢測方法2011-05-11發(fā)布2011-06-11實施安徽省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布IDB34/T1434—2011本標準按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標準由安徽省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局歸口。本標準起草單位：安徽省農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所和安徽省標準化研究院。本標準主要起草人：汪秀峰、楊劍波、李莉、陸徐忠、馬卉、張士勝、倪大虎、宋豐順、陳萍、倪金龍、楊亞春、張毅。1DB34/T1434—2011抗蟲和耐除草劑玉米Bt176及其衍生品種實時熒光PCR檢測方法1范圍本標準適用于轉(zhuǎn)基因抗蟲和耐除草劑玉米Bt176及其衍生品種，以及相關(guān)制品中Bt176成分的實2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法NY/T672轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測通用要求和定義NY/T673轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測抽樣NY/T674轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測DN農(nóng)業(yè)部869號公告-8-2007抗蟲和耐除草劑玉米BT176及其衍生品種定性PCR方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。玉米醇溶蛋白基因。Bt176轉(zhuǎn)化體特異性序列event-spec外源插入載體3’端與玉米基因組的連接區(qū)序列，包括bar基因部分序列和玉米基因組部分序列。通過對PCR擴增反應中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)對起始模板定量的分析。2DB34/T1434—2011是3～15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。Ct值cyclethreshold4原理5.270%乙醇(V/V)。中，配成10mg/mL的濃度，于100℃加熱15min,緩慢冷卻至室溫，分裝成小份保存于-20℃。水中加入80.0g氫氧化鈉(NaOH),溶解后再加水定容到200mL。5.5500mmol/L乙二銨四乙酸二鈉溶液(pH8.0):稱取乙二銨四乙酸二鈉(EDTA-Na2)18.6g,加入708.0,加水定容到100mL,在103.4kPa(121℃)滅菌20min。5.6TE緩沖液(pH8.0):1mol/LTris-HCl(pH8.0)10mL和500mmol/LEDTA(pH8.0)溶液2mL,5.8適用于PCR反應的TaqDNA聚合酶(5U/μL)及其反應緩沖液。5.9引物和探針：序列信息應按附錄A執(zhí)行。用TE緩沖液(5.6)或重蒸餾水將上述引物和探針稀釋注：探針應避光保存。3DB34/T1434—20116儀器6.1分析天平：感量0.1g和0.1mg。6.2普通PCR儀和Real-timePCR儀。7操作步驟的比值在1.7～2.0時，滿足PCR檢測要求。7.5對照設置7.6PCR定性檢測按農(nóng)業(yè)部869號公告-8-2007規(guī)定的執(zhí)行。實時熒光PCR體系反應體系和反應條件參照附錄B和附錄C執(zhí)行。反試劑要求進行適當調(diào)整。每個反應體系設置3個平行。4DB34/T1434—2011或空白對照熒光值低于陰性對照和陽性對照熒光值的15%,表明反應體系正常工作；在擴增檢測轉(zhuǎn)化體Bt176時，空白對照和陰性對照的熒光曲線平直，陽性對照出現(xiàn)典型的擴增曲線，且檢測Ct值≤36或空白對照和陰性對照的熒光值低于陽性對照熒光值的15%,表明反應體系正常工作。否則，表明PCR反應體系不正常，需要查找原因重新檢測。8結(jié)果分析與表述a)試樣中內(nèi)標準基因檢測Ct值≤36,轉(zhuǎn)化體Bt176檢測Ct值≥40,則表明該試樣中不含轉(zhuǎn)基b)試樣中內(nèi)標準基因檢測Ct值≤36,轉(zhuǎn)化體Bt176檢測Ct值≤36,則表明該試樣中含有轉(zhuǎn)基c)試樣中轉(zhuǎn)化體Bt176檢測Ct值在36～40,則需調(diào)整模板濃度，重新檢測。經(jīng)重復檢測后，當檢測體系正常時，轉(zhuǎn)化體Bt176檢測Ct值<40,則表明該試樣中含有轉(zhuǎn)基因成分Bt176,表述為“樣品中檢測出抗蟲和耐除草劑玉米Bt176,檢測結(jié)果為陽性”;否則，表明該試樣中不含轉(zhuǎn)基因成分Bt176,表述為“樣品中未檢測出抗蟲和耐除草劑玉米Bt176,檢測結(jié)果為陰性”。9防污染措施轉(zhuǎn)基因抗蟲和耐除草劑玉米Bt176的實時熒光PCR檢測過程的防污染措施應符合NY/T672的5DB34/T1434—2011(規(guī)范性附錄)實時熒光PCR檢測引物和探針序列信息表A.1被檢測基因引物或探針序列擴增長度/bpzSSIIbzSSIIb-F:5′-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-388bpzSSIIb-R:5′-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3'zSSIIb-P:5′-FAM-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-TAMRA-3Bt176Bt176-F:5′-GTGCATCAATGGAGGAGAGAAC-3′Bt176-R:5′-GACTTCAGCCTGCCGGTACT-3′Bt176-P:5′-FAM-TCTCGGTGACGGGCAGGACC-TAMRA-36DB34/T1434—2011(規(guī)范性附錄)實時熒光PCR檢測反應體系終濃度水2×TaqManMix10Hmol/L下游引物10Hmol/L探針25mg/LDNA模板總體積注1:如果PCR緩沖液中含有氯化鎂，則不加氯化鎂溶液，加等體積無菌水。注2:玉米內(nèi)標準基因PCR檢測反應體系中，上下游引物和探針分別為zSSIIb-F/R和zSSII