題目雞傳染性支氣管炎毒株

摘要 摘要 引言 實驗材 其 HQ毒株P10和P110N基因的克隆與序列測定分 4.11病毒RNA提 反轉錄反應(Reverse pGEM-TEasy載體與純化PCR產物的連 4.1.10HQ4.1.10HQ毒株P10與P110N基因序列測定與分析比 試驗結 HQ毒株P10和P110N基因的克隆與序列測定分 HQ毒株P10與P110N基因序列測定與分 討 結 參考文 致 序列測定分析比較，N294位、355位、634位、86012024NNHQNHQ關鍵詞：雞傳染性支氣管炎病毒HQ毒 N基Abstract：TheuseofSPFchickwillcontinuousHQstrainattenuated,tothe110AnalysisandcomparisonofsequencingNgeneonP10andP110,Ngenein294,355,634,and1202changes,andresultedina4aminoacidresiduesmutated.ThisstudyprovidestheforthecorrelationbetweenbeforeandafterHQstrainpassagedNgenechangeandstrainsofserotypesandKeywords：Avianinfectiousbronchitis(IB)；HQ Ninfectiousbronchitis，IBV）引起的雞的一種急性、高度接觸性傳染病。病毒血清型復雜，來，IB的流行呈上升趨勢，尤其是腎型、腺胃型雞傳染性支氣管炎的發(fā)生，給養(yǎng)禽業(yè)造成RNA，全長27.6kb，主要結構RNARNAIBVS1NIBV的進化中高度保守；但近年研究發(fā)現，N基因也存在廣泛的變異，并且這些變異分布于抗原表位和相關功能區(qū)HQbronchitis，IB傳染病之二。由雞傳染性支氣管炎病毒（Avianinfectiousbronchitis，IBV）引起的一種急1-4周齡的雛雞[1，2]IB巨大損失[3]；IB可侵害生殖系統(tǒng)，發(fā)生輸卵管炎，導致輸卵管堵塞，造成產蛋障礙綜合征[4]。該病呈世界流行，在近年來成為了嚴重危害世界養(yǎng)禽業(yè)的傳染病之一[5-8]。IBV在國內但雞傳染性支氣管炎病毒不會垂直傳播[9]但雞傳染性支氣管炎病毒不會垂直傳播[9]RNA和磷酸化核蛋白組成IBVC定等研究十分有效的方法。IBVNDVNDV（Spike，S（Envelope，E（S（M（EmRNA1、mRNA3mRNA5編碼。N蛋白。NmRNA6編碼，是病毒內部核衣殼的組成部分，由是決定了病毒的復制和組裝的重要蛋白[15]。N蛋白的組成中堿性氨基酸占17.2%-19.6%，其中包括199個組氨酸、42個賴氨酸和3個精氨酸，80%IBVFigThestructureofIBVNRNA上，參BELISA2.7NIBVS1NIBV的進化中高度保守；但近年研究發(fā)現，NHQ科學依據[17]科學依據[17]IBV3.1GIBCO 生工生物工程（上海）TRIzolInvitrogen公司，DNAMarkerDL2000購自寶生物工程（大連）有?ReverseTranscriptionSystem（A5001）反轉錄試劑盒購自promega公司，2×TaqMasterMix購自天根生化科技有限公司，JM109BioTeke3.2PHSW-CJ-LCN-BIOTEKSartoriusarium631DI-3Thermo公司上海雷磁(pHS-單道移液器（0-單道移液器（0-100-PCR儀SPFSPF44.1HQP104.11RNARNA提取。Rnase-free1.5mL離心管，加入300μL混合液和400μLTRIzol，劇烈振蕩后于4℃、12000r/min離心15min。沉淀30min，之后4℃、13000rpm離心15min，棄上清。RNA沉淀溶解，立即進行反轉錄反應，或-20℃保存?zhèn)溆谩?.1.2表1IBVS1基因、NTable.1IBVS1geneandNgeneprimer4.1.2表1IBVS1基因、NTable.1IBVS1geneandNgeneprimer目的片上游引物下游引物4.1.3（1）RNARandomRNA最高5μg/反應Nuclease-Free10RNA與引物的混合液70℃變性5min，隨后置于冰上5GoScript?5XReactionBufferMgCl2,25mMPCRNucleotideMix,GoScript?Reverse0.5（5）cDNA530（5）cDNA53015min4.1.4PCRPCR50μLS1PCR9595557272451121032NPCR959553727245111min301035為130V、50mA、30min4.1.5PCR取50μ為130V、50mA、30min4.1.5PCR取50μLPCR產物于1%30s每1克瓊脂糖凝膠加1mLBindingBuffer，55℃水浴，振蕩數次直至凝膠完全溶解。300μLBindingBuffer加入離心2min2min；然后13000r/min離心2min。取5μLPCR4.1.6pGEM-TEasypGEM-TEasy載體PCR產物T4DNA104（1） Gal平 2 / IP 5μL加入到冰浴中的2個1.5mLJM109（－70℃凍存，冰浴5min30min，冷卻2min。，37℃150（7）1,000rpm離心10min，留取沉淀，加入50μLLB（8）LB/氨芐/IPTG/X-Gal平板上，將平板置于（7）1,000rpm離心10min，留取沉淀，加入50μLLB（8）LB/氨芐/IPTG/X-Gal平板上，將平板置于37℃生化培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)（12～16h。將長有菌落的平板置于4℃中3～4h，挑選白色、單個菌落接種到5mLLB培養(yǎng)基（含氨芐青霉素50μg/mL，37℃振蕩培養(yǎng)12～16h。提取的重組質粒在1%PCR212.5118.5下游引物S1PCR959555727251121032NPCR95955372725111min301032PCR反應結束后進行1%瓊脂糖凝膠中電泳，參數設置為130V、50mA、30min4.1.10HQP10P110N4.1.10HQP10P110N挑選陽性質粒送至上海博尚生物科技有限公司測序，將測得的N55.1HQP10P110N5.1.1NRT-PCRcDNAWF、WRHF、HRS1基因、N1圖 Fig.2RT-PCRresultsofNM：DNAMarkerDL2000;1：HQP10N2：HQP110N DNAMarkerDL2000;1:NgeneofHQP102:NgeneofHQ5.1.2OMEGA1%2圖3NFig.3TherecombinantplasmidextractionresultsNgeneM：DNA圖3NFig.3TherecombinantplasmidextractionresultsNgeneM：DNAMarkerDL2000；1：HQP10N基因；2：HQP110N基因M:DNAMarkerDL2000;1:NgeneofHQP10;2:NgeneofHQP1105.1.3PCR3，得到約圖NPCRFig.4TheidentificationofrecombinantplasmidPCRproductsofNgeneM：DNAMarkerDL2000；1：HQP10N基因；2：HQP110NM:DNAMarkerDL2000;1:NgeneofHQP10;2:NgeneofHQ5.1.4HQP10P110NN使用DNASTARHQ毒株P10N基因由12305.1.4HQP10P110NN使用DNASTARHQ毒株P10N基因由1230個堿基組成，5，分別在NHQN基因序列推導出的氨基酸個數都為40971個，占17%。HQP110P10N基因推導氨基酸序列相比，有4個氨基酸殘基發(fā)生突變（見6：在NNetphos2.0ServerHQP10P110N蛋白的潛在磷酸化位點，可知傳N蛋白潛在磷酸化位點的數量和位置都沒有變化。2HQP10P110NTable.2ThepotenialphosphorylationsitesofHQP10andP110N圖HQP10ThepotentialphosphorylationsitesofHQP10N圖6HQP110圖6HQP110N ThepotentialphosphorylationsitesofHQP110N（4）NDNAMANHQP10HQP110N蛋白的疏水性，圖6N圖7HQP10P110N ThecomparisonofhydrophobicitybetweenHQP10andP110N6NIBVIBV雞HuangYNIBVIBV雞HuangYP等對臺灣三株雞胚致弱毒株（TW1171/92、2296/95、2575/98）3’端進行測序分析比較。結果發(fā)現3NNN71202位發(fā)生改變，并導致有4HQN基因的改HQ毒株的毒力發(fā)生改變可能有關。SaifYM.禽病學[M].112005:108-19（20631-Johnson,R.B.etal.:AvianDis.[J],1975,19:82-BayryJ,GoudarMS,NighotPK,KshirsagarSG,LadmanBS,GelbJJr,GhalsasiGR,GN,EmergenceofanephropathogenicavianinfectiousbronchitisviruswithanonelinIndia.ClinMicrobiol,2005,43:916- S,et[8]WangHN,WuQZ,HuangY,etal.IsolationandidentificationofinfectionsvirusfromchickensinSichuan,China[J].AvianDIS,1997,41:279-[9]王玉東，王永玲，張子春，等.雞腺胃型支氣管炎病毒的分離和鑒定[J].中國動物檢疫，[10]SaifYM.禽病學[M].112005:108-[10]SaifYM.禽病學[M].112005:108-，2002,28618-宋顯章,韓青松，涂宜強,等.雞傳染性支氣管炎病毒分子生物學研究進展[J].畜牧與飼料科[17]N[J].2007,29：在本論文是在吳寶成老師的悉心指導下，進行試驗和撰寫完成的。在實驗過程中，我學到了許多的新知識和科學的實驗方法，更體會到了默默奮斗在一線廣大科研人員的努力和辛勞及偉大。在這里，我要把最誠摯的謝意獻給吳寶成老師！衷心感謝在實驗中吳異健老師、張紅星河吳曉萍老師的指導與幫助，以及研究生賽春春學長，江錦繡、洪艷艷學姐等全體實驗室成員的幫助關心與支持。同時感謝在這實驗過程中給予我?guī)椭椭С值?/p>