旱獺源性成分檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR法

1旱獺源性成分檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法本文件規(guī)定了動(dòng)物源性產(chǎn)品中旱獺源性成分定性檢測(cè)方法。本文件適用于動(dòng)物源性產(chǎn)品（肉制品、皮毛制品、飼料等）中旱獺源性成分的鑒定，靈敏度為0.001ng/μL2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4789.1食品安全國(guó)家文件食品微生物學(xué)檢驗(yàn)總則GB/T5009.1食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法理化部分總則GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求3縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。3.1實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)3.2CTAB十六烷基三甲基溴化銨3.3三氨基甲烷3.4EDTA乙二胺四乙酸24設(shè)備與材料4.1設(shè)備4.1.1實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)系統(tǒng)。4.1.2高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（最高轉(zhuǎn)速12000rpm以上）。4.1.3離心機(jī)。4.1.4旋渦振蕩器。4.2材料4.2.1單孔道微量移液器和槍頭：0.5μL～10μL、10μL～100μL、20μL～200μL、100μL～10004.2.2EP離心管。4.2.3刻度量筒：100mL，500mL，1000mL。4.2.4試劑瓶和洗滌瓶500mL。4.3試劑4.3.1水：符合GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室二級(jí)水規(guī)格。4.3.2引物對(duì)序列:上游：5’-CCCTATTAATCTTAACAGCA-3’下游：5’-GGGATTAGAGTAGCTTCA-3’探針序列：5’-FAM-TATAGCAAGCCAAGGTCACTTAACTCA-TAMRA-3’4.3.3試劑盒：按照試劑盒說(shuō)明書使用試劑盒提供的相應(yīng)試劑。4.3.4自備的試劑：CTAB提取緩沖液（十六烷基三甲基溴化銨CTAB-沉淀液，蛋白酶K，1.2mol/L氯化鈉。4.3.5實(shí)時(shí)熒光預(yù)混液4.4質(zhì)控物質(zhì)4.4.1陽(yáng)性對(duì)照樣品：采用已知含有旱獺源性成分的樣品，或經(jīng)測(cè)序確認(rèn)的陽(yáng)性質(zhì)粒。4.4.2陰性對(duì)照樣品：采用已知不含有旱獺源性成分的樣品。4.4.3空白對(duì)照：采用與模板等體積的雙蒸水。5實(shí)驗(yàn)方法5.1樣品的選取與制備3動(dòng)物源性食品按照GB/T5009.1GB4789.1采樣。將實(shí)驗(yàn)室樣品研磨待用。5.2樣品DNA的提取參照附錄A.中提取樣品DNA的方法提取待檢基因組DNA，也可采用商品化的組織基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行。當(dāng)A260/A280比值在1.7～1.9之間時(shí)，適宜于PCR擴(kuò)增。樣品從DNA提取過(guò)程開始，樣品進(jìn)行平行樣品的檢測(cè)。除檢測(cè)樣品外，需要設(shè)立陰性、陽(yáng)性及空白對(duì)照。5.3實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)5.3.1反應(yīng)體系：反應(yīng)體系體積為25μL，體系組成見表1。表1旱獺源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的反應(yīng)體系試劑名稱貯備液濃度μmol/L反應(yīng)體系體積—111—2—5.3.2反應(yīng)條件收集熒光信號(hào)值。5.3.3檢測(cè)過(guò)程分別設(shè)陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照。6結(jié)果判定與表述6.1質(zhì)量控制6.1.1一般要求實(shí)驗(yàn)中設(shè)置的各種對(duì)照PCR檢測(cè)結(jié)果應(yīng)符合以下情況。否則，任一種對(duì)照如果出現(xiàn)非下述正常結(jié)果，應(yīng)重做試驗(yàn)。6.1.2核酸提取空白對(duì)照和PCR擴(kuò)增試劑空白對(duì)照檢測(cè)結(jié)果Ct為0或者Ct≥40.0。6.1.3PCR擴(kuò)增陰性目標(biāo)DNA對(duì)照4檢測(cè)結(jié)果Ct為0或者Ct≥40.06.1.4PCR擴(kuò)增陽(yáng)性目標(biāo)DNA對(duì)照檢測(cè)結(jié)果Ct≤35.06.2結(jié)果判斷和報(bào)告6.2.1樣品2個(gè)平行樣檢測(cè)結(jié)果Ct為0或者Ct≥40.0，同時(shí)各種試驗(yàn)對(duì)照結(jié)果正常，可以判斷樣品結(jié)果為陰性，報(bào)告未檢出旱獺源性成分。6.2.2樣品至少1個(gè)平行樣檢測(cè)結(jié)果35.0﹤Ct﹤40.0，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，同時(shí)各種試驗(yàn)對(duì)照結(jié)果正常，此時(shí)應(yīng)適當(dāng)增加DNA模板量重做實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。再次檢測(cè)結(jié)果任然Ct〈40.0并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，同時(shí)各種試驗(yàn)對(duì)照結(jié)果正常，可以判斷樣品檢出旱獺源性成分，報(bào)告檢出旱獺源性成分；再次檢測(cè)結(jié)果任然Ct為0或者Ct≥40.0同時(shí)各種試驗(yàn)對(duì)照結(jié)果正常，可以判斷樣品未檢出旱獺源性成分，報(bào)告未檢出旱獺源性成分。6.2.3樣品2個(gè)平行樣品檢測(cè)結(jié)果Ct≤35.0并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，同時(shí)各種試驗(yàn)對(duì)照結(jié)果正常，可以判斷樣品檢出旱獺源性成分，報(bào)告檢出旱獺源性成分。5樣品DNA的提取及溶液配制A.1CTAB-提取緩沖液將5gCTAB，20.45gNaCL，3.03gTris，1.86gNa2-EDTA溶于200mL水中，用鹽酸調(diào)pH8.0后，定容至250mL，115℃高壓15min。A.2CTAB-沉淀液稱0.2gCTAB,0.234gNaCL，定容至100mL，115℃高壓15min。A.3蛋白酶K按試劑說(shuō)明配制。A.41.2mol/LNaCL溶液稱取28gNaCL，定容至400mL，115℃高壓15min。A.5DNA提取方法A.5.1稱取樣品0.5～1g加入1.5～3.5mLCTAB提取液中，再加入12～20μL蛋白酶K（根據(jù)CTAB量調(diào)節(jié)每個(gè)樣品提取2管，同時(shí)用水做空白提取對(duì)照。混勻后65℃至少1h(過(guò)夜孵育最好)，如樣品膨脹，則可再多加CTAB,每次多1mL，最多10mL。A.5.2低溫4000～5000r/min離心10min。A.5.3將上清（約1mL）加入無(wú)菌EP中（2mL管加入700μL氯仿，渦旋30s后，再12000rpm離心10min。A.5.4取上清600～650μL加入無(wú)菌EP中，加入2倍體積的CTAB沉淀液，旋渦混勻，室溫靜置1min。A.5.512000rpm離心10min，去上清。沉淀溶解于350μL的1.2mol/LNaCL溶液。（2管合并共用3A.5.6加入350μL氯仿，渦旋30min，再12000rpm離心10min。A.5.7取上清液至無(wú)菌EP管中（確定體積加入0.8倍提及的異丙醇，手搖混勻，室溫孵化至少20min,12000rpm離心10min，去上清，沉淀用500μL75%的乙醇洗滌，再12000rpm離心10min。A.5.8去上清后，干燥沉淀，60℃下15～20s（開蓋倒立）。A.5.9將沉淀溶于100μL滅菌水或TEbuffer或DEPC水中。6旱獺源性成分的目標(biāo)擴(kuò)增序列193bpCCCTATTAATCTTAACAGCATGACTTCTACCCCTTATAATTATAGCAAGCCA