高三生物二輪復(fù)習(xí)練習(xí)聚焦“PCR”

聚焦“PCR技術(shù)”1姓名班級(jí)【高考真題填空】1.(2020新高考Ⅰ)通過(guò)PCR技術(shù)可在總cDNA中專一性的擴(kuò)增出Wx基因的cDNA，原因是__________________________________________________。2.(2022全國(guó)乙卷)為了確保新冠病毒核酸檢測(cè)的準(zhǔn)確性，在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)必須依據(jù)新冠病毒RNA中的__________________來(lái)進(jìn)行。PCR過(guò)程每次循環(huán)分為3步，其中溫度最低的一步是___________。3.(2022·廣東)研究者針對(duì)每個(gè)需要擴(kuò)增的酶基因設(shè)計(jì)一對(duì)，利用PCR技術(shù)，在優(yōu)化反應(yīng)條件后擴(kuò)增得到目標(biāo)酶基因。4.(2022山東)為構(gòu)建重組載體，需先設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR特異性擴(kuò)增基因。用于擴(kuò)增基因的引物需滿足的條件是。5.(2021全國(guó))PCR技術(shù)可用于臨床的病原菌檢測(cè)。為檢測(cè)病人是否感染了某種病原菌，進(jìn)行了相關(guān)操作：①分析PCR擴(kuò)增結(jié)果；②從病人組織樣本中提取DNA；③利用PCR擴(kuò)增DNA片段；④采集病人組織樣本?；卮饐?wèn)題：(1)若要得到正確的檢測(cè)結(jié)果，正確的操作順序應(yīng)該是（用數(shù)字序號(hào)）。(2)操作③中使用的酶是_____________________，PCR反應(yīng)中的每次循環(huán)可分為變性、復(fù)性、三步，其中復(fù)性的結(jié)果是。(3)為了做出正確的診斷，PCR反應(yīng)所用的引物應(yīng)該能與____________特異性結(jié)合。(4)PCR（多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)是指____________________________________。該技術(shù)目前被廣泛地應(yīng)用于疾病診斷等方面。6.（2023.6浙江改編）2011年我國(guó)首次利用轉(zhuǎn)基因和體細(xì)胞核移植技術(shù)成功培育了高產(chǎn)賴氨酸轉(zhuǎn)基因克隆奶牛。其基本流程為：①構(gòu)建乳腺專一表達(dá)載體。②表達(dá)載體轉(zhuǎn)入牛胚胎成纖維細(xì)胞（BEF）。③將轉(zhuǎn)基因的BEF作為核供體細(xì)胞進(jìn)行核移植。④重組細(xì)胞的體外培養(yǎng)及胚胎移植。⑤檢測(cè)：DNA水平檢測(cè)：利用PCR技術(shù)，以非轉(zhuǎn)基因牛耳組織細(xì)胞作為陰性對(duì)照，以為陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因牛耳組織細(xì)胞中存在目的基因。RNA水平檢測(cè)：從非轉(zhuǎn)基因牛乳汁中的脫落細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因牛乳汁中的脫落細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因牛耳組織細(xì)胞，提取總RNA，對(duì)總RNA進(jìn)行處理，以去除DNA污染，再經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA，并以此為，利用特定引物擴(kuò)增目的基因片段。7.（2023.1浙江改編）甲植物細(xì)胞核基因具有耐鹽堿效應(yīng)，乙植物細(xì)胞質(zhì)基因具有高產(chǎn)效應(yīng)。某研究小組用甲、乙兩種植物細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞雜交相關(guān)研究，基本過(guò)程包括獲取原生質(zhì)體、誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合（在原生質(zhì)體融合前，需對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行處理，分別使甲原生質(zhì)體的細(xì)胞質(zhì)和乙原生質(zhì)體的細(xì)胞核失活）、篩選融合細(xì)胞、雜種植株再生和鑒定，最終獲得高產(chǎn)耐鹽堿再生植株。用PCR技術(shù)鑒定再生植株。已知甲植物細(xì)胞核具有特異性DNA序列a，乙植物細(xì)胞質(zhì)具有特異性DNA序列b；M1、M2為序列a的特異性引物，N1、N2為序列b的特異性引物。完善實(shí)驗(yàn)思路：①提取純化再生植株的總DNA，作為PCR擴(kuò)增的；②將DNA提取物加入PCR反應(yīng)體系，為特異性引物，擴(kuò)增序列a；用同樣的方法擴(kuò)增序列b。③得到的2個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)后，若每個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠中均出現(xiàn)了預(yù)期的個(gè)條帶，則可初步確定再生植株來(lái)自于雜種細(xì)胞。8.（2019全國(guó)Ⅰ）在體外利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)，使反應(yīng)體系中的模板DNA解鏈為單鏈的條件是。目前在PCR反應(yīng)中使用TaqDNA聚合酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是。9.(2022山東)為使PCR產(chǎn)物能被限制酶切割，需在引物上添加相應(yīng)的限制酶識(shí)別序列，該限制酶識(shí)別序列應(yīng)添加在引物的______（填“3′端”或“5′端”），原因是?！具x擇+簡(jiǎn)答】1.(2021湖北)某實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)獲取目的基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示除目的基因條帶（引物與模板完全配對(duì)）外，還有2條非特異條帶（引物和模板不完全配對(duì)）。為了減少反應(yīng)非特異條帶的產(chǎn)生，以下措施中有效的是（）A.增加模板DNA的量 B.延長(zhǎng)熱變性的時(shí)間C.延長(zhǎng)延伸的時(shí)間 D.提高復(fù)性的溫度2.(2021江蘇)熱啟動(dòng)PCR可提高擴(kuò)增效率，方法之一是：先將除??????DNA聚合酶以外的各成分混合后，加熱到80℃以上再混入酶，然后直接從94℃開(kāi)始PCR擴(kuò)增，下列敘述正確的有（）多選A.??????酶最適催化溫度范圍為50～60℃B.與常規(guī)PCR相比，熱啟動(dòng)PCR可減少反應(yīng)起始時(shí)引物錯(cuò)配形成的產(chǎn)物C.兩條子鏈的合成一定都是從5′端向3′端延伸D.PCR產(chǎn)物DNA堿基序列的特異性體現(xiàn)了??????酶的特異性3.(2017·江蘇)設(shè)計(jì)引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物（只標(biāo)注了部分堿基序列）都不合理（見(jiàn)圖），請(qǐng)分別說(shuō)明理由。(1)第1組：。(2)第2組：。4.(2020北京)為了對(duì)重金屬污染的土壤進(jìn)行生物修復(fù)，研究者將從楊樹(shù)中克隆的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HMA3基因與外源高效啟動(dòng)子連接，導(dǎo)入楊樹(shù)基因組中（如圖）。為檢測(cè)獲得的轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)苗中是否含有導(dǎo)入的??????3基因，同時(shí)避免內(nèi)源??????3基因的干擾，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)選擇的引物組合是()A.①+③ B.①+② C.③+② D.③+④5.反轉(zhuǎn)錄PCR又稱逆轉(zhuǎn)錄PCR(RTPCR)，是以mRNA為模板進(jìn)行的特殊PCR，過(guò)程如圖。下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是()A．圖示過(guò)程需要控制溫度，否則可能得不到產(chǎn)物B．RTPCR技術(shù)中，不需已知mRNA的全部序列C．過(guò)程③中子鏈沿著模板鏈的5′→3′方向延伸D．RTPCR技術(shù)可應(yīng)用于是否被RNA病毒感染的檢測(cè)6.下列操作過(guò)程的敘述中錯(cuò)誤的是()A．PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌B．PCR所用緩沖液和酶從冰箱拿出之后，應(yīng)緩慢融化C．PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并常溫儲(chǔ)存D．在微量離心管中添加反應(yīng)成分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換7.下圖為質(zhì)粒pUC18，為生產(chǎn)出滿足需求的質(zhì)粒載體，利用定點(diǎn)誘變技術(shù)，通過(guò)設(shè)計(jì)具有誘變位點(diǎn)的引物P1和引物P2進(jìn)行PCR，來(lái)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)載體的單堿基突變，目的是使質(zhì)粒pUC18不能被限制酶Eam1105Ⅰ識(shí)別，但依然具有氨芐青霉素抗性。下列相關(guān)敘述，錯(cuò)誤的是()A．誘變位點(diǎn)位于限制酶Eam1105Ⅰ識(shí)別序列中B．PCR反應(yīng)體系由P1、P2兩種引物、脫氧核苷酸、TaqDNA聚合酶及含Mg2＋的緩沖液組成C．誘變成功的質(zhì)粒依然具有氨芐青霉素抗性，利用了密碼子具有簡(jiǎn)并性的原理D．誘變成功的質(zhì)粒pUC18經(jīng)過(guò)EcoRⅠ、Eam1105Ⅰ雙酶切后進(jìn)行電泳，只能產(chǎn)生1條條帶8.(2023.6·浙江)某研究小組利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將綠色熒光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如圖甲所示。實(shí)驗(yàn)得到能正常表達(dá)兩種蛋白質(zhì)的雜合子雌雄小鼠各1只，交配以期獲得Gata3GFP基因純合子小鼠。為了鑒定交配獲得的4只新生小鼠的基因型，設(shè)計(jì)了引物1和引物2用于PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖乙所示。下列敘述正確的是()A.Gata3基因的啟動(dòng)子無(wú)法控制GFP基因的表達(dá)B.翻譯時(shí)先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白C.2號(hào)條帶的小鼠是野生型，4號(hào)條帶的小鼠是Gata3GFP基因純合子D.若用引物1和引物3進(jìn)行PCR，能更好地區(qū)分雜合子和純合子9.不對(duì)稱PCR技術(shù)是利用不等量的一對(duì)引物來(lái)產(chǎn)生大量單鏈DNA(ssDNA)的方法，如圖所示。不對(duì)稱PCR中加入的一對(duì)引物中含量較少的被稱為限制性引物，含量較多的被稱為非限制性引物，兩者的比例通常為1/50～1/100。PCR反應(yīng)的最初若干次循環(huán)中，其擴(kuò)增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA(dsDNA)，在限制性引物消耗完后，就會(huì)產(chǎn)生大量的ssDNA。下列相關(guān)說(shuō)法正確的是()A.兩種引物與模板鏈結(jié)合時(shí)，需將溫度控制在72℃左右B．PCR擴(kuò)增時(shí)，在DNA解旋酶的作用下雙鏈DNA解聚為單鏈C．PCR擴(kuò)增時(shí)，子鏈分別沿限制性引物的5′端、非限制性引物的3′端延伸D．通過(guò)不對(duì)稱PCR技術(shù)最后大量獲得的ssDNA的堿基序列與圖中甲鏈的相同10.目的基因表達(dá)檢測(cè)過(guò)程中需要大量探針,若僅擴(kuò)增探針這段單鏈，需要利用不對(duì)稱PCR,即采用不等量的一對(duì)引物，經(jīng)若干次循環(huán)后,低濃度的引物被耗盡,以后的探針循環(huán)只產(chǎn)生高濃度引物的延伸產(chǎn)物，結(jié)果產(chǎn)生大量的單鏈DNA。這兩種引物分別引物1引物2，為限制性引物與非限制性引物，其最佳比例一般為1:50~1:100。據(jù)此分析，上圖中的引物應(yīng)該為非限制性引物。假設(shè)反應(yīng)體系中原來(lái)有1個(gè)模板DNA分子，最初25個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)生雙鏈DNA，后15個(gè)循環(huán)均只擴(kuò)增一條鏈，則需要非限制性引物個(gè)。11.免疫PCR是一種微量抗原檢測(cè)系統(tǒng)，利用該技術(shù)可檢測(cè)牛乳中微量抗生素。大致檢測(cè)步驟是，將抗體1固定在微板上，沖洗后加入待檢的牛乳，再加入DNA標(biāo)記的抗體2，PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)。下列敘述錯(cuò)誤的是()A．圖中的抗體1和抗體2均需要與抗生素特異性結(jié)合B．第三次沖洗的目的是除去游離的抗體2以避免出現(xiàn)假陽(yáng)性C．在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，子鏈的合成均是從5′端向3′端延伸的D．可用牛乳蛋白基因的DNA片段作為標(biāo)記DNA與抗體2相連12.下列關(guān)于DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定的敘述，錯(cuò)誤的是()A．瓊脂糖凝膠電泳是對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行鑒定的一種方法B．DNA分子在凝膠中的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小等有關(guān)C．電泳結(jié)束后，可通過(guò)電子顯微鏡觀察到凝膠中的DNA分子條帶D．該實(shí)驗(yàn)使用到的器具和試劑等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理13.新型冠狀病毒是一種單鏈RNA病毒，新型冠狀病毒的常規(guī)檢測(cè)方法是通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR鑒定。（1）首先，從樣本中提取病毒RNA，經(jīng)催化生成cDNA。然后以cDNA為模板，以為原料，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，測(cè)定樣品中病毒核酸量。（2）通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增目的基因，需額外添加熒光標(biāo)記探針（一小段單鏈DNA，可與目的基因中部序列特異性結(jié)合）。當(dāng)探針完整時(shí)，不產(chǎn)生熒光。在PCR過(guò)程中，與目的基因結(jié)合的探針對(duì)TaqDNA聚合酶水解，R與Q分離后，R發(fā)出的熒光可被檢測(cè)到（如圖甲）。①當(dāng)樣本中有目的基因時(shí)，引物和探針與目的基因退火，通過(guò)形成而特異性結(jié)合。退火的溫度一般在℃范圍。具體反應(yīng)溫度常與引物長(zhǎng)度、堿基組成等有關(guān)。通常，引物中含量越低，所需的退火溫度越低。②在PCR循環(huán)的階段，由于TaqDNA聚合酶催化子鏈的合成并水解探針，檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度與反應(yīng)體系中DNA分子數(shù)呈關(guān)系。（3）實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)新型冠狀病毒感染時(shí)，檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度變化如圖乙所示。①與指數(shù)增長(zhǎng)期相比，線性增長(zhǎng)期目的基因數(shù)量的增長(zhǎng)率下降，可能的原因是（答一點(diǎn)）。②Ct值的含義：在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的熒光閾值時(shí)所經(jīng)歷的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。因此，當(dāng)樣本中初始模板越多時(shí)，Ct值就。③某新型冠狀病毒核酸檢測(cè)說(shuō)明書(shū)標(biāo)明，Ct≤37判定為陽(yáng)性，Ct＞40或無(wú)Ct值判定為陰性。圖乙所示新型冠狀病毒核酸檢測(cè)結(jié)果應(yīng)判定為。（4）陰性結(jié)果也不能排除新型冠狀病毒感染?？赡墚a(chǎn)生假陰性的因素有（多選）。a.取樣太早，樣本中病毒量少，達(dá)不到實(shí)時(shí)熒光b.樣本被污染，RNA酶將病毒RNA降解c.病毒發(fā)生變異14.“實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR”是新冠疫情防控的一把利刃，通常在l～2h內(nèi)即可得到檢測(cè)結(jié)果。TaqMan探針是實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR技術(shù)中一種常用探針（如圖1），其一端連接熒光基團(tuán)（R），另一端連接淬滅劑（Q）。當(dāng)探針完整時(shí)，R發(fā)出的熒光信號(hào)被Q吸收而不發(fā)熒光。在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，當(dāng)Taq酶遇到探針時(shí)會(huì)使探針?biāo)舛尫懦鲇坞x的R和Q，R發(fā)出的熒光信號(hào)被相應(yīng)儀器檢測(cè)到，熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物數(shù)量完全同步（如圖2）。請(qǐng)據(jù)圖回答：圖1(1)結(jié)合圖1和圖2分析，“熒光RTPCR技術(shù)”所用的試劑盒中通常都應(yīng)含酶、酶、TaqMan探針、引物、dNTP、Mg2+、緩沖劑系等。這種分子層面的熒光RTPCR檢測(cè)具有特異性和靈敏性都很高的特點(diǎn)，主要與試劑盒中的、有關(guān)。(2)根據(jù)TaqMan探針功能分析，探針中堿基序列的設(shè)計(jì)應(yīng)主要依據(jù)，探針的（填“5’”或“3’”）端連接R。新冠病毒是冠狀病毒大家庭中的新的一員，其堿基序列與引起SARS的冠狀病毒堿基序列有79.5%的相似性，與流感病毒堿基相似度也較高，因此在設(shè)計(jì)TaqMan探針時(shí)應(yīng)篩選出nCoV2019特有序列，以避免（填“假陰性”或“假陽(yáng)性”）的出現(xiàn)。(3)根據(jù)圖1和圖2，Taq酶的除了能催化DNA子鏈的延伸，還能。(4)若每分子探針?biāo)忉尫诺腞基團(tuán)熒光強(qiáng)度為定值a，則反應(yīng)體系中某時(shí)刻熒光信號(hào)強(qiáng)度（Rn）主要與、有關(guān)。聚焦“PCR技術(shù)”2姓名班級(jí)1.【情境素材】重疊延伸PCR技術(shù)是一項(xiàng)重要的基因定點(diǎn)突變技術(shù)，其主要設(shè)計(jì)思路是用具有互補(bǔ)配對(duì)片段的引物(圖中的引物2和3，突起處代表與模板鏈不能互補(bǔ)的突變位點(diǎn))，分別進(jìn)行PCR，獲得有重疊鏈的兩種DNA片段，再在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過(guò)重疊鏈的延伸獲得想要的目的基因。水蛭素是一種蛋白質(zhì)，可用于預(yù)防和治療血栓。某科研團(tuán)隊(duì)運(yùn)用重疊延伸PCR技術(shù)在水蛭素基因中的特定位點(diǎn)引入特定突變，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密碼子為AAC、AAU)替換為賴氨酸(密碼子為AAA、AAG)，從而提高水蛭素的抗凝血活性。原理見(jiàn)圖。（1）若擬突變位點(diǎn)的堿基對(duì)為A—T，則需要讓其突變?yōu)椴拍苓_(dá)到目的。引物2的突變位點(diǎn)(突起處)應(yīng)設(shè)計(jì)為(假設(shè)引物為單鏈DNA)。（2）在第一階段獲得兩種具有重疊片段DNA的過(guò)程中，引物1、引物2組成的反應(yīng)系統(tǒng)和引物3、引物4組成的反應(yīng)系統(tǒng)中均進(jìn)行一次復(fù)制，共產(chǎn)生______種DNA分子。該階段必須將引物1、2和引物3、4置于不同反應(yīng)系統(tǒng)中，其原因是什么？。（3）利用重疊延伸PCR技術(shù)還可以將兩個(gè)不同來(lái)源的DNA片段拼接起來(lái)。有人想利用該技術(shù)把基因M和N拼接在一起，設(shè)計(jì)基因M的引物M1、M2，基因N的引物N1、N2。在設(shè)計(jì)這4種引物時(shí)，特別要注意的問(wèn)題是什么？________________________________________________________________________。2.融合PCR技術(shù)是采用具有互補(bǔ)末端的引物，將不同來(lái)源的擴(kuò)增片段連接起來(lái)的方法，其過(guò)程如圖所示。（1）第一階段中PCR至少進(jìn)行次循環(huán)，才能獲得含引物2且雙鏈等長(zhǎng)的DNA，第二階段中兩DNA能成功"搭橋"連接的原因是。（2）若通過(guò)融合PCR技術(shù)將啟動(dòng)子、標(biāo)記基因、目的基因、終止子拼接起來(lái)，需要設(shè)計(jì)種引物，其中能夠起著"搭橋"作用的引物有種。第二階段融合擴(kuò)增時(shí)（填“需要”、“不需要”）再次添加引物。3.(1)實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)誘變時(shí),需要根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)兩常規(guī)引物和根據(jù)突變堿基序列所處位置設(shè)計(jì)兩個(gè)突變引物，圖中屬于突變引物的是，通過(guò)PCR1能得到大量產(chǎn)物AB,該過(guò)程需要加入引物，至少要經(jīng)過(guò)次復(fù)制可以得到產(chǎn)物AB。(2)用同樣的方法通過(guò)PCR2可以得到大量產(chǎn)物CD，然后取產(chǎn)物AB的上鏈和產(chǎn)物CD的下鏈再次進(jìn)行擴(kuò)增,即可得到突變產(chǎn)物AD，該過(guò)程是否需要加入引物？并說(shuō)明原因：。4.大引物PCR定點(diǎn)突變常用來(lái)研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致的功能變化。單核苷酸的定點(diǎn)誘變需進(jìn)行兩輪PCR反應(yīng)即可獲得，過(guò)程如圖所示。下列敘述不正確的是（）A.第一輪PCR過(guò)程中復(fù)性所用的溫度與第二輪PCR復(fù)性的溫度不一樣B.PCR擴(kuò)增的定點(diǎn)誘變產(chǎn)物通常需要連接到載體分子上才能表達(dá)出相應(yīng)的性狀,該定點(diǎn)誘變產(chǎn)物需具備啟動(dòng)子、終止子等結(jié)構(gòu)才能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯C.第二輪PCR所用的引物是第一輪PCR的產(chǎn)物DNA的兩條鏈D.將某功能蛋白的第17位Cys(UGU)改造成Ser(UCU)，屬于蛋白質(zhì)工程5.為減少引物與模板之間的非特異性配對(duì)，人們對(duì)普通PCR技術(shù)進(jìn)行改良，發(fā)明了巢式PCR，原理是利用兩套引物進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增。首先利用第一對(duì)引物（外引物）對(duì)目的基因所在的DNA進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，第二輪擴(kuò)增以第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，利用第二對(duì)引物（內(nèi)引物或巢式引物）結(jié)合在第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)部，經(jīng)過(guò)15～30次循環(huán)，獲得第二輪擴(kuò)增片段（即目的基因），最終第二輪擴(kuò)增片段短于第一輪，基本過(guò)程如圖所示。下列敘述錯(cuò)誤的是（）A．兩對(duì)引物的堿基序列不相同，但均應(yīng)為單鏈DNA片段B．使用外引物至少經(jīng)過(guò)3次循環(huán)，才能得到圖示的第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物C．若第一輪擴(kuò)增產(chǎn)生錯(cuò)誤片段，則其進(jìn)入第二輪擴(kuò)增的概率極低D．普通PCR與巢式PCR相比，特異性更強(qiáng)，錯(cuò)誤率更高7.反向PCR可用于擴(kuò)增未知序列，其原理如下圖所示。下圖鏈狀DNA分子內(nèi)側(cè)是已知序列，外側(cè)為未知序列。下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是（）A.PCR的原理是DNA半保留復(fù)制B.圖3中環(huán)狀DNA進(jìn)行PCR的過(guò)程中，沿引物A延伸子鏈的方向是逆時(shí)針C.PCR產(chǎn)物含有EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)D.PCR產(chǎn)物最終還是環(huán)狀DNA分子，包含已知序列的完整序列8.如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡(jiǎn)捷地分析出圖中片段F已知序列兩側(cè)的未知序列，具體流程如圖（以EoRI酶切為例），請(qǐng)據(jù)圖回答下列問(wèn)題：（1）步驟I用的EcoRI是一種酶，它通過(guò)識(shí)別（填“雙鏈DNA”或“RNA”）分子的特定的核苷酸序列，并且在特定位點(diǎn)進(jìn)行切割。（2）步驟Ⅱ連接，用的DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間的3′一羥基與5′—磷酸基團(tuán)間形成鍵；PCR循環(huán)中，升溫到90℃以上是為了獲得DNA單鏈，復(fù)性后延伸，延伸時(shí)TaqDNA聚合酶的作用是催化。（3）若下表所列為已知的DNA序列和設(shè)計(jì)的一些PCR引物，步驟Ⅲ擴(kuò)增，選用的PCR引物必須是（從引物①②③④中選擇，填編號(hào)）。已知序列DNA序列（虛線處省略了部分核酸序列）PCR引物①5′AACTATGCGCTCATGA3′②5′GCAATGCGTAGCCTCT3′③5′AGAGGCTACGCATTGC3′④5′TCATGAGCGCATAGTT3′9.油菜是我國(guó)重要的油料作物，黃籽油菜比黑籽油菜的含油量更高，色素積累更少，但我國(guó)主栽的甘藍(lán)型油菜缺乏天然的黃籽種質(zhì)資源。研究表明，TT8基因作為一個(gè)重要的基因參與了黃籽性狀的形成?？蒲腥藛T首次利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)甘藍(lán)型油菜中的BnaTT8基因進(jìn)行定點(diǎn)突變改造(如圖1)，PCR擴(kuò)增BnaTT8基因，構(gòu)建基因表達(dá)載體(如圖2)，再將重組質(zhì)粒通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入受體甘藍(lán)型油菜甲9707(J9707)中，創(chuàng)建甘藍(lán)型油菜黃籽突變體，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的BnaTT8基因突變可以顯著提高種子的含油量和蛋白質(zhì)含量，使得用甘藍(lán)型油菜種子生產(chǎn)的菜籽油的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高。請(qǐng)回答下列問(wèn)題。(1)圖1中向?qū)NA與BnaTT8基因按照________________原則特異性結(jié)合，Cas9蛋白切割BnaTT8基因使a鏈和互補(bǔ)鏈中的_____________斷裂，通過(guò)隨機(jī)增添、刪除或替換部分堿基對(duì)，獲得所需目的基因。(2)PCR擴(kuò)增目的基因的原理是_______________________，需要根據(jù)所需的BnaTT8基因設(shè)計(jì)引物，引物在DNA復(fù)制中的作用是___________________________________________________________。為保證BnaTT8基因正確插入質(zhì)粒中，需要在引物的________(填“3′端”或“5′端”)添加限制酶的識(shí)別序列。(3)圖2字母A～E表示不同限制酶的切割位點(diǎn)，構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，將BnaTT8基因插入________(填字母)處，目的是_______________________________________________________________________。重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞后，可在個(gè)體水平上通過(guò)___________________________________________來(lái)鑒定BnaTT8基因是否表達(dá)。(4)基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)強(qiáng)大的精確編輯植物基因組的能力，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)中的一個(gè)強(qiáng)有力的工具，科研人員在CRISPR/Cas9的基礎(chǔ)上進(jìn)行改造，開(kāi)發(fā)出了可以精準(zhǔn)實(shí)現(xiàn)多種堿基替換和大片段插入和刪除的基因編輯工具。請(qǐng)寫出CRISPR/Cas9及其改造的產(chǎn)品在科學(xué)研究中的應(yīng)用：__________________________________________________________________________(答出一點(diǎn)即可)。