DB12∕T 1006-2020 茄子黃萎病菌土壤帶菌 PCR 檢測技術(shù)規(guī)程

DB12TechnicalregulationofPCRdetectionforverticilliumdahliaeinsoil天津市市場監(jiān)督管理委員會發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：高葦、王勇、楊利娟、賁海燕、張春祥、劉曉琳、姚玉榮、王萬1茄子黃萎病菌土壤帶菌PCR檢測技術(shù)規(guī)程GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和GB/T36197-2018土壤質(zhì)量土壤采樣GB/T36199-2018土壤質(zhì)量土壤采樣程序茄子黃萎病菌verticilliumwiltofeg茄子黃萎病菌大麗輪枝菌（VerticilliumdahliaKleb.）可以侵染多種植物引起一種土傳的維管微菌核verticilliumwiltofe4.1主要儀器量0.1g和0.1mg）、電泳儀、4.2主要試劑2水飽和酚、三氯甲烷、液氮、異丙醇、無水乙醇、DNA熒光染料（GelRed）、Tris-HCl等。DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DNAMarker，能夠區(qū)分1），PCR反應(yīng)混合物：2×MasterMix:TaqDNA聚合酶，2×PCR反應(yīng)緩沖液，dNTP混合每個樣品設(shè)置3個重復(fù)3個平行，每個重復(fù)稱取1g土樣，取上清液，加入等體積水飽和酚，充分混勻后，4℃14000g取上清液，加入等體積的三氯甲烷:異戊醇（24:1），4℃14000g離心10min。繼續(xù)三氯甲烷:棄去上清液，70％冷乙醇，漂洗DNA沉淀2萎病菌1g土壤提取的DNA，陽性對照為含茄子黃萎病菌1g土壤提取的DNA空白對照為未加入DNA模3檢測判定完成后，土壤樣品保存方法按照GB/T36197-2018有關(guān)要求執(zhí)行。檢測判定過程及有關(guān)數(shù)4A.1病原及其分類地位從梗菌科（Moniliaceae），輪枝菌屬（Verticillium）。已報道的茄子黃萎病的病A.2病原特征辣椒等多200多種農(nóng)作物，其形成的微菌核在無寄主的土壤中可存活10年以上，是主要的初侵A.3癥狀及危害5Vd-ITS1-45-F：5’-CCGGTCCATCAGTCTCTCTG-3’Vd-ITS2-379-R：5’-ACTCCGATGCGAGCTGTAAC-3’引物序列：Vd-ITS1-45-F：5’-CCGGTCCATCAGTCTCTCTG-3’Vd-ITS2-379-R：5’-ACTCCGATGCGAGCTGTAAC-3’ 1ccggtccatcagtctctctgtttataccaacgatacttctgagtgttcttagcgaactat61taaaacttttaacaacggatctcttggctctagcatcgatgaagaacgcagcg121atatgtagtgtgaattgcagaattcaggaatcatcgaatctttgaacgcacatggcgcct181tccagtatcctgggaggcatgcctgtccgagcgtcgttt241ccggtgttggggatctacgtctgtaggcccttaaaagcagtggcggacccgcgtggccct301301tcctatgcgtagtagttacagctcgcatcggagt56℃退火1min，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；72℃延伸10體積(μL）EeraldAmpMaxPCRMasterMix（2×MasterMixCodeRR320）111PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后，在凝膠成像系統(tǒng)中檢測。觀察電泳結(jié)果（如