臨床檢驗(yàn)進(jìn)展及遺傳病檢測(cè)2011-9

臨床檢驗(yàn)進(jìn)展及遺傳病檢測(cè)

醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院

2011、9臨床檢驗(yàn)的常規(guī)項(xiàng)目1.血液一般檢查2.尿液一般檢查3.糞便檢查4.體液與分泌物檢查5.骨髓檢查及常用染色技術(shù)6.溶血檢查7.出凝血檢查8.血液流變學(xué)檢查

檢驗(yàn)這些項(xiàng)目的方法主要采用一些化學(xué)方法、免疫學(xué)方法等。近年來，許多分子生物學(xué)方法也開始應(yīng)用于臨床，對(duì)疾病的基因進(jìn)行檢測(cè)。血液學(xué)檢驗(yàn)血液學(xué)檢驗(yàn)的臨床意義

人體在某些生理情況下或發(fā)生疾病時(shí),?？梢鹧杭?xì)胞成分發(fā)生數(shù)量和質(zhì)量的變化。通過對(duì)血液中RBC、WBC、PLT數(shù)量和形態(tài)改變的檢驗(yàn),常有助于確定某些疾病的診斷,或可作為輔助診斷。故血液常規(guī)檢驗(yàn)在臨床上重要的臨床意義。特別是對(duì)疾病鑒別診斷提供重要臨床依據(jù)。臨床檢驗(yàn)的常規(guī)項(xiàng)目血細(xì)胞分析儀的發(fā)展20世紀(jì)50年代美國庫爾特首先發(fā)明了電阻式血細(xì)胞分析儀20世紀(jì)80年代Coulter公司又利用電阻、激光、高能電磁波等幾項(xiàng)技術(shù)共同檢測(cè)、綜合分析，使血細(xì)胞分析個(gè)更加準(zhǔn)確20世紀(jì)90年代初從細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行分析目前，半自動(dòng)血細(xì)胞分析儀在發(fā)達(dá)國家已經(jīng)被淘汰，取而代之的是全自動(dòng)分析儀臨床檢驗(yàn)的常規(guī)項(xiàng)目血細(xì)胞計(jì)數(shù)主要是采用血細(xì)胞分析儀，其主要原理：根據(jù)血細(xì)胞非傳導(dǎo)的性質(zhì)，在浸入電解質(zhì)的微孔管內(nèi)外各有一電極，兩電極形成電流，細(xì)胞經(jīng)過微孔的瞬間以引起電阻的變化為基礎(chǔ)，進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)和體積測(cè)定。A.正常紅細(xì)胞形態(tài)B口形紅細(xì)胞

血液檢驗(yàn)與疾病鑒別非血液系統(tǒng)疾病呼吸、消化、類白血病反應(yīng)、婦科血液系統(tǒng)疾病血友病、骨髓瘤等血液學(xué)檢驗(yàn)的進(jìn)展

隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和各學(xué)科的相互滲透，當(dāng)代的臨床血液學(xué)檢驗(yàn)已發(fā)生根本性變化。在檢驗(yàn)科室內(nèi)，它已經(jīng)是一個(gè)業(yè)務(wù)內(nèi)容廣泛、擁有大量自動(dòng)化精密儀器、由許多具備血液學(xué)基礎(chǔ)及臨床知識(shí)和嫻熟技術(shù)的人員組成的臨床專業(yè)科室。其業(yè)務(wù)內(nèi)容已擴(kuò)展到包括血細(xì)胞計(jì)數(shù)與形態(tài)學(xué)分析、紅細(xì)胞病理相關(guān)分析、白細(xì)胞病理相關(guān)分析以及血栓與止血相關(guān)分析等方面。

血細(xì)胞計(jì)數(shù)及形態(tài)學(xué)

應(yīng)用最新一代的血液分析儀，除全血細(xì)胞計(jì)數(shù)(CBC)項(xiàng)目和白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)以外：1.還可直接計(jì)數(shù)網(wǎng)織紅細(xì)胞，包括網(wǎng)織紅細(xì)胞血紅蛋白含量（CHr）和表示網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟程度的多項(xiàng)指標(biāo)。2.直接檢測(cè)有核紅細(xì)胞數(shù)，并可從白細(xì)胞總數(shù)中自動(dòng)扣除有核紅細(xì)胞，以及準(zhǔn)確計(jì)數(shù)血小板總數(shù)和計(jì)數(shù)大型血小板數(shù)等數(shù)十個(gè)參數(shù)。3.測(cè)定紅細(xì)胞比積（Hct）以及計(jì)算平均紅細(xì)胞體積（MCV）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量（MCH）和平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（MCHC）。紅細(xì)胞病理

分子生物學(xué)方法（如PCR、核酸分子雜交，基因或蛋白質(zhì)芯片技術(shù)等）取代生化方法檢測(cè)與遺傳有關(guān)的溶血性貧血和高鐵血紅蛋白血癥患者紅細(xì)胞內(nèi)各種酶的測(cè)定、異常血紅蛋白分析和紅細(xì)胞膜骨架蛋白等。

白細(xì)胞病理

存在的問題：血液分析儀還不能準(zhǔn)確辨認(rèn)各類幼稚細(xì)胞、原始細(xì)胞以及諸如中性粒細(xì)胞的“毒性”變化和“不典型淋巴細(xì)胞”等，必要時(shí)還必須在顯微鏡下進(jìn)行識(shí)別。外周血淋巴細(xì)胞，實(shí)際上是由T細(xì)胞、B細(xì)胞和自然殺傷（NK）細(xì)胞所構(gòu)成，其中T細(xì)胞還可再分成許多亞群。這些細(xì)胞在顯微鏡下也無法區(qū)分。

白細(xì)胞病理解決方案：采用特異的抗淋巴細(xì)胞分化抗原群（CD）單克隆抗體，建立免疫方法（如流式細(xì)胞術(shù)）進(jìn)行免疫表型檢測(cè)。細(xì)胞遺傳學(xué)（Cytogenetics,即染色體分析），形成了所謂“MIC”鑒別模式。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，又加入MICM模式。目前公認(rèn)的白血病分型標(biāo)準(zhǔn)是形態(tài)學(xué)-免疫學(xué)-細(xì)胞遺傳學(xué)-分子生物學(xué)即MICM分型。糞便檢驗(yàn)臨床檢驗(yàn)的常規(guī)項(xiàng)目糞便檢驗(yàn)及進(jìn)展常規(guī)方法目視檢查顯微鏡檢查糞便的化學(xué)檢查糞便的致病菌檢查其他糞便檢驗(yàn)臨床檢驗(yàn)的常規(guī)項(xiàng)目糞便隱血實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展隱血實(shí)驗(yàn)是指檢查胃腸道隱性出血的一類實(shí)驗(yàn)方法。傳統(tǒng)的隱血實(shí)驗(yàn)是利用血液中紅細(xì)胞的血紅蛋白的亞鐵血紅素具有類過氧化物酶作用，能分解H2O2為水和活性氧而設(shè)計(jì)的簡易化學(xué)實(shí)驗(yàn)。這類方法雖然成本低廉、簡單易行，但特異性差、靈敏度較低，易受食物及服用藥物成分的影響。為解決傳統(tǒng)隱血實(shí)驗(yàn)的特異性問題，探索出了一些新的實(shí)驗(yàn)方法，如放射性核素鉻（51Cr）法等放射性核素法和免疫學(xué)方法。糞便隱血實(shí)驗(yàn)放射性核素方法鉻（51Cr）法測(cè)定糞便隱血量：51Cr-紅細(xì)胞經(jīng)靜脈注射后，正常不進(jìn)入消化道，消化道出血時(shí)則進(jìn)入并不被吸收，隨大便排出。將糞便中的放射性與每毫升血液中放射性比較計(jì)算可求出胃腸道出血量。免疫學(xué)方法：是當(dāng)前發(fā)展最快也最有臨床實(shí)用價(jià)值的隱血實(shí)驗(yàn)方法。具有很好的靈敏度，很高的特異性。糞便隱血實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)方法用于糞便隱血實(shí)驗(yàn)的抗體主要有三類：一種為抗人血紅蛋白抗體，一種抗人紅細(xì)胞基質(zhì)抗體，另一種為抗血液中其他成分如Tf、Hb-Hp等?？谷搜t蛋白法或抗人紅細(xì)胞基質(zhì)的隱血試驗(yàn)是目前被認(rèn)為對(duì)大腸癌普查最適用的試驗(yàn)。糞便基因檢驗(yàn)的研究進(jìn)展近年來，大腸癌發(fā)病率有上升趨勢(shì)，而大腸癌的癥狀體征均無特異性，致使臨床上確診的大腸癌大部分為中、晚期，臨床治療效果差。五年生存率極低。如能早期診斷出大腸癌，可使90%以上的患者得到治愈。大腸癌的診斷方法：大便隱血實(shí)驗(yàn)、纖維結(jié)腸鏡檢查、腫瘤標(biāo)記物檢查和基因檢測(cè)。糞便基因檢驗(yàn)的研究進(jìn)展大便隱血實(shí)驗(yàn)是大腸癌的篩選檢查纖維結(jié)腸鏡檢查是檢出大腸癌的可靠方法腫瘤標(biāo)記物檢查，雖然對(duì)大腸癌的臨床診斷及預(yù)后判斷有幫助，但對(duì)早期大腸癌診斷的特異性及敏感性均不高。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，糞便中基因檢測(cè)可望成為篩選診斷大腸癌的新方法。（脫落細(xì)胞）糞便基因篩檢的分子生物學(xué)基礎(chǔ)分子生物學(xué)研究表明，腫瘤的產(chǎn)生是多能干細(xì)胞像正常細(xì)胞增殖、分化的過程中，受環(huán)境因素和遺傳因素的影響，相關(guān)基因改變的結(jié)果。腫瘤細(xì)胞的基因與基因表達(dá)與正常細(xì)胞有顯著區(qū)別，因此如能檢出這種基因改變就能為腫瘤的診斷和預(yù)防提供條件。與大腸癌相關(guān)的癌基因有ras、c-myc、-erb2等，與大腸癌相關(guān)的抑癌基因主要有APC/MCC、DCC、P53及RB等。糞便基因突變檢測(cè)的方法免疫組織化學(xué)檢測(cè)Southern印跡雜交DNA直接測(cè)序PCR產(chǎn)物單鏈DNA泳動(dòng)變位技術(shù)和錯(cuò)配PCR糞便檢驗(yàn)的新思路基因芯片技術(shù)是一種高度集成的基因探針雜交技術(shù)。它既承襲了DNA探針雜交技術(shù)的高特異性，又具備了同時(shí)檢測(cè)多靶基因的實(shí)驗(yàn)高通量的特點(diǎn)。雖然有很好的優(yōu)越性，目前還沒有應(yīng)用到臨床糞便檢驗(yàn)。色質(zhì)譜分析是利用混合物中各組分的質(zhì)量與所帶電荷的比值不同而實(shí)現(xiàn)組分分離的分離技術(shù)。目前還沒有利用色質(zhì)譜法大量讀取糞便醫(yī)用信息的報(bào)道，但國內(nèi)的許多學(xué)者以及開始了利用色譜法和質(zhì)譜法進(jìn)行糞便藥動(dòng)學(xué)研究、糞便毒物代謝研究甚至疾病的診斷探索。遺傳病檢測(cè)遺傳病臨床基因診斷的意義在我國，出生缺陷調(diào)查提示各種先天性缺陷與遺傳病約占13%。由于對(duì)這些疾病基本上沒有特異性治療手段，因此預(yù)防患者出生成為現(xiàn)階段對(duì)付這些疾病的主要方法，尤其在我國，對(duì)遺傳病高危群體進(jìn)行孕期產(chǎn)前基因診斷，對(duì)于提高人口素質(zhì)，落實(shí)優(yōu)生的基本國策具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。攜帶者的檢出最為重要。

遺傳病臨床基因診斷的分類1.臨癥診斷：直接對(duì)特定遺傳病患者的致病基因進(jìn)行檢測(cè)，判斷被檢基因是否存在異常。如地中海貧血患者的基因診斷。2.癥狀前診斷：由于并不是所有的遺傳病患者出生時(shí)即有相關(guān)臨床表現(xiàn)，這是針對(duì)某些遲發(fā)性遺傳病家系高危個(gè)體進(jìn)行的一種基因診斷。這在動(dòng)態(tài)突變類遺傳病中應(yīng)用最廣泛，如遺傳性小腦脊髓性共濟(jì)失調(diào)。3.產(chǎn)前診斷：是預(yù)防遺傳病患兒出生最有效的方法。由于大多數(shù)遺傳病在出生前均無特異性的臨床表現(xiàn)，生化檢查又難以進(jìn)行，因此通過獲得胎兒細(xì)胞中的遺傳物質(zhì)進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷是目前唯一可行的辦法。如進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良癥?；蛟\斷在遺傳病中的發(fā)展傳統(tǒng)的疾病診斷曾歷經(jīng)過三個(gè)階段：一是臨床學(xué)診斷，二是血清學(xué)診斷，三是生物化學(xué)診斷。而這些診斷都是以疾病的表型改變?yōu)橐罁?jù)的。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及其在疾病研究中的廣泛應(yīng)用，特別是在遺傳病的研究中的應(yīng)用，又興起了第四代診斷技術(shù)—基因診斷技術(shù)?；蛟\斷在遺傳病中的發(fā)展遺傳病是指遺傳物質(zhì)發(fā)生突變所引起的疾病?？煞譃槿箢悾簡位虿《嗷虿∪旧w病基因診斷在遺傳病中的發(fā)展基因診斷是以DNA和RNA為診斷材料，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，通過檢查基因的結(jié)構(gòu)及其表達(dá)功能來診斷疾病的方法和過程。基因突變的類型片段性突變（大片段缺失、插入或倒位）染色體片段如染色體病整個(gè)基因數(shù)個(gè)外顯子倒位點(diǎn)突變單核苷酸取代少數(shù)核苷酸缺失或插入動(dòng)態(tài)突變多態(tài)性三核苷酸重復(fù)序列的擴(kuò)增基因診斷的途徑如果某種遺傳病是由于基因缺失造成的，可通過檢測(cè)受檢者是否缺失該基因來直接判斷其基因型。如果致病突變或病因還不清楚，但有與其緊密連鎖的多態(tài)性位點(diǎn)，通過該位點(diǎn)狀態(tài)的連鎖分析進(jìn)行檢測(cè)。不同類型的突變有不同的診斷途徑：1.突變已知時(shí)用直接檢測(cè)法—突變檢測(cè)2.突變未知或突變已知但突變類型較多時(shí)用間接診斷法—多態(tài)性連鎖分析基因診斷的途徑一、直接檢測(cè)法是指直接檢測(cè)基因的致病突變，因此其前提是被檢致病基因的正常序列和結(jié)構(gòu)已被闡明。基因診斷的途徑二、多態(tài)性連鎖分析連鎖是指同一條染色體上和致病基因相鄰近的基因一起被遺傳，可以作為遺傳標(biāo)記，這樣只要鑒定標(biāo)記的存在，就可以判斷受檢者是否帶有致病基因。

基因診斷的途徑典型的連鎖分析包括以下程序：確定分析方法首選PCR方法，檢測(cè)RFLP和缺失的Southern印跡方法已被PCR產(chǎn)物的酶切法或多重PCR取代。選擇合適的多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)多態(tài)性分析多家系核心成員（父母及先癥者）及待測(cè)個(gè)體進(jìn)行多態(tài)性分析，確定標(biāo)記位點(diǎn)的基因型分析、判斷并解釋得到的結(jié)果分析、判斷并解釋多得到的結(jié)果

首先根據(jù)孟德爾定律遺傳模式，通過核心家系成員的多態(tài)性資料，確定父源或母源等位基因的標(biāo)記，即確定致病基因與標(biāo)記點(diǎn)等位片段的連鎖相，然后根據(jù)待測(cè)個(gè)體獲得的父源或及母源標(biāo)記等位基因確定其是否攜帶致病基因。進(jìn)行間接診斷必備的先決條件家系中的關(guān)鍵成員（父母）為標(biāo)記位點(diǎn)雜合子，這樣才能區(qū)分兩條同源染色體。子代中存在患病的純合子，這樣才能確定致病基因與哪條染色體的標(biāo)記位點(diǎn)共同遺傳。任何一種遺傳病，單獨(dú)使用一種多態(tài)性位點(diǎn)，均有相當(dāng)一部分父母的染色體無法區(qū)別。需要聯(lián)合使用多種標(biāo)記位點(diǎn)，以提高診斷率。受檢的親代必須為生物意義上的親代?；蛲蛔兊臋z測(cè)技術(shù)點(diǎn)突變的檢測(cè)片段性突變的檢測(cè)動(dòng)態(tài)突變的檢測(cè)點(diǎn)突變的檢測(cè)已知點(diǎn)突變的檢測(cè)與PCR相關(guān)的技術(shù)以核苷酸探針雜交為基礎(chǔ)的技術(shù)以核苷酸探針雜交為基礎(chǔ)的技術(shù)

等位基因特異性寡核苷酸雜交（ASO雜交）DNA芯片技術(shù)點(diǎn)突變檢測(cè)未知點(diǎn)突變的篩選方法變性梯度凝膠電泳（DGGE）單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）雙脫氧指紋分析(ddF)異源雙鏈體分析（HA）化學(xué)切割法（CCA）酶促錯(cuò)配切割（EMC）蛋白截短測(cè)試（PTT）變性高效液相色譜分析（DHPLC）DNA序列測(cè)定片段性突變檢測(cè)Southern印跡雜交多重PCR動(dòng)態(tài)突變的檢測(cè)動(dòng)態(tài)基因的致病等位基因的片段擴(kuò)展較大，可以用PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，但這些三核苷酸序列富含CG，擴(kuò)增條件與常規(guī)PCR不同，需要添加7-deazadGTP或DMSO，并須適當(dāng)提高復(fù)性溫度。有些動(dòng)態(tài)突變的異?；蚱溟L度已經(jīng)超過PCR最佳擴(kuò)增長度，信號(hào)顯示很弱，需要PCR產(chǎn)物電泳后，用重復(fù)單元的多聚體為探針進(jìn)