《乳酸脫氫酶同工酶的分離》講授課件

實(shí)驗(yàn)12

乳酸脫氫酶同工酶的分離2003年4月14日宣布人類基因組序列圖完成這標(biāo)志著進(jìn)入了后基因組時(shí)代。人類基因組：指DNA分子所攜帶的全部遺傳信息。蛋白質(zhì)組：生物個(gè)體表達(dá)的蛋白質(zhì)分子的總和。主要是對蛋白質(zhì)功能的研究.蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，是細(xì)胞內(nèi)含量最高的有機(jī)化和物。對蛋白質(zhì)的研究有助于人們對生命過程的認(rèn)識(shí)和理解。所以需要從細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)進(jìn)行研究。怎樣提取蛋白質(zhì)呢？1.了解同工酶的概念，進(jìn)行乳酸脫氫酶同工酶的分離。2.認(rèn)識(shí)電泳法分離生物大分子的基本原理，嘗試蛋白質(zhì)的電泳分離。（1）概念：

同工酶來源于同一個(gè)體或組織，能催化統(tǒng)一反應(yīng)，而蛋白結(jié)構(gòu)不同的酶。廣義是指生物體內(nèi)催化相同反應(yīng)而分子結(jié)構(gòu)不同的酶。（2）種類：

乳酸脫氫酶目前發(fā)現(xiàn)有五種同工酶，它們都能催化乳酸脫氫產(chǎn)生丙酮酸，分別是LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5根據(jù)五種同工酶分子結(jié)構(gòu)以及理化性質(zhì)的不同PI各不相同，在同一SDS中，在電場中移動(dòng)速度不同，可用電泳法將其分離。（3）生理及臨床意義：a.在代謝調(diào)節(jié)上起著重要的作用。b.用于解釋發(fā)育過程中階段特有的代謝特征。c.同工酶譜的改變有助于對疾病的診斷。d.同工酶可以作為遺傳標(biāo)志，用于遺傳分析研究。是由單體丙烯酰胺（Acr）和交聯(lián)劑N，N，-亞甲基丙烯酰胺（Bis）在催化劑過硫酸銨（AP）和加速劑N，N，，N，-四甲基乙二胺（TEMED）作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。TEMED催化AP生成硫酸自由基：以AP為催化劑，以TEMED為加速劑。（1）原理：硫酸自由基的氧原子激活A(yù)cr單體并形成單體長鏈：Bis將單體長鏈間連成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)：（2）聚丙烯酰胺凝膠類型：1.連續(xù)系統(tǒng)：是指電泳系統(tǒng)采用相同孔徑的凝膠緩沖系統(tǒng)等條件下進(jìn)行區(qū)帶電泳，是利用蛋白質(zhì)分子的電荷效應(yīng)進(jìn)行分離，凝膠的分子篩效應(yīng)不明顯，一般只用于分離一些比較簡單的樣品，缺點(diǎn)是分辨力不高。2.不連續(xù)系統(tǒng)：是指使用不同孔徑的凝膠和不同緩沖體系的電泳方式在電泳分離過程中，由于濃縮膠的堆積作用，可使樣品在濃縮膠和分離膠的界面上先濃縮成一窄帶，對樣品進(jìn)行濃縮，然后在一定濃度或濃度梯度的凝膠上進(jìn)行分離，既存在電荷效應(yīng)，也有分子篩效應(yīng)。雖然制膠操作難度較大，但是它具有連續(xù)系統(tǒng)不可比擬的優(yōu)越性，分辨率高。不連續(xù)電泳的四個(gè)不連續(xù)性凝膠濃度的不連續(xù)性；緩沖液離子成分的不連續(xù)性；緩沖液PH梯度的不連續(xù)性；電位梯度的不連續(xù)性。（3）蛋白質(zhì)在凈電荷聚丙烯酰胺凝膠電泳中的分離因素：電荷因素：蛋白質(zhì)分子性狀和大小相同，所帶電荷性質(zhì)和數(shù)量不同分子大小：蛋白質(zhì)分子性狀和所帶電荷和數(shù)量相同，分子大小不同分子形狀：蛋白質(zhì)所帶電荷和數(shù)量相同，分子性狀不同（4）乳酸脫氫酶同工酶活性染色用活性染色對LDH進(jìn)行鑒定，將凝膠浸泡在活性染色液中，LDH與底物的反應(yīng)，用吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS）作為電子的中間載體，氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）作為最終電子受體，底物脫下的氫最后傳遞給NBT，NBT被還原后，產(chǎn)生藍(lán)紫色的不溶于水的物質(zhì)以對LDH定位。分離膠的制備濃縮膠的制備待分離樣品的處理加樣電泳染色1.分離膠制備成分蒸餾水凝膠液凝膠緩沖液10％APTEMED分離膠（下層）1.65ml2.0ml1.3ml50μl5μl搖勻，混勻，并用蒸餾水封住膠面，靜置凝合后，傾去水層，用細(xì)條濾紙吸干殘余水分。2.濃縮膠制備成分蒸餾水凝膠液凝膠緩沖液10％APTEMED分離膠（下層）1.40ml0.33ml0.25ml20μl5μl搖勻，混勻，將膠灌在分離膠之上，并用蒸餾水封住膠面，靜置凝合后，傾去水層，用細(xì)條濾紙吸干殘余水分3.制備電泳凝膠板。

依組裝電泳槽后，制備5ml分離膠倒入槽中。在膠的上端輕輕加入少量水，以防止生成膠的彎月面。待膠凝固后，小心倒出蒸餾水，再用濾紙吸凈殘留的水。將2ml濃縮膠倒入，插入數(shù)字，再加入少量水，待膠凝固后，小心倒出蒸餾水，再用濾紙吸凈殘留的水，拔出梳子。4.加樣。

取10μl血清，加入等體積40％蔗糖溶液，在離心管中混勻后，用移液器吸取15μl樣品，小心加入到凹槽中，每組一槽，組間進(jìn)行比較。也可取胎牛、小牛、老牛的血清比較同工酶相對百分含量的差別。5.電泳。

裝配好電泳裝置，打開電源將電流調(diào)至10mA，待樣品進(jìn)入分離膠時(shí)，改為20-25mA，當(dāng)溴酚藍(lán)前沿距下框1-2cm時(shí)，將電流調(diào)至0，關(guān)閉電源。6.染色。

配置LDH活性染液。電泳后，取出凝膠板，放在盛有染色液的培養(yǎng)皿中，在37℃水浴上保溫20-30min，可看出LDH同工酶呈現(xiàn)藍(lán)紫色區(qū)帶。注意事項(xiàng)1.封管要嚴(yán)，防止漏液。2.固定玻璃管要豎直。3.凝膠制備時(shí)：TEMED和AP要后加，加入后用玻璃棒緩慢勻速的混勻，避免有氣泡產(chǎn)生。4.配膠后立即灌膠。1.隨著人類跨入蛋白質(zhì)組時(shí)代，對蛋白質(zhì)的研究和應(yīng)用越來越深入，首先要做的一步是（）A.弄清各種蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)B.弄清各種蛋白質(zhì)的功能C.弄清各種蛋白質(zhì)的合成過程D.獲得高純度的蛋白質(zhì)D2.使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過程中，不同蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于（）A.電荷的多少B.分子的大小C.肽鏈的多少D.分子形狀的差異B3.電泳是指帶電粒子在電場的作用下向著與其所帶電荷（）的電極移