第十九章遺傳代謝性疾病的基因診斷

第十九章遺傳代謝性疾病的基因診斷“十一五”規(guī)劃教材全國高等醫(yī)藥教材建設(shè)研究會規(guī)劃教材第十九章遺傳代謝性疾病的基因診斷第三軍醫(yī)大學(xué)府偉靈黃慶主要內(nèi)容前言一、基因診斷技術(shù)二、遺傳代謝性疾病的基因診斷前言●細(xì)胞、組織、器官和機(jī)體的生存與功能維持都必須依賴不斷進(jìn)行的物質(zhì)代謝過程。●物質(zhì)代謝包括合成代謝及分解代謝兩個(gè)過程。●代謝性疾病是物質(zhì)代謝過程的紊亂，多為酶或蛋白異常所致?！窀鶕?jù)代謝性疾病的病因，可將其分為原發(fā)性和繼發(fā)性。一、代謝性疾病的分類二、代謝性疾病的診斷手段一、代謝性疾病的分類原發(fā)性代謝性疾?。河纸邢忍煨源x性疾病。是指當(dāng)編碼物質(zhì)代謝所需酶或蛋白的基因發(fā)生突變、不能合成或合成了無活性的產(chǎn)物時(shí)，就會導(dǎo)致有關(guān)代謝途徑不能正常運(yùn)轉(zhuǎn)，造成具有不同臨床表型的各種代謝缺陷病。繼發(fā)性代謝性疾病：繼發(fā)性代謝性疾病是由其它原發(fā)性疾病導(dǎo)致的代謝性疾病，如糖尿病導(dǎo)致的繼發(fā)性高脂血癥。二、代謝性疾病的診斷手段●過去：主要依靠與物質(zhì)代謝相關(guān)的各種酶的生物化學(xué)方面的診斷●現(xiàn)在：生化診斷+基因診斷基因診斷的概念基因診斷就是利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)方法,直接檢測基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)水平是否正常,從而對疾病作出診斷的方法?；蛟\斷的特點(diǎn)●針對性強(qiáng)●特異性高●靈敏度高●適用性強(qiáng)●診斷范圍廣第一節(jié)基因診斷技術(shù)一.DNA測序技術(shù)二.聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)三.毛細(xì)管電泳技術(shù)四.基因芯片技術(shù)一、DNA測序技術(shù)所有生物基因組序列的數(shù)據(jù)均來自DNA測序特點(diǎn):●穩(wěn)定簡便●自動化程度高●數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠●公認(rèn)為國際金標(biāo)準(zhǔn)雙脫氧鏈終止法原理:●測序基礎(chǔ)是以ddNTP為測序反應(yīng)的鏈終止劑●摻入到延伸鏈中的ddNTP可阻止后續(xù)ddNTP或dNTP的摻入示例：BigDye?Terminators●循環(huán)測序反應(yīng)擴(kuò)增到未端為BigDye?Terminators的一系列的核苷酸鏈。●循環(huán)測序反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)沉淀、洗滌和純化，從而去除多余的未反應(yīng)的BigDye?Terminators。●電泳與結(jié)果分析。焦磷酸測序技術(shù)原理:引物與模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶等4種酶的協(xié)同作用下，將每一個(gè)dNTP的聚合與一次熒光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測熒光的釋放和強(qiáng)度，以熒光信號的形式實(shí)時(shí)記錄模板DNA的核苷酸序列。ABDNAPolymeraseACCTTGAATTCGTCCTAGGA……GGATCTT……dNTPApyrase(d)NMPPPiATPATP-sulphurylaseLuciferaseLightCTGCTTAAAGTCAGTCAGTCAGTC基本流程：第1步一個(gè)特異性的測序引物和單鏈DNA模板結(jié)合，然后加入酶混合物(包括DNAPolymerase、ATPSulfurylase、Luciferase和Apyrase)和底物混合物(包括APS和Luciferin)?；玖鞒蹋旱?步向反應(yīng)體系中加入1種dNTP，如果它剛好能和DNA模板的下一個(gè)堿基配對，則會在DNA聚合酶的作用下，添加到測序引物的3’末端，同時(shí)釋放出一個(gè)分子的焦磷酸(PPi)。聚合酶(DNA)n+dNTP(DNA)n+1+PPi基本流程：第3步在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS結(jié)合形成ATP；在熒光素酶的催化下，生成的ATP又可以和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，同時(shí)產(chǎn)生可見光。通過CCD光學(xué)系統(tǒng)即可獲得一個(gè)特異的檢測峰，峰值高低則和相匹配的堿基數(shù)成正比。基本流程：第4步反應(yīng)體系中剩余的dNT