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文檔簡介
1T/CSBMEXXXX—XXXX人源微腫瘤PTC模型的通用要求本文件確定了人源微腫瘤PTC模型及其藥敏檢測操作程序和一般原則。本文件適用于利用人源微腫瘤PTC模型的基礎(chǔ)科研、抗腫瘤藥物研發(fā)、抗腫瘤藥敏檢測等方面。注:人源微腫瘤PTC模型適用于包括但不限于結(jié)直腸癌、胃癌癌、腦腫瘤、骨與軟組織肉瘤、口腔癌、腎癌、前列腺癌等實體腫瘤類型。藥物敏感向單藥、免疫單藥、新型藥物(例如溶瘤病毒、細胞藥物等)以及以上藥物的組合。研發(fā)機構(gòu)、臨床檢測機構(gòu)和相關(guān)公司的研究人員、2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文件,僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T38736—2020人類生物樣本保藏倫理要求GB/T37864-2019生物樣本庫質(zhì)量和能力通用要求中華人民共和國藥典中華人民共和國人類遺傳資源管理條例藥物臨床試驗質(zhì)量管理規(guī)范(GCP)3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1微腫瘤PTCPatient-derivedtumor-likecellcluster全稱患者來源類腫瘤組織細胞簇,是由患者來源腫瘤細胞、基質(zhì)細胞(包括成纖維細胞、肥大細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞、T細胞、B細胞等)在微腫瘤PTC專用培養(yǎng)基中低粘附培養(yǎng),自發(fā)聚集形成的具有一定3D結(jié)構(gòu)的細胞團,簡稱微腫瘤PTC。3.2知情同意Informedconsent有自主判斷能力的供體或其法定監(jiān)護人,在獲得并充分了解樣本和數(shù)據(jù)捐贈相關(guān)信息之后,供體所受到的風險最小,且沒有受到任何利誘或恐嚇等不當行為影響的前提下,自愿自主的捐贈個人生物樣本及其關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù),并與采集者/收集者共同簽署的文件。[來源:GB/T38736—2020]3.3微腫瘤PTC培養(yǎng)基PTCgrowthmedium適合特定腫瘤細胞體外懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基,此培養(yǎng)基能夠維持腫瘤細胞在體外的擴增培養(yǎng),并在一定時期內(nèi)保持多組分腫瘤基質(zhì)細胞(包括成纖維細胞、巨噬細胞、T細胞、B細胞、NK細胞、肥大細胞等)的存活。3.42T/CSBMEXXXX—XXXX3D細胞培養(yǎng)Three-dimensionalcellculture在特定培養(yǎng)基條件和培養(yǎng)容器中培養(yǎng)獲得具有3D結(jié)構(gòu)的細胞球體,此類培養(yǎng)能在一定程度上模擬體內(nèi)生長環(huán)境。3.5細胞活力Cellviability在培養(yǎng)的微腫瘤PTC中,保持細胞增殖、代謝活性的活細胞的數(shù)量或比例。4縮略語H&E蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosinstaining)PBS磷酸鹽緩沖液(Phosphatebufferedsaline)IHC免疫組織化學(Immunohistochemistry)PCR聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerasechainreaction)NK自然殺傷(Naturekiller)HER2人表皮生長因子受體2(Humanepidermalgrowthfactorreceptor2)LGR5富含亮氨酸重復序列的G蛋白偶聯(lián)受體5(Leucine-richrepeat-containingG-protein-coupledreceptor5)CEA癌胚抗原(Carcinoembryonicantigen)Ki67細胞增殖蛋白(Markerof(Kiel-67))SNP單核苷酸多態(tài)性(Singlenucleotidepolymorphism)CNV拷貝數(shù)變異(Copynumbervariant)HBSSHank’s平衡鹽溶液(Hank’sbalancedsaltsolution)HEPES4-羥乙基哌嗪乙磺酸(2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonicacid)ROCKRho相關(guān)激酶(Rho-associatedcoiled-coil-containingprotein)MAPK促分裂素原活化蛋白激酶(Mitogen-activatedproteinkinases)IL-15白細胞介素15(Interleukin-15)IL-2白細胞介素2(Interleukin-2)FGF成纖維細胞生長因子(Fibroblastgrowthfactor)EGF表皮生長因子(Epidermalgrowthfactor)MSP膜支架蛋白(Membranescaffoldprotein)VEGF血管內(nèi)皮生長因子(VascularendothelialgrowthfactorIGF胰島素生長因子(Insulin-likegrowthfactor)BDNF腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derivedneurotrophicfactor)HGF肝細胞生長因子(Hepatocytegrowthfactor)5人源微腫瘤PTC模型建立的一般流程5.1倫理要求人源微腫瘤PTC模型培養(yǎng)采用患者來源新鮮腫瘤組織,參照《中華人民共和國人類遺傳資源管理條例》應(yīng)當符合倫理原則。因此樣本采集前應(yīng)獲得腫瘤樣本供者的書面知情同意,明確供者和樣本收集雙方的利益和責任,知情同意的要求應(yīng)符合GB/T38736-2020中5.3的要求。腫瘤樣本提供者享有個人隱私權(quán),其個人隱私信息的保密和保護應(yīng)符合GB/T38736-2020中6的要求。3T/CSBMEXXXX—XXXX5.2腫瘤組織采集與送檢(a)樣本必須為含活的腫瘤細胞的、新鮮無污染的臨床腫瘤樣本。樣本采集需在手術(shù)室或無菌環(huán)境下進行,避免微生物污染。取樣過程需要患者在特定醫(yī)療機構(gòu)進行,并由具有相應(yīng)醫(yī)療資質(zhì)且接受過取樣操作培訓的醫(yī)護人員執(zhí)行取樣操作。(b)人源微腫瘤PTC模型培養(yǎng)需要從臨床樣本中獲取不少于105的活細胞數(shù)量,因此對于臨床采集樣本大小有明確的標準規(guī)定,要求不同類型樣本需滿足相應(yīng)樣本標準,具體標準參考附錄A。(c)實體腫瘤組織(手術(shù)樣本、內(nèi)鏡/穿刺等活檢樣本)在采集后立刻放置于含5mL特殊保存液(參考附錄B)的無菌保存管中。惡性腫瘤積液保存于無菌引流袋中。所有樣本均需在低溫(4℃-8℃)條件下保存和運輸,24小時內(nèi)送達實驗室進行培養(yǎng)操作。(d)對樣本采集、運輸過程均需進行詳細記錄,記錄應(yīng)符合GB/T37864-2019中A.3、B.3條,宜記錄的內(nèi)容包括但不限于運送方式、運送過程中的溫度,接受時溫度或溫度范圍、運送起止時間和日期。(e)樣本運輸過程應(yīng)注意防震、防摔和防泄漏,保護樣本不發(fā)生外源性污染的同時,避免樣本運輸過程中對環(huán)境造成生物污染。5.3人源微腫瘤PTC模型構(gòu)建、培養(yǎng)、鑒定以下所有操作均在無菌環(huán)境中進行。5.3.1樣本組織的清洗采集的實體腫瘤組織需在無菌操作臺中,用含有青霉素-鏈霉素的預(yù)冷的PBS緩沖液振蕩漂洗,以去除表面污濁。液體樣本無需此步驟。5.3.2樣本組織的消化以及單細胞懸液的制備實體腫瘤組織樣本需采用機械法和特制的組織解離液制備單細胞懸液,針對完成消化解離的實體樣本單細胞懸液,用100μm的濾網(wǎng)進行過濾收集細胞懸液,具體操作步驟見附錄C。針對液體樣本,直接采用Ficoll密度梯度法分離收集腫瘤細胞,再用100μm的濾網(wǎng)過濾細胞懸液,具體操作步驟見附錄C。5.3.3人源微腫瘤PTC模型的培養(yǎng)將過濾后的腫瘤組織單細胞以105個細胞/cm2的密度重懸于專用微腫瘤PTC培養(yǎng)基、并接種于低粘附孔板中,置于細胞培養(yǎng)箱(37℃,5%CO2)進行培養(yǎng),并每隔2-3天進行補液或者換液。細胞培養(yǎng)2-7天,顯微鏡明場視野下觀察腫瘤微球的形成情況。2-7天即可獲得自組裝的3D細胞微球(即微腫瘤PTC若7天內(nèi)始終無腫瘤微球形成則表明培養(yǎng)失敗。人源微腫瘤PTC模型構(gòu)建流程如圖1。人源微腫瘤PTC培養(yǎng)需采用特殊配置的無血清培養(yǎng)基,根據(jù)腫瘤細胞類型、多種基質(zhì)細胞的生物學特征,配置特定PTC培養(yǎng)基。培養(yǎng)基要求詳見附錄D。4T/CSBMEXXXX—XXXX圖1人源微腫瘤PTC模型構(gòu)建流程圖5.3.4人源微腫瘤PTC模型的鑒定見表1a光學顯微鏡明場視野下觀察PTC細胞微每例樣本必須檢測常規(guī)光學顯微鏡(放大倍b微球細胞活力不低于90%每例樣本必須檢測細胞活力檢測試劑盒等c大小、形狀、細胞核等必須保證PTC每例樣本必須檢測由具有相應(yīng)資質(zhì)的病理d每例樣本必須檢測“1101無菌檢查法”和“3301支原體檢測法”e根據(jù)模型應(yīng)用場景選擇性開展該此建議根據(jù)腫瘤類型以及模型應(yīng)用需要確定待f遺傳特征(包括SNP和CNV)存在一定差根據(jù)模型應(yīng)用場景選擇性開展該患者原始腫瘤樣本以及行全外顯子測序和轉(zhuǎn)錄5T/CSBMEXXXX—XXXX6人源微腫瘤PTC模型的藥物敏感性檢測(a)在PTC腫瘤微球形成后一周內(nèi)進行藥物敏感性實驗。(b)利用40μm濾網(wǎng)收集直徑大于40μm的PTC微球,按照30-50個PTC微球/孔鋪入96孔低粘附板中;(c)將含有抗腫瘤藥物的PTC培養(yǎng)基(藥物濃度依據(jù)研究需要)加到對應(yīng)的實驗孔中,每種藥物設(shè)置不少于3個復孔,且每次試驗均需設(shè)置未加藥對照組(也需設(shè)置不少于3個復孔)。采用具備高分辨率的光學顯微成像(放大倍數(shù)不低于40倍)系統(tǒng)獲取每孔中PTC微球的圖片。加藥前用顯微鏡觀察每孔樣本狀態(tài),并在顯微鏡下拍照。(d)將培養(yǎng)板置于細胞培養(yǎng)箱(37℃,5%CO2)中繼續(xù)培養(yǎng)。藥物處理7天后,再次通過顯微成像系統(tǒng)獲取每個孔中PTC微球圖片。(e)采用人工智能圖像識別系統(tǒng),分析加藥前和加藥后各培養(yǎng)孔中微腫瘤PTC面積的變化(PAi)來評估藥效(圖2)。(f)藥敏結(jié)果計算:根據(jù)加藥前后各孔位的微腫瘤PTC總的面積變化換算藥物對微腫瘤PTC的殺傷百分比,從而判斷藥物的敏感性結(jié)果。圖2微腫瘤PTC藥敏檢測體系藥效評估指標PAi其中公式中SAi是指一個孔中PTC的面積,n指復孔的數(shù)量,t0和t1是指時間點。(g)藥敏結(jié)果質(zhì)量控制:當陰性對照(即未加藥對照組)在第7天檢測時PAi<0.9(即未處理孔Day7細胞活力小于Day0表明微腫瘤PTC處于衰退期,則該樣本的該次藥敏檢測實驗結(jié)果均判定為無效。(h)藥敏結(jié)果判定:藥敏檢測結(jié)果呈現(xiàn)形式為殺傷百分比(依據(jù)PAi數(shù)值進行換算),依據(jù)實驗原理PAi在0~1時對應(yīng)藥物對細胞殺傷在100%~0%,PAi>1則表明藥物對細胞無任何殺傷(即耐藥)。參考臨床實體腫瘤療效評估標準RECISTv1.1(腫瘤縮小30%為治療緩解的標準)并結(jié)合PTC藥敏臨床研究結(jié)果設(shè)置藥物敏感性的CUT-OFF值為30%(即PAi數(shù)值0.7)。當PAi>0.7時(對應(yīng)腫瘤殺傷百分比<30%判定藥物為無效殺傷(即藥物不敏感);當PAi≤0.7時(對應(yīng)腫瘤殺傷百分比≥30%),判定藥物為有效殺傷(即藥物敏感)。7人源微腫瘤PTC模型的藥物敏感性檢測報告藥物敏感性檢測結(jié)束后,檢測機構(gòu)以紙質(zhì)版和電子版報告形式將檢測報告發(fā)送給患者或其醫(yī)師。檢測報告中應(yīng)當明確展示出質(zhì)檢結(jié)果,包含收樣情況、培養(yǎng)情況及微生物檢測結(jié)果。藥物敏感性測試實驗結(jié)果以百分數(shù)的形式呈現(xiàn),并以此劃分殺傷效率及敏感性區(qū)分。8數(shù)據(jù)管理宜結(jié)合人源微腫瘤PTC模型的使用目的制訂數(shù)據(jù)管理規(guī)范,至少應(yīng)包括取樣登記信息,組織細胞提供者的資料、腫瘤模型建立及鑒定、藥敏檢測結(jié)果等數(shù)據(jù)內(nèi)容及保存時間、數(shù)據(jù)管理與使用的權(quán)限及責任。詳細的臨床樣本數(shù)據(jù)管理可參照《藥物臨床試驗質(zhì)量管理規(guī)范》(GCP)中的數(shù)據(jù)管理部分內(nèi)容。9廢棄物管理在組織樣本獲取、人源微腫瘤PTC模型培養(yǎng)、藥物敏感性測試等操作過程中產(chǎn)生的生物醫(yī)學廢棄物,應(yīng)按照GB19489中7.19和GB/T38736中3.1的要求,遵循《醫(yī)療廢物管理條例》丟棄到指定地6T/CSBMEXXXX—XXXX點妥善處置。對于使用過的人源微腫瘤PTC模型或不合格的人源微腫瘤PTC模型須嚴格按照生物樣本處置與管理規(guī)范操作。7T/CSBMEXXXX—XXXX人源微腫瘤PTC培養(yǎng)樣本采集標準人源微腫瘤PTC培養(yǎng)樣本采集標準見表A.1。表A.111、離體30min內(nèi)切取并放入樣本保存23458T/CSBMEXXXX—XXXX人源微腫瘤PTC樣本保存液人源微腫瘤PTC樣本保存液見表B.1。表B.1PBS緩沖液、HBSS緩沖液、HEPES緩沖液、青霉素、鏈霉素、兩性霉素樣本保存液主要為支持組織樣本在體外的葡萄糖運輸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)合成,保9T/CSBMEXXXX—XXXX人源微腫瘤PTC培養(yǎng)單細胞懸液制備C.1組織解離液組織解離液配置見表C.1。表C.1HBSS緩沖液、膠原酶I、膠原酶II、膠利用酶溶液破壞細胞間質(zhì)即細胞和胞外基質(zhì)間的蛋白連接,釋放組織樣本的細胞間質(zhì)對細胞的支C.2單細胞懸液制備操作以下操作均在無菌條件下進行:C.2.1實體組織樣本單細胞懸液制備如下:1)組織樣本放入10cm細胞培養(yǎng)皿中,用預(yù)冷且含有抗生素的5~10mLPBS或HBSS洗滌2-3次,棄去上清;2)在無菌操作臺中,用眼科剪除去多余脂肪及結(jié)締組織,再將樣本機械剪碎成體積小于0.5mm3的小塊;3)加入組織解離液(根據(jù)組織樣本大小確定用量),充分吹散混勻組織小塊;4)將組織樣本液轉(zhuǎn)移到15mL離心管中,37℃恒溫箱孵育0.5-2小時;5)孵育期間每15分鐘輕輕吹打混合,充分釋放組織樣本中的細胞,孵育時間僅供參考(具體時間應(yīng)以消化過程中組織細胞離散程度來確定,因此在處理過程中需緊密觀察);6)鏡下見大量細胞從組織塊上脫落下來成為單細胞懸浮狀態(tài)時,即加入細胞培養(yǎng)基終止樣本處理;7)將處理好的單細胞懸液,用100μm的濾網(wǎng)過濾,隨后在4℃、300g條件下離心10分鐘收集細胞,用培養(yǎng)基重懸,完成單細胞懸液制備。C.2.2惡性積液樣本的單細胞懸液制備如下:1)惡性積液在4℃、300g條件下離心5分鐘,用PBS重懸細胞沉淀;2)輕輕地將細胞懸液加入淋巴細胞分離液(Ficoll)中,4℃、400g條件下離心20分鐘,并降速設(shè)置為0;3)移走上層液體后,小心收集中間細胞層轉(zhuǎn)入新的無菌離心管中,4℃、300g條件下離心5分鐘;4)去上清后,加入培養(yǎng)基重懸細胞;5)將處理好的單細胞懸液,用100μm的濾網(wǎng)過濾,隨后在4℃、300g條件下離心10分鐘收集細胞,用培養(yǎng)基重懸,完成單細胞懸液制備。T/CSBMEXXXX—XXXX人源微腫瘤PTC培養(yǎng)基D.1人源微腫瘤PTC培養(yǎng)基配置見表D.1。表D.1培養(yǎng)基一(引自專利CN112760281B、CN112基礎(chǔ)培養(yǎng)基:AdvancedDMEM/F1HEPES(終濃度:8-12mM)、GlutaMax(終濃度:0.8-1.2%,%表示體積百分含量)、人重組蛋白A83-01(終濃度:0.25-1.25μM)、N-乙酰-L-半胱氨酸(終濃度:0.5-2mM)、N-2Supplement培養(yǎng)基二(引自專利CN112760282B、CN112基礎(chǔ)培養(yǎng)基:AdvancedDMEM/F1HEPES(終濃度:8-12mM)、GlutaMax(終濃度:0.8-1.2%,%表示體積百分含量)、人重組蛋白基礎(chǔ)培養(yǎng)基:AdvancedDMEM/F1表示體積百分含量)、人重組蛋白EGF(終濃度:10-100ng/mL)、人重組蛋白bFGF(終濃度:基礎(chǔ)培養(yǎng)基:AdvancedDMEM/F1HEPES(終濃度:8-12mM)、GlutaMax(終濃度:0.8-1.2%,%表示體積百分含量)、非必需氨基酸溶液(終濃度:0.8-1.2%,%表示體積百分含量)、人人重組蛋白bFGF(終濃度:10-50ng/mL)、人重組蛋白HGF(5-25ng/mL)、人重組蛋白FGF-10(終100-200ng/mL)、人重組蛋白R-spondin(終濃度:250SB202190(終濃度:5-10μM)、AB3-01(終濃度:0.25-1.25μM)、PrimocinT/CSBMEXXXX—XXXX基礎(chǔ)培養(yǎng)基:AdvancedDMEM/F1人FGF-10(終濃度:5-25ng/mL)、人Wnt-3a(終濃度:200-300ng/mL)、人Noggin(終濃度:L-丙氨酰(終濃度:0.08-0.12mM)、L-天冬酰胺(終濃度:0.08-0.12mM)、L-天冬氨酸(終濃度:0.08-0.12mM)、L-谷氨酸(終濃度:0.08-0.12mM)、L-L-絲氨酸(終濃度:0.08-0.12mM)、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(終濃度:1.6-2.4mM)、N-2(終濃度:0.8-1.2%,%表示體積百分含量)、B27(終濃度:1.5-2.5%,%表示體積百分含量)、ITS-X(終濃度:0.8-1.2%,%表示體積百分含量)、青霉素(終濃度:100-200U/mL)、鏈霉素(終濃度:100-200μg/mL)、兩性霉素B(200-250ng/mL)、Primocin(終濃度:10-100μg/m基礎(chǔ)培養(yǎng)基:AdvancedDMEM/F1(終濃度:5-20μM)、二氫睪酮(終濃度:1-10nM)、前列腺素E2(終濃度:1-10nM)、ITS-X(終濃度:0.8-1.2%,%表示體積百分含量)、青霉素(終濃度:100-200U/mL)、鏈霉素(終濃度:100-200μg/mL)、兩性霉素B(200-250ng/mL)、Primocin(終濃度:10-10基礎(chǔ)培養(yǎng)基:AdvancedDMEM/F1度:0.5-2mM)、煙堿(終濃度:5-10mM)、N-2(終濃度:1%,%表示體積百分含量)、霍亂毒素(終濃度:0.1-1mM)、B27(終濃度:1.5-2.5%,%表示體積百分含量)、ITS-X(終濃度:0.8-1.2%,%表示體積百分含量)、Y-27632(終濃度:5-基礎(chǔ)培養(yǎng)基:AdvancedDMEM/F1濃度:0.8-1.2%,%表示體積百分含量)、人EGF(終濃度:10-100ng/mL)、人bFGF(終濃度:量)、Y276
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