征求意見(jiàn)稿-人源微腫瘤PTC模型的要求

1T/CSBMEXXXX—XXXX人源微腫瘤PTC模型的通用要求本文件確定了人源微腫瘤PTC模型及其藥敏檢測(cè)操作程序和一般原則。本文件適用于利用人源微腫瘤PTC模型的基礎(chǔ)科研、抗腫瘤藥物研發(fā)、抗腫瘤藥敏檢測(cè)等方面。注：人源微腫瘤PTC模型適用于包括但不限于結(jié)直腸癌、胃癌癌、腦腫瘤、骨與軟組織肉瘤、口腔癌、腎癌、前列腺癌等實(shí)體腫瘤類型。藥物敏感向單藥、免疫單藥、新型藥物（例如溶瘤病毒、細(xì)胞藥物等）以及以上藥物的組合。研發(fā)機(jī)構(gòu)、臨床檢測(cè)機(jī)構(gòu)和相關(guān)公司的研究人員、2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T38736—2020人類生物樣本保藏倫理要求GB/T37864-2019生物樣本庫(kù)質(zhì)量和能力通用要求中華人民共和國(guó)藥典中華人民共和國(guó)人類遺傳資源管理?xiàng)l例藥物臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理規(guī)范(GCP)3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1微腫瘤PTCPatient-derivedtumor-likecellcluster全稱患者來(lái)源類腫瘤組織細(xì)胞簇，是由患者來(lái)源腫瘤細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞（包括成纖維細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等）在微腫瘤PTC專用培養(yǎng)基中低粘附培養(yǎng)，自發(fā)聚集形成的具有一定3D結(jié)構(gòu)的細(xì)胞團(tuán)，簡(jiǎn)稱微腫瘤PTC。3.2知情同意Informedconsent有自主判斷能力的供體或其法定監(jiān)護(hù)人，在獲得并充分了解樣本和數(shù)據(jù)捐贈(zèng)相關(guān)信息之后，供體所受到的風(fēng)險(xiǎn)最小，且沒(méi)有受到任何利誘或恐嚇等不當(dāng)行為影響的前提下，自愿自主的捐贈(zèng)個(gè)人生物樣本及其關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)，并與采集者/收集者共同簽署的文件。[來(lái)源：GB/T38736—2020]3.3微腫瘤PTC培養(yǎng)基PTCgrowthmedium適合特定腫瘤細(xì)胞體外懸浮培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基，此培養(yǎng)基能夠維持腫瘤細(xì)胞在體外的擴(kuò)增培養(yǎng)，并在一定時(shí)期內(nèi)保持多組分腫瘤基質(zhì)細(xì)胞（包括成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、肥大細(xì)胞等）的存活。3.42T/CSBMEXXXX—XXXX3D細(xì)胞培養(yǎng)Three-dimensionalcellculture在特定培養(yǎng)基條件和培養(yǎng)容器中培養(yǎng)獲得具有3D結(jié)構(gòu)的細(xì)胞球體，此類培養(yǎng)能在一定程度上模擬體內(nèi)生長(zhǎng)環(huán)境。3.5細(xì)胞活力Cellviability在培養(yǎng)的微腫瘤PTC中，保持細(xì)胞增殖、代謝活性的活細(xì)胞的數(shù)量或比例。4縮略語(yǔ)H&E蘇木精-伊紅（Hematoxylin-eosinstaining）PBS磷酸鹽緩沖液（Phosphatebufferedsaline）IHC免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry）PCR聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerasechainreaction）NK自然殺傷（Naturekiller）HER2人表皮生長(zhǎng)因子受體2（Humanepidermalgrowthfactorreceptor2）LGR5富含亮氨酸重復(fù)序列的G蛋白偶聯(lián)受體5（Leucine-richrepeat-containingG-protein-coupledreceptor5）CEA癌胚抗原（Carcinoembryonicantigen）Ki67細(xì)胞增殖蛋白（Markerof(Kiel-67)）SNP單核苷酸多態(tài)性（Singlenucleotidepolymorphism）CNV拷貝數(shù)變異（Copynumbervariant）HBSSHank’s平衡鹽溶液（Hank’sbalancedsaltsolution）HEPES4-羥乙基哌嗪乙磺酸（2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonicacid）ROCKRho相關(guān)激酶（Rho-associatedcoiled-coil-containingprotein）MAPK促分裂素原活化蛋白激酶（Mitogen-activatedproteinkinases）IL-15白細(xì)胞介素15（Interleukin-15）IL-2白細(xì)胞介素2（Interleukin-2）FGF成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Fibroblastgrowthfactor）EGF表皮生長(zhǎng)因子（Epidermalgrowthfactor）MSP膜支架蛋白（Membranescaffoldprotein）VEGF血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VascularendothelialgrowthfactorIGF胰島素生長(zhǎng)因子（Insulin-likegrowthfactor）BDNF腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（Brain-derivedneurotrophicfactor）HGF肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Hepatocytegrowthfactor）5人源微腫瘤PTC模型建立的一般流程5.1倫理要求人源微腫瘤PTC模型培養(yǎng)采用患者來(lái)源新鮮腫瘤組織，參照《中華人民共和國(guó)人類遺傳資源管理?xiàng)l例》應(yīng)當(dāng)符合倫理原則。因此樣本采集前應(yīng)獲得腫瘤樣本供者的書(shū)面知情同意，明確供者和樣本收集雙方的利益和責(zé)任，知情同意的要求應(yīng)符合GB/T38736-2020中5.3的要求。腫瘤樣本提供者享有個(gè)人隱私權(quán)，其個(gè)人隱私信息的保密和保護(hù)應(yīng)符合GB/T38736-2020中6的要求。3T/CSBMEXXXX—XXXX5.2腫瘤組織采集與送檢（a）樣本必須為含活的腫瘤細(xì)胞的、新鮮無(wú)污染的臨床腫瘤樣本。樣本采集需在手術(shù)室或無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行，避免微生物污染。取樣過(guò)程需要患者在特定醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)行，并由具有相應(yīng)醫(yī)療資質(zhì)且接受過(guò)取樣操作培訓(xùn)的醫(yī)護(hù)人員執(zhí)行取樣操作。（b）人源微腫瘤PTC模型培養(yǎng)需要從臨床樣本中獲取不少于105的活細(xì)胞數(shù)量，因此對(duì)于臨床采集樣本大小有明確的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，要求不同類型樣本需滿足相應(yīng)樣本標(biāo)準(zhǔn)，具體標(biāo)準(zhǔn)參考附錄A。（c）實(shí)體腫瘤組織（手術(shù)樣本、內(nèi)鏡/穿刺等活檢樣本）在采集后立刻放置于含5mL特殊保存液（參考附錄B）的無(wú)菌保存管中。惡性腫瘤積液保存于無(wú)菌引流袋中。所有樣本均需在低溫（4℃-8℃)條件下保存和運(yùn)輸，24小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行培養(yǎng)操作。（d）對(duì)樣本采集、運(yùn)輸過(guò)程均需進(jìn)行詳細(xì)記錄，記錄應(yīng)符合GB/T37864-2019中A.3、B.3條，宜記錄的內(nèi)容包括但不限于運(yùn)送方式、運(yùn)送過(guò)程中的溫度，接受時(shí)溫度或溫度范圍、運(yùn)送起止時(shí)間和日期。（e）樣本運(yùn)輸過(guò)程應(yīng)注意防震、防摔和防泄漏，保護(hù)樣本不發(fā)生外源性污染的同時(shí)，避免樣本運(yùn)輸過(guò)程中對(duì)環(huán)境造成生物污染。5.3人源微腫瘤PTC模型構(gòu)建、培養(yǎng)、鑒定以下所有操作均在無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行。5.3.1樣本組織的清洗采集的實(shí)體腫瘤組織需在無(wú)菌操作臺(tái)中，用含有青霉素-鏈霉素的預(yù)冷的PBS緩沖液振蕩漂洗，以去除表面污濁。液體樣本無(wú)需此步驟。5.3.2樣本組織的消化以及單細(xì)胞懸液的制備實(shí)體腫瘤組織樣本需采用機(jī)械法和特制的組織解離液制備單細(xì)胞懸液，針對(duì)完成消化解離的實(shí)體樣本單細(xì)胞懸液，用100μm的濾網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾收集細(xì)胞懸液，具體操作步驟見(jiàn)附錄C。針對(duì)液體樣本，直接采用Ficoll密度梯度法分離收集腫瘤細(xì)胞，再用100μm的濾網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液，具體操作步驟見(jiàn)附錄C。5.3.3人源微腫瘤PTC模型的培養(yǎng)將過(guò)濾后的腫瘤組織單細(xì)胞以105個(gè)細(xì)胞/cm2的密度重懸于專用微腫瘤PTC培養(yǎng)基、并接種于低粘附孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃,5%CO2）進(jìn)行培養(yǎng)，并每隔2-3天進(jìn)行補(bǔ)液或者換液。細(xì)胞培養(yǎng)2-7天，顯微鏡明場(chǎng)視野下觀察腫瘤微球的形成情況。2-7天即可獲得自組裝的3D細(xì)胞微球（即微腫瘤PTC若7天內(nèi)始終無(wú)腫瘤微球形成則表明培養(yǎng)失敗。人源微腫瘤PTC模型構(gòu)建流程如圖1。人源微腫瘤PTC培養(yǎng)需采用特殊配置的無(wú)血清培養(yǎng)基，根據(jù)腫瘤細(xì)胞類型、多種基質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)特征，配置特定PTC培養(yǎng)基。培養(yǎng)基要求詳見(jiàn)附錄D。4T/CSBMEXXXX—XXXX圖1人源微腫瘤PTC模型構(gòu)建流程圖5.3.4人源微腫瘤PTC模型的鑒定見(jiàn)表1a光學(xué)顯微鏡明場(chǎng)視野下觀察PTC細(xì)胞微每例樣本必須檢測(cè)常規(guī)光學(xué)顯微鏡(放大倍b微球細(xì)胞活力不低于90%每例樣本必須檢測(cè)細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒等c大小、形狀、細(xì)胞核等必須保證PTC每例樣本必須檢測(cè)由具有相應(yīng)資質(zhì)的病理d每例樣本必須檢測(cè)“1101無(wú)菌檢查法”和“3301支原體檢測(cè)法”e根據(jù)模型應(yīng)用場(chǎng)景選擇性開(kāi)展該此建議根據(jù)腫瘤類型以及模型應(yīng)用需要確定待f遺傳特征（包括SNP和CNV）存在一定差根據(jù)模型應(yīng)用場(chǎng)景選擇性開(kāi)展該患者原始腫瘤樣本以及行全外顯子測(cè)序和轉(zhuǎn)錄5T/CSBMEXXXX—XXXX6人源微腫瘤PTC模型的藥物敏感性檢測(cè)（a）在PTC腫瘤微球形成后一周內(nèi)進(jìn)行藥物敏感性實(shí)驗(yàn)。（b）利用40μm濾網(wǎng)收集直徑大于40μm的PTC微球，按照30-50個(gè)PTC微球/孔鋪入96孔低粘附板中；（c）將含有抗腫瘤藥物的PTC培養(yǎng)基（藥物濃度依據(jù)研究需要）加到對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)孔中，每種藥物設(shè)置不少于3個(gè)復(fù)孔，且每次試驗(yàn)均需設(shè)置未加藥對(duì)照組（也需設(shè)置不少于3個(gè)復(fù)孔）。采用具備高分辨率的光學(xué)顯微成像（放大倍數(shù)不低于40倍）系統(tǒng)獲取每孔中PTC微球的圖片。加藥前用顯微鏡觀察每孔樣本狀態(tài)，并在顯微鏡下拍照。（d）將培養(yǎng)板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃,5%CO2）中繼續(xù)培養(yǎng)。藥物處理7天后，再次通過(guò)顯微成像系統(tǒng)獲取每個(gè)孔中PTC微球圖片。（e）采用人工智能圖像識(shí)別系統(tǒng)，分析加藥前和加藥后各培養(yǎng)孔中微腫瘤PTC面積的變化（PAi）來(lái)評(píng)估藥效（圖2）。（f）藥敏結(jié)果計(jì)算：根據(jù)加藥前后各孔位的微腫瘤PTC總的面積變化換算藥物對(duì)微腫瘤PTC的殺傷百分比，從而判斷藥物的敏感性結(jié)果。圖2微腫瘤PTC藥敏檢測(cè)體系藥效評(píng)估指標(biāo)PAi其中公式中SAi是指一個(gè)孔中PTC的面積，n指復(fù)孔的數(shù)量，t0和t1是指時(shí)間點(diǎn)。（g）藥敏結(jié)果質(zhì)量控制：當(dāng)陰性對(duì)照（即未加藥對(duì)照組）在第7天檢測(cè)時(shí)PAi＜0.9（即未處理孔Day7細(xì)胞活力小于Day0表明微腫瘤PTC處于衰退期，則該樣本的該次藥敏檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均判定為無(wú)效。（h）藥敏結(jié)果判定：藥敏檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)形式為殺傷百分比（依據(jù)PAi數(shù)值進(jìn)行換算），依據(jù)實(shí)驗(yàn)原理PAi在0~1時(shí)對(duì)應(yīng)藥物對(duì)細(xì)胞殺傷在100%~0%，PAi＞1則表明藥物對(duì)細(xì)胞無(wú)任何殺傷（即耐藥）。參考臨床實(shí)體腫瘤療效評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)RECISTv1.1（腫瘤縮小30%為治療緩解的標(biāo)準(zhǔn)）并結(jié)合PTC藥敏臨床研究結(jié)果設(shè)置藥物敏感性的CUT-OFF值為30%（即PAi數(shù)值0.7）。當(dāng)PAi＞0.7時(shí)（對(duì)應(yīng)腫瘤殺傷百分比＜30%判定藥物為無(wú)效殺傷（即藥物不敏感）；當(dāng)PAi≤0.7時(shí)（對(duì)應(yīng)腫瘤殺傷百分比≥30%），判定藥物為有效殺傷（即藥物敏感）。7人源微腫瘤PTC模型的藥物敏感性檢測(cè)報(bào)告藥物敏感性檢測(cè)結(jié)束后，檢測(cè)機(jī)構(gòu)以紙質(zhì)版和電子版報(bào)告形式將檢測(cè)報(bào)告發(fā)送給患者或其醫(yī)師。檢測(cè)報(bào)告中應(yīng)當(dāng)明確展示出質(zhì)檢結(jié)果，包含收樣情況、培養(yǎng)情況及微生物檢測(cè)結(jié)果。藥物敏感性測(cè)試實(shí)驗(yàn)結(jié)果以百分?jǐn)?shù)的形式呈現(xiàn)，并以此劃分殺傷效率及敏感性區(qū)分。8數(shù)據(jù)管理宜結(jié)合人源微腫瘤PTC模型的使用目的制訂數(shù)據(jù)管理規(guī)范，至少應(yīng)包括取樣登記信息，組織細(xì)胞提供者的資料、腫瘤模型建立及鑒定、藥敏檢測(cè)結(jié)果等數(shù)據(jù)內(nèi)容及保存時(shí)間、數(shù)據(jù)管理與使用的權(quán)限及責(zé)任。詳細(xì)的臨床樣本數(shù)據(jù)管理可參照《藥物臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理規(guī)范》(GCP)中的數(shù)據(jù)管理部分內(nèi)容。9廢棄物管理在組織樣本獲取、人源微腫瘤PTC模型培養(yǎng)、藥物敏感性測(cè)試等操作過(guò)程中產(chǎn)生的生物醫(yī)學(xué)廢棄物，應(yīng)按照GB19489中7.19和GB/T38736中3.1的要求，遵循《醫(yī)療廢物管理?xiàng)l例》丟棄到指定地6T/CSBMEXXXX—XXXX點(diǎn)妥善處置。對(duì)于使用過(guò)的人源微腫瘤PTC模型或不合格的人源微腫瘤PTC模型須嚴(yán)格按照生物樣本處置與管理規(guī)范操作。7T/CSBMEXXXX—XXXX人源微腫瘤PTC培養(yǎng)樣本采集標(biāo)準(zhǔn)人源微腫瘤PTC培養(yǎng)樣本采集標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表A.1。表A.111、離體30min內(nèi)切取并放入樣本保存23458T/CSBMEXXXX—XXXX人源微腫瘤PTC樣本保存液人源微腫瘤PTC樣本保存液見(jiàn)表B.1。表B.1PBS緩沖液、HBSS緩沖液、HEPES緩沖液、青霉素、鏈霉素、兩性霉素樣本保存液主要為支持組織樣本在體外的葡萄糖運(yùn)輸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)合成，保9T/CSBMEXXXX—XXXX人源微腫瘤PTC培養(yǎng)單細(xì)胞懸液制備C.1組織解離液組織解離液配置見(jiàn)表C.1。表C.1HBSS緩沖液、膠原酶I、膠原酶II、膠利用酶溶液破壞細(xì)胞間質(zhì)即細(xì)胞和胞外基質(zhì)間的蛋白連接，釋放組織樣本的細(xì)胞間質(zhì)對(duì)細(xì)胞的支C.2單細(xì)胞懸液制備操作以下操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行：C.2.1實(shí)體組織樣本單細(xì)胞懸液制備如下：1)組織樣本放入10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，用預(yù)冷且含有抗生素的5~10mLPBS或HBSS洗滌2-3次，棄去上清；2)在無(wú)菌操作臺(tái)中，用眼科剪除去多余脂肪及結(jié)締組織，再將樣本機(jī)械剪碎成體積小于0.5mm3的小塊；3)加入組織解離液（根據(jù)組織樣本大小確定用量），充分吹散混勻組織小塊；4)將組織樣本液轉(zhuǎn)移到15mL離心管中，37℃恒溫箱孵育0.5-2小時(shí)；5)孵育期間每15分鐘輕輕吹打混合，充分釋放組織樣本中的細(xì)胞，孵育時(shí)間僅供參考（具體時(shí)間應(yīng)以消化過(guò)程中組織細(xì)胞離散程度來(lái)確定，因此在處理過(guò)程中需緊密觀察）；6)鏡下見(jiàn)大量細(xì)胞從組織塊上脫落下來(lái)成為單細(xì)胞懸浮狀態(tài)時(shí)，即加入細(xì)胞培養(yǎng)基終止樣本處理；7)將處理好的單細(xì)胞懸液，用100μm的濾網(wǎng)過(guò)濾，隨后在4℃、300g條件下離心10分鐘收集細(xì)胞，用培養(yǎng)基重懸，完成單細(xì)胞懸液制備。C.2.2惡性積液樣本的單細(xì)胞懸液制備如下：1)惡性積液在4℃、300g條件下離心5分鐘，用PBS重懸細(xì)胞沉淀；2)輕輕地將細(xì)胞懸液加入淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll）中，4℃、400g條件下離心20分鐘，并降速設(shè)置為0；3)移走上層液體后，小心收集中間細(xì)胞層轉(zhuǎn)入新的無(wú)菌離心管中，4℃、300g條件下離心5分鐘；4)去上清后，加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；5)將處理好的單細(xì)胞懸液，用100μm的濾網(wǎng)過(guò)濾，隨后在4℃、300g條件下離心10分鐘收集細(xì)胞，用培養(yǎng)基重懸，完成單細(xì)胞懸液制備。T/CSBMEXXXX—XXXX人源微腫瘤PTC培養(yǎng)基D.1人源微腫瘤PTC培養(yǎng)基配置見(jiàn)表D.1。表D.1培養(yǎng)基一（引自專利CN112760281B、CN112基礎(chǔ)培養(yǎng)基：AdvancedDMEM/F1HEPES（終濃度：8-12mM）、GlutaMax（終濃度：0.8-1.2%，%表示體積百分含量）、人重組蛋白A83-01（終濃度：0.25-1.25μM）、N-乙酰-L-半胱氨酸（終濃度：0.5-2mM）、N-2Supplement培養(yǎng)基二（引自專利CN112760282B、CN112基礎(chǔ)培養(yǎng)基：AdvancedDMEM/F1HEPES（終濃度：8-12mM）、GlutaMax（終濃度：0.8-1.2%，%表示體積百分含量）、人重組蛋白基礎(chǔ)培養(yǎng)基：AdvancedDMEM/F1表示體積百分含量）、人重組蛋白EGF（終濃度：10-100ng/mL）、人重組蛋白bFGF（終濃度：基礎(chǔ)培養(yǎng)基：AdvancedDMEM/F1HEPES（終濃度：8-12mM）、GlutaMax（終濃度：0.8-1.2%，%表示體積百分含量）、非必需氨基酸溶液（終濃度：0.8-1.2%，%表示體積百分含量）、人人重組蛋白bFGF(終濃度：10-50ng/mL)、人重組蛋白HGF（5-25ng/mL）、人重組蛋白FGF-10（終100-200ng/mL）、人重組蛋白R(shí)-spondin（終濃度：250SB202190（終濃度：5-10μM）、AB3-01（終濃度：0.25-1.25μM）、PrimocinT/CSBMEXXXX—XXXX基礎(chǔ)培養(yǎng)基：AdvancedDMEM/F1人FGF-10（終濃度：5-25ng/mL）、人Wnt-3a(終濃度：200-300ng/mL)、人Noggin（終濃度：L-丙氨酰（終濃度：0.08-0.12mM）、L-天冬酰胺（終濃度：0.08-0.12mM）、L-天冬氨酸（終濃度：0.08-0.12mM）、L-谷氨酸（終濃度：0.08-0.12mM）、L-L-絲氨酸（終濃度：0.08-0.12mM）、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（終濃度：1.6-2.4mM）、N-2（終濃度：0.8-1.2%，%表示體積百分含量）、B27（終濃度：1.5-2.5%，%表示體積百分含量）、ITS-X（終濃度：0.8-1.2%，%表示體積百分含量）、青霉素（終濃度：100-200U/mL）、鏈霉素（終濃度：100-200μg/mL）、兩性霉素B（200-250ng/mL）、Primocin（終濃度：10-100μg/m基礎(chǔ)培養(yǎng)基：AdvancedDMEM/F1（終濃度：5-20μM)、二氫睪酮（終濃度：1-10nM）、前列腺素E2（終濃度：1-10nM）、ITS-X（終濃度：0.8-1.2%，%表示體積百分含量）、青霉素（終濃度：100-200U/mL）、鏈霉素（終濃度：100-200μg/mL）、兩性霉素B（200-250ng/mL）、Primocin（終濃度：10-10基礎(chǔ)培養(yǎng)基：AdvancedDMEM/F1度：0.5-2mM）、煙堿（終濃度：5-10mM）、N-2（終濃度：1%，%表示體積百分含量）、霍亂毒素（終濃度：0.1-1mM）、B27（終濃度：1.5-2.5%，%表示體積百分含量）、ITS-X（終濃度：0.8-1.2%，%表示體積百分含量）、Y-27632（終濃度：5-基礎(chǔ)培養(yǎng)基：AdvancedDMEM/F1濃度：0.8-1.2%，%表示體積百分含量）、人EGF（終濃度：10-100ng/mL）、人bFGF（終濃度：量）、Y276