生物工程下游技術復習題及解答

、名詞解釋

1、連續(xù)培養(yǎng)反應器：不斷地往反應器中加入營養(yǎng)物，利用罐中的菌體增殖得到產(chǎn)物，并不

斷采出。在良好的控制下，罐內(nèi)菌體的增殖速度可以與采出速度相同而達到穩(wěn)態(tài)。

2、菌體比生長速率(u):單位濃度菌體在一定條件下引起的反應速率，其值反映了培養(yǎng)

菌體增長的能力，受菌株及各種物理化學環(huán)境的影響.表示為u=dx/x.dt

3、得率系數(shù)：兩種物質(zhì)得失之間的計量比。Yx/s,Yp/s

4、貼壁培養(yǎng)：貼壁依賴性細胞在培養(yǎng)中要貼附于壁上才能迅速鋪展，開始有絲分裂并迅速

進入對數(shù)生長期，這種培養(yǎng)方式就叫貼壁培養(yǎng).多數(shù)動物細胞的培養(yǎng)都采取這種方式.

5、蛋白質(zhì)的復性：包含體蛋白質(zhì)溶解于變性劑溶液中，呈變性狀態(tài)，所有的氫鍵、疏水鍵

全部被破壞，疏水側鏈完全暴露，但一級結構和共價鍵不被破壞，當除去變性劑后，一部

分蛋白質(zhì)可以自動折疊成具有活性的正確構型，這一折疊過程稱為蛋白質(zhì)復性。

6、濃差極化：指在分離過程中，料液中的溶劑在壓力驅動下透過膜，溶質(zhì)被截留，于是在

膜表面與臨近膜面區(qū)域濃度越來越高。在濃度梯度作用下，溶質(zhì)由膜面向本體溶液擴散，

形成邊界層，使流體阻力與局部滲透壓增加，從而導致溶劑透過量下降。溶劑向膜面流動

引起溶質(zhì)向膜面的流動，這種流動如果與濃度梯度所驅動的溶質(zhì)向本體溶液擴散的速度平

衡時，在膜面附近就形成一個穩(wěn)定的濃度梯度區(qū)，這一區(qū)域就稱為濃度極化邊界層，這一

現(xiàn)象稱為濃差極化。濃差極化是一個可逆的過程；

7、膜污染：物料中的微粒、膠體粒子或溶質(zhì)大分子由于與膜存在物理化學相互作用或機械

作用而引起的在膜表面或膜孔內(nèi)吸、沉積造成膜孔徑變小或堵塞，使膜產(chǎn)生透過流量與分

離特性的不可逆變化的現(xiàn)象。

8、排阻色譜(SizeexcIusionchromatography,SEC):又稱凝膠色譜或凝膠滲透色譜，

是利用被分離物質(zhì)分子量大小的不同和在填料上滲透程度的不同，以使組分分離。

9、分配色譜：是利用溶液中被分離物質(zhì)在兩相中分配系數(shù)不同，以使組分分離。其中一相

為液體，涂布或使之鍵合在固體載體上，稱固定相；另一相為液體或氣體，稱流動相。

10、有效柱長（有效遷移距離）：溶質(zhì)從開始遷移至其遷移速度等于流動相速度時，溶質(zhì)在

色譜柱上遷移的距離稱為有效遷移距離，也稱為有效柱長。

11、吸附等溫線：指在一定溫度下物質(zhì)分子在兩相界面上進行的吸附過程達到平衡時它們

在兩相中濃度之間的關系。

12、切向流過濾：就是一種維持恒壓下高過濾速度的技術，其原理就是：使懸浮液在過濾

介質(zhì)表面作切向流動，利用液體的剪切作用將介質(zhì)表面的固體移走，當移走固體與固體沉

積速率相同時，過濾速度就保持恒定，控制不同的切向流速度就可以得到不同的過濾速度。

（實際是維持了Rc）.目前幾乎所有的膜固液分離都采用切向流方式

13、包含體：存在于基因工程細胞中，主要由蛋白質(zhì)構成，其中大部分是克隆表達的產(chǎn)物，

一級結構正確，立體結構錯誤，沒生物學活性。難溶于水，只有在變性劑溶液中才能溶解。

15、雙水相萃?。豪帽惶崛∥镌诙嘀械姆峙洳煌鴮崿F(xiàn)分離的目的；由于蛋白質(zhì)在有

機相中容易失活，因此采用的二相均為親水相，如PEG/葡聚糖、PEG/無機鹽等，稱為

雙水相，兩相密度不同，輕相富含一種高分子，重相可能富含另一高分子，細胞碎片和蛋

白質(zhì)在二相間的分配系數(shù)不同，從而實現(xiàn)分離的目的。

16、反滲透：在高于溶液滲透壓的壓力作用下，只有溶液中的水透過膜，而所有溶液中的

大分子、小分子有機物及無機鹽全被截留。理想的反滲透膜應被認為是無孔的，它分離的

原理是溶解擴散（或毛細孔流學說）。

17、分配系數(shù)一定溫度下，組分在兩相間分配達到平衡時的濃度（單位：g/mL）比，稱

為分配系數(shù)，用K表示

18、色譜曲線基線：無試樣通過檢測器時，檢測到的信號即為基線。

19、保留時間（tR）:組分從進樣到柱后出現(xiàn)濃度極大值時所需的時間。

20、死時間（tM）:不與固定相作用的氣體（如空氣）的保留時間。

調(diào)整保留時間（tRtR'=tR-tM

21、容量因子k：平衡時，組分在各相中總的質(zhì)量比

23、排阻色譜：按分子大小分離。小分子可以擴散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；

中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子

小，故在最后出峰。

24、親和色譜：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進行選擇性分離。

25、正相色譜法：親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定相的極性，

極性柱也稱正相柱。

26、反相色譜：若流動相的極性大于固定液的極性，非極性柱也稱為反相柱。

27、非線性色譜:Cm與Cs不存在線性關系的色譜.

28、吸附等溫線：一定溫度下物質(zhì)分子在兩相界面上進行的吸附過程達到平衡時它們在兩

相中濃度之間的關系。

29、全交換容量:每克干介質(zhì)或每毫升濕介質(zhì)具有的功能基含量.是一個定值.

30、工作容量:每克干介質(zhì)或每毫升濕介質(zhì)在一定的操作條件下的交換吸附蛋白質(zhì)的實際容

量.是一個變值.

31、疏水性色譜：填料表面具有弱疏水性，蛋白質(zhì)的疏水基團與填料表面之間產(chǎn)生弱的疏水

性相互作用.高濃度的鹽條件下，蛋白質(zhì)與疏水固定相的吸附能力高，隨著鹽濃度的下降，吸

附能力下降.當淋洗液離子強度逐漸降低時，蛋白質(zhì)樣品按其疏水性的不同依次被洗脫.

32、徑向流色譜技術：即樣品和流動相沿徑向流動，可從色譜柱的周圍流向圓心，也可從圓

心流向柱的周圍.通常采用從柱的周圍流向圓心的方式.

33、泳動度(遷移率)：帶電質(zhì)點在單位強度電場下的泳動速度即：U=V/E=(d/t)/(V/L)

34、變性膠：膠電脈在蛋白質(zhì)變性的狀態(tài)下進行，主要指SDS變性條件下進生

45、非變性膠：電泳在蛋白質(zhì)保持天然狀態(tài)下進行，不加變性劑

37、線性色譜:樣品的濃度流動相中與固定相中之間是線性關系

38、生物過程動力學：定量地描述過程的速率以及影響過程速率的諸多因素.包括細胞生

長速率、各種基質(zhì)消耗的速率、代謝產(chǎn)物的生成速率。

39、懸浮培養(yǎng)：是指細胞在培養(yǎng)器中自由懸浮生長的過程.主要用于非貼壁依賴性細胞培

養(yǎng),如雜交瘤細胞等。

40、固定化培養(yǎng)：利用吸附或包埋等固定化的方式將細胞限制在一定的空間內(nèi)，然后以固

定化的顆粒進行懸浮培養(yǎng).該方法對貼壁性和非貼壁依賴性細胞都是適合的。

41、膜分離技術：以半透膜為選擇障礙層，允許某些組分透過而保留混合物中的其他組

分，從而達到分離目的的技術。

42、離子交換法：通過帶電的溶質(zhì)分子與離子交換劑中可交換離子進行交換而達到分離

純化的方法。主要依賴電荷間的相互作用，利用帶電分子中電荷的微小差異而進行分離。

43、肽譜：指蛋白質(zhì)被酶解或化學降解后肽段的分離分析或制備。

二、填空題

1、超聲波破碎細胞的效率與聲頻、聲能、處理時間、細胞濃度及細胞類型等因素有關。

2、目前用于固液分離的膜過濾法主要有以下三種：微孔過濾（微濾）、超濾、反滲透。

3、在生物工程下游技術領域，色譜和電泳是目前所知最好的兩種分離蛋白的方法。

4、在生物物質(zhì)分離中，可以依據(jù)一次進樣量多少，將色譜分為：分析色譜、半制備色譜

（中等規(guī)模制備色譜）、制備色譜和工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模色譜4大類。

5、無論是什么類型的液相或氣相色譜，其色譜裝置均應包括：流動相供給、進樣、色譜

柱、檢測器等四大部分。

6、在色譜過程中，有兩種將目標產(chǎn)品從色譜柱上洗脫下來的方法：一種是維持流動相熱

力學參數(shù)不變的等梯度洗脫法，另一種叫梯度洗脫法。

7、徑向色譜填料主要有：離子交換樹脂和親和色譜填料兩種。

8、評價HPLC色譜填料性能的主要表征指標包括：

保留值，選擇性，柱效率，填充柱的總空隙度和穿透性，分離度。

11、羥基磷灰石在原理上一般被認為是一種無機基質(zhì)高效色譜。

請列舉二種測量蛋白質(zhì)含量的方法：雙縮腺法，考馬斯藍法。

12、常見的無機色譜填料主要包括：多孔硅膠、可控孔徑玻璃、氧化鋁、氧化鈦、羥基磷

灰石以及碳和石墨等基質(zhì)。

13、無機HPLC填料最常見的是以多孔大硅膠為基本材料的填料；含硼的Na20-B203-Si02

系玻璃經(jīng)過熱處理引起相分離，生成可溶于酸的Na20-B203相及不溶于酸的高硅相。將酸

可溶相浸析出來后剩下的另一相就制成了可控孔徑玻璃，可控孔徑玻璃的主要化學成份就

是Si02。

17、根據(jù)離子交換樹脂官能團的性質(zhì)，將其分為（強酸型）、（弱酸型）、（強堿型）、（弱堿

型）、（鰲合型）、（兩性）及（氧化還原）等7類。

18.指出三種交聯(lián)葡聚糖的微載體：Cytodexl微載體；Cytodex2微載體；Cytodex3微載體

19.指出蛋白質(zhì)復性的三種方法：稀釋法，透析法，液相色譜法等

20.固液分離的主要方式包括：離心法，微孔膜過濾法，雙水相萃取，泡沫分離法。

21.膜的孔徑一般為微米級，依據(jù)其孔徑的不同（或稱為截留分子量），可將膜分為微濾膜、

超濾膜、納濾膜和反滲透膜

22色譜的保留值可以用保留時間也可以用保留體積來表示。

23.色譜的峰寬可以用半峰寬、峰底寬、標準偏差表示。

24.指出下列情況下色譜系統(tǒng)對容質(zhì)的柱效和分配系統(tǒng)差的關系：

①柱效較高，△!（較大，完全分離；

②柱效較高，△!（不是很大峰較窄，基本上完全分離；

③柱效較低，△!（較大，但分離的不好；

④柱效低，△!（小，分離效果更差。

25.線性色譜的吸附等溫線是直線，非線性色譜的吸附等溫線的形狀常見的有：凸形、凹

形、S形、H形、階梯形。從吸附等溫線的形狀可以預見色譜曲線的形狀，一般凸形的吸附

等溫線代表色譜圖是拖尾的，凹形吸附等溫線代表的色譜圖是吐舌頭形狀、S形的色譜圖是

波浪形的。

27.ShephadexG100是一種凝膠排阻色譜，主要用于蛋白質(zhì)的純化。

28.DEAE-ShaphdexA25是一種離子交換層析介質(zhì)。

29.CM-纖維素是一種弱陽離子交換介質(zhì)。

30.離子交換層析一般是通過梯度一般采用兩種方法達到分離蛋白質(zhì)的目的。

一種是增加洗脫液的離子強度，一種是改變洗脫液的pH值。

31.QAE-葡聚糖是強堿陰離子交換劑，SP—是強酸陽離子交換劑。

33.蛋白質(zhì)含量和純度測定方法。含量測定：克氏定氮法，TCA比濁度法、雙縮腺法、福林-

酚法和紫外線法，考馬斯蘭法（Bradford法）。

純度衡量：電泳法，層析法，質(zhì)譜法等。一般應采用二種以上方法，而且同一原理的方法不

應該采用二次。

34.細胞破碎法包括：機械力和非機械力破碎方法；機械方式又包括：液體剪切力和固體

剪切力方法，液體剪切力包括：高壓勻漿法和超聲破碎法；

固體剪切力包括：高速珠磨法和壓榨法。

35.高壓勻漿法的主要困難包括：溫控和堵塞問題

26.高壓勻漿法的破碎率決定于：勻漿閥的結構，操作壓力，破碎次數(shù)。

34.蛋白質(zhì)的分子量測定：超離心法、光散射方法、凝膠過濾法、SDS-PAG電泳法。

三、判斷題

3.絮凝劑須有長鏈的線性結構，越長越好（X）。

4.細胞壁破碎的主要阻力是連接細胞壁網(wǎng)狀結構的共價鍵（J）

6.離子交換的推動力是離子濃度差。（J）

9.凝膠過濾操作中，通常上樣量越小，分辨率越高。X

16.層析過程中，有效柱長是隨層析條件的變化而變化的.V

17.層析過程中，可以通過改變洗脫劑的濃度變化梯度改變有效柱長和最短柱長.V

23.HPLC填料的顆粒粒度的分布應該是越小越好的，最好是能實現(xiàn)顆粒的單分散。V

28.葡聚糖凝膠排阻色譜中，上樣量越大，分辨率越高。X

29.同一蛋白質(zhì)在不同種類的緩沖液中，只要緩沖液的pH值相同，則30.蛋白質(zhì)所帶的電荷

數(shù)量也相同。X

37.為了減小樣品在洗脫過程的軸向擴散，可采取增大進樣濃度減少進樣量的方式。V

40.動物細胞培養(yǎng)微戴體的密度應略大于培養(yǎng)基。X

42.一般講，親水性膜及膜材料電荷與溶質(zhì)相同的膜較耐污染。V

43.色譜過程中試樣中的各組分具有不同的K值是分離的基礎。V

44.色譜過程一定溫度下，組分的分配系數(shù)K越大，出峰越慢。V

47.色譜柱效高說明該色譜對物質(zhì)的分離度高。X

51.分離度由色譜柱的柱效率和物質(zhì)間的分配系數(shù)的差異共同決定。V

53.在凝膠排阻層析中，流動相的速度越慢越有利于色譜分離和分析。V

55.兩性的生物大分子所帶電荷的性質(zhì)和數(shù)量由其等電點及溶液環(huán)境(pH值)所決定。V

56.聚丙烯酰胺濃縮膠的原理包括其pH值=6.9為甘氨酸的等電點。V

59.樣品溶解不好容易造成拖尾。V

60.Monod常數(shù)隨菌體的濃度的變化而變化。X

61.Monod常數(shù)是細胞培養(yǎng)過程中的一個對菌體性質(zhì)的特征性常數(shù)。X

62.色譜柱效可從峰寬得到，色譜峰越寬，柱效越低，峰寬相同，柱效相同。X

63.決定柱效的因素是分配系數(shù)。X

64.決定柱效的因素是容量因子。X

66.可以說“A柱子的柱效高于B柱子。X67.分配系數(shù)與柱效沒有關系。X

68.容量因子與柱效有關系。V

69.柱效不能表示被分離組分的實際分離效果。V

70.用有效塔板數(shù)和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標時，應指明測定物質(zhì)。V

72.發(fā)酵反應器設計要求有盡量高的傳氧系數(shù)。V

73.生物放大器的常用控制方法是反饋調(diào)節(jié)。V

75.動物細胞培養(yǎng)就操作而言，深層培養(yǎng)可分為批式、流加式，半連續(xù)式、連續(xù)式和灌注式

5種。V

80.明膠涂覆的多孔微載體適應于一切的細胞系。V

86.產(chǎn)物提純過程包括初級分離階段和純化精制階段兩個階段。V

93.溶液pH對蛋白質(zhì)在水中溶解性，荷電性及構型有很大影響。V

94.膜分離技術中清洗過程中主要考慮膜的化學特性和污染物的特性二個因素。V

96.氣液色譜的固定液在常溫下不一定為液體，但在使用溫度下一定呈液體狀態(tài)。V

98.用來衡量色譜峰寬度的參數(shù)有標準偏差G)、半峰寬(Y1/2)和峰底寬(Wb)三種表示法。

V

99.氣相色譜中容量因子越大，保留時間越長。V

100.離子交換色譜對于大分子和小分子的保留機理基本相同。V

101.示差折光檢測器是除紫外檢測器之外應用最多的檢測器，此檢測器靈敏度低、對溫度

敏感、不能用于梯度洗脫。V

102.液-固吸附色譜中非線形等溫吸附常引起峰的拖尾。V

104.非線性色譜基本理論包括吸附平衡熱力學、吸附平衡動力學和色譜基本特料平衡方程。

V

106.在非線性色譜中，峰高增加的速率隨濃度的增加而逐漸降低，因而峰高不能作為定量

分析的指標。X

109.凝膠過濾中進樣體積和樣品的濃度將明顯地影響蛋白質(zhì)的。V

110.膨化的凝膠可以直接高溫烘干。X

112.一般來說只要能溶解被洗脫物質(zhì)并不使其變性的緩沖液都可以用于凝膠層析。V

113.離子交換用的層析柱一般粗而短，不宜過長。V

115.Superdax是葡聚糖與交聯(lián)瓊脂糖的結合，而Superose是珠狀瓊脂糖經(jīng)兩次交聯(lián)。V

116.反相色譜以硅膠基質(zhì)的鍵合相填料為主，特別是鍵合C18,C8烷基以及苯基填料。V

117.不同填料的化學結構是通過對基質(zhì)材料的化學改性而實現(xiàn)的。V

118.疏水性相互作用色譜是為了適應活性生物大分子特別是蛋白質(zhì)的分離而發(fā)展起來的種

液相色譜方法。V

120.作為分離材料的硅膠，其顆粒的形狀與大小、孔的結構、孔徑及其分布、總孔容、比

表面積及機械強度等，均為重要的物理參數(shù)。V

121.硅膠的化學修飾大致可以三種不同的方式進行，即整體修飾、通過表面硅羥基的化學

修飾以及涂層法。V

122.物理吸附水的去除是硅膠衍生反應中不可或缺的一步。V

123.硅膠一般有耐受高壓力，耐壓能力隨孔徑及孔度而下降。V

129.泳動度(遷移率)只取決于帶電質(zhì)點的性質(zhì)。X

131.丙烯酰胺濃度和交聯(lián)劑濃度決定膠的物理狀態(tài)及分子篩的孔徑的大小。V

132.電泳中緩沖液的種類，濃度和其他電解質(zhì)濃度影響蛋白質(zhì)所帶電荷的極性和數(shù)量，同時

還影響蛋白質(zhì)分子間的相互作用。V

138.選擇具高選擇的填料可以克服徑向色譜直徑短的缺點，發(fā)揮徑向色譜柱速度快，處理量

大的優(yōu)點。V

四.單選題

12.在理想狀態(tài)下，下列哪種色譜對二種物質(zhì)的分離度可以隨柱長的延長而無限增加：

(A)凝膠排阻色譜；(B)離子交換色譜；

(C)親和色譜；(D)分配色譜；

17.聚合物型基質(zhì)材料中，下列哪種是應用最為廣泛的：

(A)交聯(lián)聚苯乙烯樹脂；

18.對于硅膠而言，其表面的硅羥基是進行化學修飾的基礎，硅膠表面的硅羥基的主要存

在形式是：

(A)硅三羥基；(B)硅二羥基；

(C)鄰位硅羥基；(D)單硅羥基；

19.不經(jīng)過化學修飾或改性的硅膠本身可以做為：

(A)正相色譜填料；(B)反相色譜填料；

(C)離子交換色譜填料；(D)親和色譜填料；

29、目前細胞培養(yǎng)產(chǎn)物的收率很低，不及總蛋白的1%,主要原因不包括：

(A)血清蛋白質(zhì)的污染

(B)細胞表達產(chǎn)物濃度低

(0產(chǎn)物在培養(yǎng)條件下不穩(wěn)定

(D)分離技術限制

30、生化分離用離子交換劑的特點不包括

(A)粒徑小，分布均勻

(B)疏水性

(C)生物相容性

(D)適當?shù)碾姾擅芏?/p>

31、微囊化使一下哪個受到消極影響

(A)抗剪切力

(B)細胞生長環(huán)境

(C)傳質(zhì)效率

(D)產(chǎn)物濃度

33、表征膜對某一大分子溶質(zhì)的截留能力的是：。

A.孔道特征B.水通量C.截留率oD.截留分子量

35、無機鹽對蛋白質(zhì)鹽析效果，下列選項錯誤的是。

A.檸檬酸鹽〉磷酸鹽〉硫酸鹽B.硫酸鹽＞醋酸鹽＞鹽酸鹽

0.鹽酸鹽V硝酸鹽V硫氯酸鹽D.鹽酸鹽＞硝酸鹽＞硫氟酸鹽

38、可測定蛋白質(zhì)亞基分子量以及未知蛋白質(zhì)分子量的電泳技術有。

A.CEB.HPLCC.IEFD.SDS

39、可用于了解蛋白組成，蛋白分子和等電點的電泳技術是。

A.凝膠電泳B.等電點聚焦電泳C.毛細管電泳D.雙向電泳

41、強酸性陽離子交換樹脂的功能基團是。

A.-S03HB.-P0(0H)2C.-C00HD.-0H

42、與離子交換樹脂的總交換容量有關的是。

A.樹脂種類B.溶液的pHC.溶液的溶質(zhì)濃度D.溶液中溶質(zhì)的電荷數(shù)

45、在采用離子交換技術時，對弱酸性樹脂pH應選擇。

A.pH＞pK產(chǎn)物＞pK樹脂B.pK產(chǎn)物＞pH＞pK樹脂

C.pK產(chǎn)物〉pK樹脂〉pHD.pK樹脂〉pH＞pK物質(zhì)

47、在低濃度下已吸附的被吸附分子又能吸附在液相中的分子，其吸附等溫表現(xiàn)為。

A.凸形B.凹形C.S形D.階梯形

49、當溶質(zhì)濃度增加時，分子在固相表面逐漸吸附，趨于穩(wěn)定后被吸附的分子又吸附其他

分子，其吸附等溫表現(xiàn)為。

A.凸形B.凹形C.正S形D.反S形

50、被吸附的分子在吸附劑表面隨液相中溶質(zhì)濃度的增加會發(fā)生吸附取向的變化或吸附狀

態(tài)的改變，其吸附等溫表現(xiàn)為。

A.凸形B.凹形CS形D.階梯形

51、在應用吸附分離技術時，根據(jù)經(jīng)驗，吸附劑孔徑等于溶質(zhì)分子直徑的多少較適合。

A.1倍B.2倍C.4倍D.6倍

52、檢測蛋白質(zhì)是否變異的常用方法有。

A.肽譜B.HPLCC.等電聚焦D.毛細管電泳E.以上都對

53、下列蛋白質(zhì)含量測定法，哪項靈敏度最高。

A.凱氏定氮法B.考馬斯亮藍法CFolin一酚試劑法D.紫外吸收法

55、在有機相中添加下列哪項，將在表面活性劑總濃度不變的情況下可以提高反膠團尺寸,

增大反膠團萃取的操作pH范圍。

A.助溶劑B.帶溶劑C.稀釋劑D.助表面活性劑

56、雙水相萃取技術與生物轉化過程結合，下列哪項不是其優(yōu)勢。

A.消除產(chǎn)物反饋抑制B.細胞（酶）可循環(huán)使用

C.生產(chǎn)能力、收率及分離效率高D.傳質(zhì)面積增大

57、關于溫度對雙水相萃取的影響，下列說法正確的是。

A.在臨界點附近，對蛋白質(zhì)分配系數(shù)影響較小

B.遠離臨界點時，對蛋白質(zhì)分配系數(shù)影響較大

C.影響雙水相黏度和密度，從而影響蛋白質(zhì)的分配系數(shù)

D.大規(guī)模的雙水相萃取操作需在冷卻狀態(tài)下進行

58、下列哪個組合不可能形成雙水相系統(tǒng)。

A.PEG/DexB.PEG/InorganicsaltC.乙醇/硫酸鹽D.磷酸鹽/硫酸鹽

59、在溶劑萃取中，在水相中加入無機鹽，下述哪項不是其目的。

A.由于鹽析作用，使產(chǎn)物在水中的溶解度下降，而有利于轉入有機相

B.增加兩相間密度差，減少有機溶劑和水之間的互溶度

C.減輕乳化現(xiàn)象，使其容易分離

D.沉淀雜質(zhì)

60、萃取劑對目標產(chǎn)物和雜質(zhì)的分離能力可用下列哪項來表征。

A.分離因素（B）B.萃取因素C.分配系數(shù)D.活度系數(shù)

65、在GC和LC中，影響柱選擇性的不同的因素是

A.固定相的種類；B.柱溫；C.流動相的種類；D.分配比。

66、在液相色譜中，某組分的保留值大小實際反映了哪些部分的分子間作用力？

A.組分與流動相；B.組分與固定相；C.組分與流動相和固定相；D.組分與組分。

68、在液相色譜中，梯度洗脫最宜于分離：

A.幾何異構體；B.沸點相近，官能團相同的試樣；

C.沸點相差大的試樣；D.分配比變化范圍寬的試樣。

五、簡答題

1.高效液相色譜是如何實現(xiàn)高效、快速、靈敏的？

從氣相色譜的高效、高速和高靈敏度得到啟發(fā)，采用570Hm微粒固定相以提高柱效,

用高壓泵加快液體流動相的流速；

設計高靈敏度、死體積小的紫外、熒光等檢測器，提高檢測靈敏度，克服經(jīng)典液相色

譜的缺點，從而達到高效、快速、靈敏。

2.簡述液相色譜中引起色譜峰擴展的主要因素，如何減少譜帶擴寬，提高柱效？

因素：渦流擴散、流動相傳質(zhì)、停留流動相傳質(zhì)及柱外效應。

減少填料顆粒直徑，減小填料孔穴深度，提高裝填的均勻性，

采用低黏度溶劑作流動相，流速盡可能低，

同時要盡可能采用死體積較小的進樣器、檢測器、接頭和傳輸管線等。

3.色譜柱A柱長為15cm,載體粒度為5|im。另一B柱長為30cm,載體粒度為兩

柱的柱效相等嗎？

■:l=L/g：.A=15/0.0005=30000/B=30/0.0010=30000

A柱的折合柱長為30000,B柱的折合柱長也為30000,表明組分在兩根柱內(nèi)從柱入口到出

口都經(jīng)過30000個載體顆粒，兩柱的柱效相等。

4.為什么體積排阻色譜中任何組分的分配系數(shù)必須符合0W31?如果A>1說明什么問

題？

因為組分的分配系數(shù)為償a/%a與源分別為組分在固定相和流動相中的濃度，當分子

直徑大于孔徑時，此時c“=o,.,.償0。當分子直徑小于固定相孔徑時，組分向空隙內(nèi)流動相擴

散,達到平衡時，一半組分在空隙內(nèi)，一半組分在空隙外，此時償1,若分子直徑介于以上兩種

極限情況之間，片一定介于0與1之間，可見體積排阻色譜中，任何組分的分配系數(shù)為0W痣

1,如果K>1說明此時的分離方式已不是純粹的體積排阻色譜，其分離過程受到其他作用力

(如吸附)的支配.

5.HPLC操作中，流動相為什么要脫氣？常用的脫氣方法有拿幾種？

害處：(1)氣泡進入檢測器，引起光吸收或電信號的變化，基線突然跳動，干擾檢測；

(2)溶解在溶劑中的氣體進入色譜柱時，可能與流動相或固定相發(fā)生化學反應；

(3)溶解氣體還會引起某些樣品的氧化降解，對分離和分析結果帶來誤差。

脫氣法：(1)加熱脫氣法(2)抽吸脫氣法；

(3)吹氫脫氣法；(4)超聲波振蕩脫氣法。

6.生物工程下游技術的基本步驟。

(1)建立分析方法：

①生物測定方法；②理化測定方法；③理化方法與生物學方法結合測定；

(2)選擇提取材料；

(3)選擇提取方法；

(4)分離純化方法的探索；

(5)均一性的鑒定。

7、生物工程下游技術按生產(chǎn)過程劃分幾個階段？各階段的任務是什么？

①發(fā)酵液預處理、固液分離、細胞破碎：

除去發(fā)酵液中的不溶性固形物雜質(zhì)和分離菌體細胞；

分離胞內(nèi)產(chǎn)物，收集細胞后進行細胞的破碎和細胞碎片分離。

②提?。撼ヅc產(chǎn)物性質(zhì)差異較大的雜質(zhì)

③濃縮：主要去除水分，提高產(chǎn)物濃度

④純化：去除與產(chǎn)物的物理化學性質(zhì)比較接近的雜質(zhì)。

⑤成品化：根據(jù)質(zhì)量標準和產(chǎn)品劑型制作產(chǎn)品。

8.發(fā)酵液預處理的目的是什么，如何選擇發(fā)酵液預處理過程？

①去除部分雜質(zhì)

②改善理化性質(zhì)，有利于固液分離

③使產(chǎn)物轉入便于后處理的一相中

如何選擇發(fā)酵液預處理過程：

①胞外產(chǎn)物，發(fā)酵通過離心或過濾實現(xiàn)固液分離，使其轉入液相；

②胞內(nèi)產(chǎn)物，先通過離心或過濾收集細胞并洗滌，然后細胞經(jīng)破碎或整體細胞萃取使目標

產(chǎn)物釋放，轉入液相，再進行細胞碎片分離。

③細胞本身，通過離心或過濾獲得細胞，然后對細胞進行洗滌、干燥。

9.超臨界C02破碎細胞技術的原理是什么？

超臨界流體C02在高壓條件下滲透到細胞內(nèi)，突然降壓后，C02變成氣體，使細胞內(nèi)外

壓力差增加，細胞急劇膨脹發(fā)生破裂。另外C02對脂質(zhì)有萃取作用，細胞碎片較大。

10.在溶劑萃取時，為什么要進行破壞乳化？

乳化是水或有機溶劑以微小液滴形式分散于有機相或水相中的現(xiàn)象。

有機溶劑相和水相分層困難，出現(xiàn)兩種夾帶：①發(fā)酵廢液（萃余液）中夾帶有機溶劑（萃

取液）微滴，使目標產(chǎn)物受到損失；②有機溶劑（萃取液）中夾帶發(fā)酵液（萃余液），給后

處理操作帶來困難。

產(chǎn)生乳化有時即使采用離心機也往往不能將兩相分離完全，所以必須破壞乳化。

11.超臨界萃取的原理是什么？

溶質(zhì)在超臨界流體中的溶解度，與其密度有關，密度越大，溶解度越大。在臨界點附

近，微小的壓力增加或溫度下降，則超臨界流體的密度大幅度增加，對溶質(zhì)的溶解度將大

幅度增加，有利于溶質(zhì)的萃取。而在臨界點附近，微小的壓力下降或溫度上升，則超臨界

流體的密度大幅度減少，對溶質(zhì)的溶解度將大幅減少，有利于溶質(zhì)的分離和溶劑的回收。

12.膜的濃差極化對生產(chǎn)有何影響？減少濃差極化有哪些措施？

濃差極化：在膜過濾時，隨溶劑不斷透過膜，大分子溶質(zhì)被帶到膜表面，但不能透過，

就被截留在膜的表面上，造成膜面濃度升高，產(chǎn)生膜面到主體溶液之間的濃度梯度，這種

濃度差導致溶質(zhì)自膜面反擴散至主體溶液中的現(xiàn)象稱為濃差極化。

影響：①提高滲透壓，降低水通量；②降低膜的截留率；③產(chǎn)生結垢現(xiàn)象，造成物理

阻塞，使膜逐漸失去透水能力。

措施：對處理液攪動、振動、錯流以及加快液流速度等。

13.有機溶劑沉淀法原理是什么？

加入有機溶劑于蛋白質(zhì)溶液中可產(chǎn)生多種效應，這些效應結合起來，使蛋白質(zhì)沉淀。

①有機溶劑，使溶液介電常數(shù)降低，蛋白質(zhì)、核酸、多糖等帶溶質(zhì)間靜電引力增大，從而

相互吸引、聚集而沉淀。

②有機溶劑減小水的極性，使兩性溶質(zhì)在溶液中的溶解度降低。

③由于有機溶劑的水合作用，降低了自由水的濃度，從而降低了親水溶質(zhì)表面水化層的厚

度和溶質(zhì)的親水性，導致脫水凝聚。

④極性有機溶劑破壞溶質(zhì)的某種鍵（如氫鍵），使其空間結構發(fā)生變形，使原來包在內(nèi)部的

疏水基團結合形成疏水層。

14.聚丙烯酰胺凝膠電泳原理。

由于聚丙烯酰胺凝膠是多孔介質(zhì)，不僅能防止對流，把擴散減少到最低；而且其孔徑

大小與生物大分子具有相似的數(shù)量級，能主動參與生物分子的分離，具有分子篩效應。

因此，在使用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白質(zhì)分離時，在電泳過程中不僅取決于蛋白

質(zhì)的電荷密度學（電荷效應），還取決于蛋白質(zhì)的大?。ǚ肿恿浚┖托螤睿ǚ肿雍Y效應）。

15.簡述SDS—PAGE電泳測定未知蛋白分子量的方法。

以不同的標準分子量蛋白MARK,與未知蛋白樣品一同進行SDS—PAGE電泳。染色后分

別計算未知蛋白、標準分子量蛋白MARK的遷移率，然后根據(jù)標準分子量蛋白MARK遷移率

與其分子量的對數(shù)值作圖，可得一標準曲線并擬合方程。將未知蛋白遷移率代入擬合方程,

求出未知蛋白的分子量。

16.影響離子交換能力和選擇性因素有哪些？

離子交換能力和選擇性的好壞集中反映在離子交換常數(shù)K上，K值越大，說明離子交換能

力和選擇性越好。影響K值的因素有：

(1)被交換離子的水化半徑和化合價：樹脂對水化半徑小的離子和化合價高的離子選擇性

好。

(2)溶液濃度：樹脂對離子交換吸附的選擇性，在稀溶液中比較大，而在濃溶液中選擇性

較小。

(3)溶液的pH:pH必須滿足使樹脂和生化物質(zhì)都呈離子狀態(tài)。

(4)交聯(lián)度：對凝膠樹脂，交聯(lián)度小，樹脂的孔徑大，選擇性降低。

(5)有機溶劑：當有機溶劑存在時，常會使樹脂對有機離子的選擇性降低，而容易吸附無

機離子。因此進行交換吸附時，料液中不應存在有機溶劑。但在解吸附(洗脫)時，可采

用有機溶劑來提高解吸的收率。

18.色譜方法共分幾類？常用的蛋白質(zhì)分離方法有哪些？并簡述其原理

(1)按溶質(zhì)分子與固定相相互作用的機理不同，色譜分離可大致分成如下5大類：

吸附色譜分離，分配色譜，離子交換色譜，凝膠色譜，親和色譜。(2)根據(jù)固定相的形狀

不同，色譜分離技術可分為柱色譜分離、紙上色譜分離、薄層色譜分離。

(3)根據(jù)流動相的物態(tài)不同，色譜分離技術可分為氣相色譜分離、液相色譜分離、超

臨界色譜分離。

(4)根據(jù)操作壓力不同，色譜分離技術不同可分為低壓色譜分離、中壓色譜分離、高

壓色譜分離。

19.在吸附分離技術中，如何選擇洗脫劑？

(1)洗脫劑：選擇與吸附劑溶解度參數(shù)相近的試劑作為洗脫劑;

洗脫劑對被吸附物有較大的溶解度；

（2）洗脫劑為水溶液時，需考慮洗脫pH:對于弱酸性物質(zhì)，在偏酸性條件吸附，洗脫應為

堿性水溶液；弱堿性物質(zhì)則相反。

（3）如果吸附在高濃度鹽溶液中，則洗脫可僅用水。

（4）易揮發(fā)性物質(zhì)，可用熱水或蒸汽解吸。

20.蛋白質(zhì)含量/濃度測定方法有哪些？各有什么特點？

蛋白質(zhì)含量（濃度）測定，是生化檢測中的基本內(nèi)容，常見的測定方法有：凱氏定氮

法，雙縮尿法（Biuret法）、Folin一酚試劑法（Lowry法）和紫外吸收法?？捡R斯亮藍法

（Bradford法）。

1）凱氏定氮靈敏度低，適用于0.2~1.0mg氮，誤差為±2%費時

8?10小時將蛋白氮轉化為氨，用酸吸收后滴定非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分

離）用于標準蛋白質(zhì)含量的準確測定；干擾少；費時太長

2）雙縮腺法（Biuret法）靈敏度低1?20mg中速20~30分鐘多肽鍵+堿性Cu2+?

紫色絡合物硫酸鐵；Tris緩沖液；某些氨基酸用于快速測定，但不太靈敏；不同蛋白質(zhì)

顯色相似

3）紫外吸收法較為靈敏50?100ug快速5?10分鐘蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸

殘基在280nm處的光吸收各種喋吟和喀噫；

4）Folin一酚試劑法（Lowry法）靈敏度高?5ug慢速40?60分鐘雙縮月尿反應；

磷錮酸一磷鴇酸試劑被Tyr和Phe還原硫酸鐵；Tris緩沖液；甘氨酸；各種硫醇耗費時

間長；操作要嚴格計時；顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化

5）考馬斯亮藍法（Bradford法）靈敏度最高1?5|dg快速5?15分鐘考馬斯亮藍染

料與蛋白質(zhì)結合時，其Imax由465nm變?yōu)?95nm強堿性緩沖液；

21.（重組）蛋白質(zhì)量檢測方法有哪些？

（重組）蛋白必須經(jīng)過嚴格的質(zhì)量控制才能成為產(chǎn)品。重組蛋白的質(zhì)量控制指標包括：

1）重組蛋白的鑒別（序列）

2）重組蛋白的純度（雜質(zhì)的類型）

3）重組蛋白的活性（檢測方法）

4）重組蛋白的安全性

5）重組蛋白的穩(wěn)定性

6）重組蛋白的一致性（構象與構型）

具體的檢測項目和方法有:

1）產(chǎn)品是否含內(nèi)毒素家兔熱原法

2）蛋白質(zhì)是否變異肽譜、HPLC、等電聚焦、毛細管電泳

3）甲硫氨酸是否被甲酰化肽譜、質(zhì)譜、HPLC、Edman分析

4）蛋白質(zhì)是否變性、聚合、脫氨基SDS、凝膠層析、等電聚焦、質(zhì)譜、HPLC、毛

細管電泳、Edman分析

5）配體是否脫落SDS,免疫分析

6）氨基酸是否發(fā)生取代氨基酸分析、肽譜、質(zhì)譜、毛細管電泳

7）產(chǎn)品是否被細菌、病毒、支原體等污染微生物學檢測

22、生物技術產(chǎn)品的分離提取工藝應考慮那些因素？

某一具體產(chǎn)品的分離提取工藝與下列情況有關：（1）是胞內(nèi)產(chǎn)物還是胞外產(chǎn)物；

（2）原料中產(chǎn)物和主要雜質(zhì)濃度；（3）產(chǎn)物和主要雜質(zhì)的物理化學特性及差異；

（4）產(chǎn)品用途和質(zhì)量標準；（5）產(chǎn)品的市場價格；（6）廢液的處理方法等。

23、“清潔生產(chǎn)”應該包括哪三方面的內(nèi)容？

（1）清潔生產(chǎn)工藝技術和過程：含先進的無廢少廢技術、高效的裝備和完善的管理；

（2）清潔產(chǎn)品：使用中和使用后對人體和環(huán)境無害；

（3）清潔能源：包括常規(guī)能源清潔利用、采用節(jié)能技術、再生能源和新能源的開發(fā)利用。

六、綜合題

1.試述非線性色譜的概念及其特點？

非線性色譜：流動相中的樣品濃度（Cm）與固定相中的樣品濃度（Cs）不呈線性關系的色譜.

分析色譜大多屬于線性色譜；制備色譜大多屬于非線性色譜

非線性色譜的特點

①.樣品的保留值可變：非線性色譜的保留值隨樣品及其濃度的不同而變化；

②.峰形的不對稱性：不是高斯正態(tài)分布的；

③.色譜峰的峰高與濃度不是線性關系：峰高增加的速率隨濃度的增加而下降.

2.什么叫吸附等溫線？研究吸附等溫線有什么意義？

附等溫線：指在一定溫度下物質(zhì)分子在兩相界面上進行的吸附過程達到平衡時它們在兩相

中濃度之間的關系。

研究吸附等溫線可以提供得到以下方面的信息：

①.預測代表該吸附等溫線的組分在非線性色譜中色譜峰的形狀；

②.為非線性色譜分離與純化物質(zhì)選擇最佳條件；

③.反映被分離物質(zhì)分子與固定相表面的作用，從而研究分子的構型及吸附狀態(tài)。

④.建立分子結構-吸附之間的定量關系，從而由分子結構預測吸附性能。

3.①做為優(yōu)良的凝色譜介質(zhì)應該具備什么基本特點？

②介質(zhì)本身為惰性物質(zhì)，不與溶質(zhì)、溶劑分子發(fā)生任何作用；

③應盡量減少介質(zhì)內(nèi)含的帶電離子基團，以減少特異性吸附，提高蛋白質(zhì)的收率;

④介質(zhì)內(nèi)孔徑大小要分布均勻，即孔徑分布較窄。

⑤凝膠珠粒大小均勻；

介質(zhì)要有良好的物理化學穩(wěn)定性及較高的機械強度，易于消毒。

4.做為優(yōu)良的HPLC填料應具備什么基本的物理化學特性？

在物理結構上的要求：

①合適的顆粒大小及較窄的粒度分布；

②一定的顆粒強度；

③一定的孔徑大小和孔徑分布，避免復雜的微孔結構；

④一定的溶脹及收縮水平；

優(yōu)良的HPLC填料目前的主要發(fā)展方向：

①顆粒單分散的填料；

②貫穿性超大孔結構的填料；

③小顆粒的非多孔填料；

■在化學結構上的要求：填料的化學結構，特別是顆粒表面和內(nèi)孔表面的化學結構（如連接在

基質(zhì)上的官能基團或鏈段）是影響色譜熱力學行為（保留值,選擇性等）的主要因素

①特定的選擇性；

②良好的化學穩(wěn)定性；

③避免不可逆吸附；

5.試述羥基磷灰石做為一種有廣闊發(fā)展前途的色譜填料的主要特點.

羥基磷灰石（hydroxyapatite,HAP）是一種弱陽離子或弱陰離子交換層析材料.其材料

本是骨骼和牙齒等生物硬組織的主要無機成分，與生物組織有特異性的親和力和相容性.其

優(yōu)點是：能精確地分離，純化結構上只有微小差別的生物大分子.

做為一種優(yōu)良的色譜填料,羥基磷灰石具有以下特點：

①.高機械強度：可以耐受15MPa以上壓力，陶瓷HAP可以耐受幾十MPa的壓力.

②.高柱效：球形HAP顆粒大小，形狀及孔隙大小均適合HPLC的要求.其顆粒及孔徑小，有

比較高的柱效.

③.化學和熱穩(wěn)定性：是磷酸鈣鹽中最穩(wěn)定的，在中性和堿性不相中非常穩(wěn)定，溶解度很

低，熱穩(wěn)定性很高，可采用高溫制備方法生產(chǎn).

④.低的非可逆性吸附：HAP有非常低的非可逆性吸附.

⑤.表面修飾性：HAP表面比較容易進行各種化學修飾.

⑥.總之HAP:高選擇性，高鍵合容量，低的非可逆吸附，良好的化學和熱穩(wěn)定性。

6.與傳統(tǒng)的稀釋法和透析法相比，液相色譜復性的優(yōu)點是：

①.在進樣后可很快的除去變性劑；

②.色譜固定相對變性蛋白質(zhì)的吸附可明顯的減少、甚至完全消除變性蛋白質(zhì)分子在脫

離變性劑環(huán)境后的分子聚集，從而避免了沉淀的產(chǎn)生，提高蛋白質(zhì)復性的質(zhì)量和活性回收

率；

③.在蛋白質(zhì)復性的同時，可使目標蛋白質(zhì)與雜蛋白分離達到純化的目的，使復性和純

化同時進行；

④.便于回收變性劑，降低廢水處理成本。

7.在對包含體蛋白質(zhì)進行增溶和復性的過程中為什么要加入還原劑，同時為什么還必

須加入金屬螯合劑？常用的還原劑有哪些？在復性后為什么要加入氧化劑？常用的氧化劑有

哪些？（見21）

8.什么叫雙水相萃??？在雙水相萃取中為什么要盡量將細胞碎片集中在下相？可以采取

什么可能的措施在使細胞碎片盡量集中在下相的同時，使目標蛋白質(zhì)盡可能集中在上相？

9.什么是徑向色譜？徑向色譜應用于生物物質(zhì)分離有什么優(yōu)點？

采用徑向流技術的色譜，即樣品和流動相沿徑向流動，可以從色譜柱的周圍流向圓心，也

可以從圓心流向柱的周圍。通常采用從柱的周圍流向圓心的方式。

優(yōu)點：

可以在較小的柱床層高度時使用較大的流動相速度；

在較高流動相速度時，反壓降低；

可以線性地增加樣品處理量，樣品可以在完全相同的色譜條件下直接放大。

10.利用微載體進行動物細胞培養(yǎng)的優(yōu)點有哪些？

①微載體培養(yǎng)的優(yōu)點：

②表面積/體積比大；

③微載體懸浮于培養(yǎng)基中，細胞生長環(huán)境均一，便于監(jiān)測和控制；

④培養(yǎng)基利用率高；

⑤采樣重演性好；

⑥收獲過程不復雜；

⑦放大較容易；

勞動強度小，占用空間小.

為什么動物細胞培養(yǎng)要用血清培養(yǎng)基？血清培養(yǎng)基使用有何缺點？

答：1）因為動物細胞正常生長所需要的一些必要成份均存在于血清中，而且這些成份的組

成及其含量至今沒有被闡明，因此只能直接采用血清進行培養(yǎng)，而目前尋找無血清的制品

代替進行培養(yǎng)并沒有獲得廣泛的成功。

2）采用血清培養(yǎng)基有以下缺點：

①血清是培養(yǎng)基成本的主要部分；血清中含有細胞生長必須的微量組分，但這些組分的

成分及其作用至今未清楚，因此無法取代；

②

血清的存在是產(chǎn)物純化的主要障礙；

③

血清是病毒污染及其他未知因素影響的主要來源，增加了細胞培養(yǎng)產(chǎn)品潛在的使用危

險

④

⑤血清同時也有生長抑制的作用；

血清使用使實驗和生產(chǎn)過程標準化變得困難。

12.試述聚賴氨酸/海藻酸（PLL/ALG）微囊化的原理:

原理是：海藻酸的水溶液以鈣鹽形式存在是呈凝膠狀態(tài)，用螯合劑去除鈣離子后又恢

復溶液狀態(tài)，當海藻酸鈣用聚賴氨酸預先處理后，就不再被螯合劑去鈣而溶解。

據(jù)此，先將動物細胞與海藻酸混合，滴入CaCL2溶液中成微珠，用聚賴氨酸處理表面,

再用螯合劑處理，則表面還是呈凝膠狀態(tài)而中間成液態(tài)。

13.影響聚賴氨酸/海藻酸微囊化的一些因素：

答：1）半透膜的孔徑大小是關鍵，由PLL的分子量所決定；

2）海藻酸的純度、黏度及甘露糖醛酸/古羅糖醛酸比例都會影響微囊化的形成及機械性能;

3）動物細胞的存活率與微囊化過程的時間及溫度pH、滲透壓等有關；

14.高壓勻漿法的作用機理：

作用機理：高壓泵將電機的旋轉運動轉變成勻漿閥柱桿的直線運動，從高壓室（幾十兆帕）

壓出細胞懸浮液，經(jīng)過碰撞環(huán)的撞擊后改變方向從出口管噴出，使細胞經(jīng)歷較高的流速下

的剪切碰撞發(fā)生較大的變形，從而達到破碎細胞的目的

15.化學滲透法破碎細胞的原理及其優(yōu)缺點。

答：作用機理：某些有機溶劑，抗生素，表面活性劑，金屬螯合劑，變性劑等化學藥品都

可以改變細胞壁或膜的通透性，從而使內(nèi)容物有選擇地滲透出來，這種處理方法叫滲透法。

優(yōu)點（相對機械破碎）：

對產(chǎn)物釋出有一定的選擇性；

細胞保持完整，碎片少，利于進一步提??；

核酸釋放量少，黏度低，便于進一步分離。

缺陷：

時間長，效率低；

化學試劑有毒；

通用性差。

16.酶溶法碳細胞的原理、優(yōu)缺點是什么？

機理：就是利用生物酶將細胞壁和細胞膜消化溶解的方法。

優(yōu)點：

一定的選擇性；

細胞外形完整，核酸釋放少，有利于進一步分離過程

缺點：（只能用于實驗室）

產(chǎn)物抑制造成效率低下；

溶酶價格高；

通用性差，不易確定最佳條件；

17.微波加熱法胞的原理、優(yōu)缺點是什么？

機理：微波加熱導致細胞內(nèi)極性物質(zhì)，尤其是水分子吸收微波能，產(chǎn)生大量熱量，使

胞內(nèi)溫度迅速上升，液態(tài)水汽化產(chǎn)生的壓力將細胞膜和細胞壁沖裂，形成微小孔洞，進一

步加熱可導致細胞內(nèi)部和細胞壁水分減少，細胞收縮，表面出現(xiàn)裂紋。

優(yōu)點：微波穿透性強，選擇性高、加熱效率高。

缺陷：

一般只適合對熱穩(wěn)定物質(zhì)的分離；

被處理的物料要具有良好的吸水性；

不適于富含淀粉和樹膠等的天然植物。

18.包含體蛋白溶解的主要方式是什么？在溶解過程中為什么要加入還原劑

答：包涵體的溶解必須用很強的變性劑，如8moi/L尿素、6~8moi/L鹽酸月瓜，通過離子間的

相互作用破壞包涵體蛋白間的氫鍵而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果稍差，異氯鹽酸月瓜最

強；去污劑，如SDS,可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，可以增溶幾乎所有的蛋白，但由于無法徹

底去除而不允許用在制藥行業(yè)中；酸，如70%甲酸，可以破壞蛋白的次級鍵從而增溶蛋白，

這種方法只適合少數(shù)蛋白質(zhì)。對于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶時應加入還原劑（如DTT、

GSH、3-ME）打開蛋白質(zhì)中所有二硫鍵，對于沒有二硫鍵的目標蛋白有時也應使用還原劑，

因為含二硫鍵的雜蛋白會影響包涵體的溶解，同時還應加入金屬螯合劑，如EDTA或EGTA,

用來螯合Cu2+、Fe3+等金屬離子以防止其與還原狀態(tài)的疏基發(fā)生氧化反應。

19.包涵體蛋白質(zhì)含有二個以上二硫鍵應該如何處理？為什么要在復性完成后再加入氧

化劑？

包涵體蛋白首先用高溶度的變性劑促進蛋白質(zhì)的溶解，為了曾溶往往在溶液中加入一

定量的還原劑打開蛋白質(zhì)的二硫鍵，如DTT、GSH或部基乙醇（B-ME）等，同時也加入金

屬螯合劑，絡合高價金屬例子，防止其與-SH結合。

復性時，加入氧化劑可以引發(fā)變性蛋白質(zhì)形成正確的S-S鍵而復性，并與前面加入的

還原劑形成氧化還原對，能促進非正確折疊的二硫鍵快速交換，達到正確配對與折疊，促

進正確配對的產(chǎn)率。

20.根據(jù)流體各組分尺寸大小的不同，利用高分子聚合膜，過濾分離微米級的細胞、細

胞碎片和生物大分子的過程，叫微孔膜過濾。

-

①優(yōu)點：

容易做到封閉式操作，不受環(huán)境污染

②

設備投資少，操作安全；

③

加工量可大可小，十分方便；

④

有利于分離密度差小而難以離心的固體，可直接用于下游的層析過程。

，

①缺點：

②技術難以掌握，影響因素多；

③穩(wěn)定性和重復性不好；

膜堵塞問題是最難以解決的問題

21.雙水相萃取的一般原則：

-一般的原則是將碎片分配在下層（調(diào)節(jié)PEG和無機鹽濃度比例，可以控制細胞

碎片在上下層間的分配）其好處有：

①核酸等大部分雜質(zhì)一般處于下相，可以一并除去；

②下相是無機鹽富集相，作為廢棄物成本低些；

③蛋白質(zhì)保持于上相的PEG層有利于其活性的保持；

④碎片在下相有利于離心機的連續(xù)分離；

22.試述包含體復性的基本過程，復性過程錯誤發(fā)生的主要原因是什么？舉例分析主要的

復性方法的優(yōu)缺點，為什么LC復性是最好的？

包含體復性的基本過程：

①分離包含體：第一步是對培養(yǎng)收集的細胞進行破碎，比較有效的方法是高壓勻漿結合溶

菌酶處理，然后5000~20000g離心，可使大部分包涵體沉淀，與可溶性蛋白分離

②洗滌：包涵體沉淀需用去污劑（TritonX-100或脫氧膽酸鈉）和低濃度變性劑（2mol/L

尿素或鹽酸月瓜等）洗滌除去脂類和膜蛋白，這一步很重要，否則會導致包涵體溶解和復性

的過程中重組蛋白質(zhì)的降解

③溶解：包涵體的溶解必須用很強的變性劑，通過離子間的相互作用破壞包涵體蛋白間

的氫鍵而增溶蛋白。去污劑可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，可以增溶幾乎所有的蛋白，但由于

無法徹底去除而不允許用在制藥行業(yè)中；酸可以破壞蛋白的次級鍵從而增溶蛋白，這種方

法只適合少數(shù)蛋白質(zhì)。對于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶時應加入還原劑打開蛋白質(zhì)中所

有二硫鍵，對于沒有二硫鍵的目標蛋白有時也應使用還原劑，因為含二硫鍵的雜蛋白會影

響包涵體的溶解，同時還應加入金屬螯合劑用來螯合Cu2\Fe3+等金屬離子以防止其與還原

狀態(tài)的疏基發(fā)生氧化反應。

復性過程錯誤發(fā)生的主要原因是：在去除變性劑的同時，重組蛋白質(zhì)在體外折疊，分子間

存在大量錯誤折疊和聚合，復性效率往往很低，包涵體蛋白折疊復性的效率實際上取決于

正確折疊過程與聚集過程之間的競爭。

復性方法的優(yōu)點：透析、稀釋和超濾復性法，這三種方法是最傳統(tǒng)也是應用最普遍的蛋白

質(zhì)折疊復性方法，使變性劑濃度降低到蛋白質(zhì)能恢復折疊的濃度。

復性方法的缺點：復性活性回收率低，而且難于與雜蛋白分離。稀釋法大大增加溶液體積，

不利于后續(xù)的分離純化；透析法耗時長，易形成無活性蛋白質(zhì)聚集體；超濾法在膜上聚集

變性，易造成膜污染；稀釋法處理量太大，不利于工業(yè)放大。

LC復性是最好的原因：與傳統(tǒng)的稀釋法和透析法相比，液相色譜復性的優(yōu)點是：

①在進樣后可很快的除去變性劑；

②色譜固定相對變性蛋白質(zhì)的吸附可明顯的減少、甚至完全消除變性蛋白質(zhì)分子在

脫離變性劑環(huán)境后的分子聚集，從而避免了沉淀的產(chǎn)生，提高蛋白質(zhì)復性的質(zhì)量和活

性回收率；

③在蛋白質(zhì)復性的同時，可使目標蛋白質(zhì)與雜蛋白分離達到純化的目的，使復性和

純化同時進行；

④便于回收變性劑，降低廢水處理成本。

23.寫出斯托克斯公式，分析其基本意義.從該公式分析離心的主要條件.

2

斯托克斯公式（Stokes）:Uc=d2（ps-pL）rOJ/18|io

其意義是：

①密度差（Ps-PL）越大，離心沉降速度越快；

②在密度差（Ps-PL）存在下，固體顆粒尺寸越大，越容易離心；

③液體黏度U越大，越不容易離心；

④離心力（r（n2）的大小對固液分離很有影響，要增大離心力來提高分離效率。

離心的主要條件是：轉速和時間。

24.從達西公式分析利用膜進行固液分離要注意的問題，其目前存在的主要困難是什么？

達西公式：V=AP/IH（Rc+Rm）］。從式中可見，在4P恒定下，濾餅厚度的增加會降低過濾

速度。因此寶座過濾速度不變的一個辦法是設法阻止濾餅的生成，或者維持濾餅的厚度不

增加。

其目前存在的主要困難是：膜堵塞問題。

25.雙水相萃取的概念？為什么要進行雙水相萃??？雙水相萃取的主要操作原則是什么？

有何注意事項？

雙水相萃?。豪帽惶崛∥镌诙嘀械姆峙洳煌鴮崿F(xiàn)分離的目的；由于蛋白質(zhì)在有機相

中容易失活，因此采用的二相均為親水相，如PEG/葡聚糖、PEG/無機鹽等，稱為雙水

相，兩相密度不同，輕相富含一種高分子，重相可能富含另一高分子，細胞碎片和蛋白質(zhì)

在二相間的分配系數(shù)不同，從而實現(xiàn)分離的目的。

進行雙水相萃取的原因：

?核酸等大部分雜質(zhì)一般處于下相，可以一并除去；

?下相是無機鹽富集相，作為廢棄物成本低些；

?蛋白質(zhì)保持于上相的PEG層有利于其活性的保持；

?碎片在下相有利于離心機的連續(xù)分離。

雙水相萃取的主要操作原則是：將碎片分配在下層（調(diào)節(jié)PEG和無機鹽濃度比例，可以控

制細胞碎片在上下層間的分配）。

做的時候要考慮以下幾點：PEG濃度；PEG分子量；鹽和pH值。

26.膜分離技術的優(yōu)點？

①.處理效率高，設備易于放大；

②.可在室溫或低溫下操作，適宜于熱敏感物質(zhì)分離；

③.化學與機械強度最小，減少失活；

④.無相變，省能；

⑤.選擇性好，可在分離、濃縮的同時達到部分純化的目的；

⑥.選擇合適膜與操作參數(shù)，可得到較高的回收率；

⑦.系統(tǒng)可密閉循環(huán)，防止外來污染；

⑧.不外加化學物，透過液可循環(huán)使用，降低了成本，并減少了對環(huán)境的污染。

27.膜污染與濃差極化的主要區(qū)別？

膜污染與濃差極化的主要區(qū)別是濃差極化是一個可逆的過程，膜污染是一個不可逆的現(xiàn)象。

應該說，一旦料液與膜接觸，膜污染即開始；也就是說，由于溶質(zhì)與膜之間相互作用產(chǎn)生

吸附，開始改變膜特性。操作運行開始后，由于濃度差極化產(chǎn)生，尤其在低流速、高溶質(zhì)

濃度情況下，在膜面到達或超過溶質(zhì)飽和溶解度時，便有凝膠層形成，導致膜的透量不以

來于所加壓力，一起膜透過通量的急劇降低，在這種情況下運行的膜，使用后必須清晰，

以恢復其性能。

28.超濾親和純化：將超濾技術優(yōu)點和親和技術優(yōu)點結合起來的一種分離技術。具有分

離純度高和易于大規(guī)模工業(yè)化的優(yōu)點。

①.其原理是：

②.親和結合，利用與待分離物質(zhì)有親和力的大分子物質(zhì)親和結合待分離物質(zhì)；

③.洗滌：選擇合適的超濾膜進行透濾；

④.解離：使大分子親和復合物分離，選用合適膜進行超濾使待分離物質(zhì)透過膜并進一

步濃縮；

⑤.再生：使大分子親和基再生并進入下一輪超濾親和過程。

29.非