《醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)》(研究生)全冊配套完整課件

《醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)》(研究生)全冊配套完整課件醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)課程情況參考書目：《人類分子遺傳學(xué)》（原書第三版）T.斯特羅恩，A.P.里德編著

孫開來主譯

科學(xué)出版社《癌生物學(xué)》

RobertWeinberg著詹啟敏劉芝華主譯

科學(xué)出版社課程情況任課教師：楊雪艷講師生命科學(xué)學(xué)院

主講原理部分

手機mail：xueyanyang@

逸夫科技樓306室陳紅巖講師生命科學(xué)學(xué)院

主講技術(shù)部分

課程情況考試方式：閉卷題型：選擇、名詞解釋、簡答成績：30%A和A-課程要求：對基本概念、基本原理的掌握；認真聽，勤思考，多看文獻，了解學(xué)科發(fā)展前沿。第一講緒論什么是醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)？生物學(xué)遺傳學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)變小了？變大了？醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)分子生物學(xué)醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)疾病發(fā)生機理、傳遞規(guī)律、診斷方法及防治措施維護健康和健康喪失后使之恢復(fù)的技藝

基因突變，表達異常，疾病發(fā)生醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)研究對象：人類健康與疾病研究手段：分子遺傳學(xué)結(jié)合傳統(tǒng)的細胞生物學(xué)、生物化學(xué)等學(xué)科的技術(shù)，結(jié)合臨床研究研究目的：篩選與鑒定疾病致病基因及其與環(huán)境因素的相互作用，揭示基因表達異常（突變等）與疾病發(fā)生的關(guān)系，建立在分子水平的疾病的基因診斷，篩選和鑒定疾病治療藥物靶點，指導(dǎo)疾病治療，進一步實現(xiàn)對疾病的基因治療。醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)為何重要？人類社會面臨的挑戰(zhàn)？人口資源環(huán)境健康戰(zhàn)爭以上各點影響著人類的生存及生存質(zhì)量，在生存質(zhì)量中人類自身的健康越來越受到關(guān)注，幾乎成為核心問題。人類的生存史就是一部疾病斗爭史疾病與人類共存疾病幫助人類完善自身疾病淘汰人類的弱勢群體人類進化的動力之一新發(fā)展，新問題？一方面醫(yī)療保健的發(fā)展,生活質(zhì)量的提高，使人均壽命延長。另一方面人類面臨一大批新老疾病的威脅：心血管病糖尿病艾滋病腫瘤其它傳染病這迫使我們不得不面對它，研究它，對付直到征服它。如何從進化的角度看待這些疾??？人類群體健康延續(xù)面臨的壓力環(huán)境脅迫逐步加大(人類自身造成的結(jié)果)；人類社會從自然界中剝離、獨立，逃避了自然選擇。這大大加重了人類的遺傳負荷。我們所能做的就是大力發(fā)展醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)及其它相關(guān)學(xué)科，提高疾病的駕馭能力。醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)的研究內(nèi)容遺傳性疾?。捍蠖酁榻K身性疾病發(fā)病率增高治療難度大疾病的遺傳因素遺傳病感染性疾病外傷遺傳性疾病與疾病的遺傳因素疾病都是遺傳和環(huán)境相互作用所致！spontaneous15%Gene-environmentinteraction78%puregenetic5%pureenvironment2%EnvironmentGenetic--++20%80%100%17%83%Schulte,1994疾病與遺傳和環(huán)境的相互關(guān)系“Geneticsloadsgun,

butEnvironmentstrigger”醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)的發(fā)展歷史醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)的發(fā)展歷史緩慢發(fā)展期啟蒙認識：一母生九子，子子不相同兄妹不宜通婚選媳婦探查兄弟是否有遺傳病孟德爾遺傳定律的發(fā)現(xiàn)本世紀初，Garrod與Batson首次運用孟德爾遺傳定律解釋一些罕見遺傳病的遺傳方式醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)的發(fā)展歷史快速發(fā)展期：生化遺傳學(xué)：對于遺傳代謝性疾病的認識生化技術(shù)的應(yīng)用：電泳技術(shù)、免疫技術(shù)、肽鏈和氨基酸分析技術(shù)、酶促反應(yīng)動力學(xué)研究技術(shù)等；血紅蛋白病、G6PD缺乏癥、苯丙酮尿癥等疾病病理機制。細胞遺傳學(xué)：染色體異常綜合癥21三體、XO、XYY等染色體異常綜合征的發(fā)現(xiàn)染色體顯帶和FISH生化遺傳學(xué)研究人類遺傳物質(zhì)的性質(zhì)，以及遺傳物質(zhì)對蛋白質(zhì)合成和對機體代謝的調(diào)節(jié)控制。1902年：GarrodA首次提出先天性代謝病概念1941年：BeadleGW和TatumEL，紅色鏈孢霉突變“一個基因一種酶”。1949年：PaulingL，鐮狀細胞貧血癥、“分子病”。

1956年：IngramVM，珠蛋白Glu

谷→Val纈。鐮刀形貧血癥細胞遺傳學(xué)研究人類染色體的正常形態(tài)結(jié)構(gòu)以及染色體數(shù)目、結(jié)構(gòu)異常與染色體病關(guān)系的學(xué)科。1923年：PainterTS，2n＝48條，XX、XY1952年：HsuTC（徐道覺）低滲處理法1956年：TjioJH（蔣再興）和Leven，46條1959年，Lejune發(fā)現(xiàn)21三體1971年，染色體顯帶技術(shù)1986年，F(xiàn)ISH唐氏綜合癥——21三體醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)的發(fā)展歷史飛躍發(fā)展期：基因水平研究疾病——醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)重組DNA技術(shù)、PCR、基因芯片、高通量測序等分子技術(shù)當(dāng)前的研究重點：功能基因組研究遺傳病病因及發(fā)病機制的闡明腫瘤遺傳學(xué)疾病的分子診斷和風(fēng)險評估藥物遺傳學(xué)與藥物基因組學(xué)醫(yī)學(xué)表觀遺傳學(xué)基因治療經(jīng)典vs現(xiàn)代經(jīng)典醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)vs現(xiàn)代醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)疾病的研究方法經(jīng)典：癥狀－－基因產(chǎn)物－－基因現(xiàn)代：反求遺傳學(xué)定位克隆經(jīng)典醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)vs現(xiàn)代醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)疾病的致病機制研究經(jīng)典：細胞、生化

局限性：不適用于所有的遺傳病

不能從根本上闡明致病機制現(xiàn)代：分子水平研究疾病病理機制DNA水平、RNA水平、蛋白水平基因的結(jié)構(gòu)、功能、表達和調(diào)控經(jīng)典醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)vs現(xiàn)代醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)疾病的診斷方法經(jīng)典：細胞學(xué)、組織化學(xué)、細胞遺傳學(xué)、免疫學(xué)、生物化學(xué)現(xiàn)代：基因水平，特別是PCR技術(shù)經(jīng)典醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)vs現(xiàn)代醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)疾病的防治措施預(yù)防經(jīng)典：一級預(yù)防、產(chǎn)前預(yù)防現(xiàn)代：直接在DNA水平對患者、攜帶者和胎兒進行診斷治療經(jīng)典：激素替代、食物限制、蛋白替代、移植、藥物、手術(shù)現(xiàn)代：基因治療醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)進展漫談

人類基因組計劃(HGP）草圖繪制已經(jīng)成功，功能基因組研究將為疾病的預(yù)防，診斷和治療奠定基礎(chǔ)。后HGP時代二代測序GWAS（全基因組關(guān)聯(lián)研究）CNV（拷貝數(shù)變異）基因芯片

生物芯片的先鋒

高通量測序技術(shù)從遺傳病到腫瘤從Southern到PCR從組織到外周血病毒疾病檢測顯神威基因芯片的誕生DNA指紋基因診斷神奇的PCR：1變成1000萬基因算命？基因藥物新的藥物工廠“

病毒”也是幸運的使者基因治療世界首例ADA（腺苷脫氫酶）缺乏癥基因治療患者胚胎干細胞與治療性克隆胚胎干細胞誘導(dǎo)分化我國醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)研究現(xiàn)狀總體水平落后ESI評比不斷涌現(xiàn)顯著性成果致病基因基因診斷基因治療Omics研究從人類基因組計劃（HGP）1%到HapMap

計劃10%；一批微生物基因組遺傳密碼破譯：痢疾桿菌福氏2A、鉤端螺旋體、表皮葡萄球菌、騰沖嗜熱菌、弗氏志賀氏菌等基因組完成血吸蟲基因組、發(fā)育相關(guān)基因研究國際“人類蛋白質(zhì)組計劃”正式啟動。我國科學(xué)家領(lǐng)銜其中的“人類肝臟蛋白質(zhì)組計劃”疾病基因克隆克隆了神經(jīng)性耳聾、家族性房顫基因、人類短指綜合癥基因、A-1型短指（趾）癥、乳光牙本質(zhì)Ⅱ型基因、白內(nèi)障的致病基因，骨質(zhì)疏松致病基因、帕金森病關(guān)鍵基因。鼻咽癌易感基因被定位，高血壓、2型糖尿病、肺癌、前列腺癌易感基因被鑒定，全面研究和鑒定了銀屑病，白癜風(fēng)，肝癌和食管癌致病易感基因。疾病診斷治療取得豐碩成果血友病B基因治療，TK基因治療惡性腦膠質(zhì)瘤，免疫基因治療，深圳賽百諾公司P53腺病毒載體，用于腫瘤基因治療重組人基因工程藥物鏈激酶、TNF、TPO、重組血管內(nèi)皮抑素Ⅲ等藥物進行了維甲酸，三氧化二砷治療急性早幼粒細胞白血病治療研究取得重大突破，使得該白血病率先得到有效治療甚至治愈。丙肝病毒分子基礎(chǔ)研究取得多項創(chuàng)建性成果—疫苗研究、分子機制闡明、診斷試劑開發(fā)奠定了基礎(chǔ)轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)獲重大突破復(fù)旦大學(xué)發(fā)育生物學(xué)研究所的科研人員在世界上首次創(chuàng)立哺乳動物轉(zhuǎn)座因子系統(tǒng)，極大提高了基因剔除小鼠研究的功能，轉(zhuǎn)基因羊、轉(zhuǎn)基因牛、克隆牛、克隆羊、人羊嵌合體、iPS克隆鼠研究取得重要成果，為疾病模型、生物醫(yī)藥和器官移植疾病治療和干細胞治療奠定了基礎(chǔ)。謝謝大家！轉(zhuǎn)基因動物與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)什么叫模式生物（Modelorganism）TechnicaldifficultyComplexityDrosophilazebrafishmousehumanC.elegansyeast生物體由低等向高等、由簡單向復(fù)雜的進化過程中，很多生物學(xué)過程在不同生物物種中是非常保守的。因此，可以通過選擇合適的物種，對其開展研究，獲得對生命基本規(guī)律或者人類健康的認識，這樣的物種就稱為模式生物模式生物的特點1)有利于回答研究者關(guān)注的問題，能夠代表生物界的某一大類群；2）對人體和環(huán)境無害，容易獲得并易于在實驗室內(nèi)飼養(yǎng)和繁殖；3）世代短、子代多、遺傳背景清楚；4）容易進行實驗操作，特別是具有遺傳操作的手段和表型分析的方法。。常用的模式生物大腸桿菌、釀酒酵母、線蟲、果蠅、斑馬魚、大鼠、小鼠等，在高等植物研究中常用擬南芥等.這些物種的基因組最近都已在國際社會的努力下被測序完成。怎樣選擇合適的模式生物1.選擇的模式生物必須可以用來研究想要研究的問題。2.如果有多個模式生物符合第一條，那么盡量先選擇最簡單的一種。

上世紀八十年代初的時候，一些人開始研究細胞周期的調(diào)控。細胞周期調(diào)控一般來說指的是有絲分裂的調(diào)控，所以只能選擇真核生物，大腸桿菌就不行了。所有的真核生物都要進行有絲分裂，理論上選哪個來研究都可以，這個時候就要選擇最簡單的，也就是單細胞的。實際上當(dāng)年研究細胞周其主要用了三種常見模式生物：酵母，海膽和爪蟾。其中海膽和爪蟾用的都是卵，也都是單細胞的，簡單。用酵母是因為酵母遺傳學(xué)很發(fā)達。用海膽是因為可以得到許多細胞周期同步的卵，便于用生化方法研究。用爪蟾的卵是因為它比較大，便于進行顯微注射檢測體內(nèi)活性。例子（一）例子（二）細胞凋亡的研究。只有多細胞生物才會進行凋亡，單細胞生物是不會的。（最近由文章指出單細胞生物也有凋亡，不過還存爭議）那么單細胞生物就不能用來研究凋亡，理論上任何多細胞生物都可以。事實上細胞凋亡的研究使用的正是最簡單的多細胞模式生物：線蟲。Escherichiacoli(E.coli)大腸桿菌（E.coli

）屬腸細菌家族（Shigella,Salmonella,

Yersinia，etc），在自然界中廣泛存在適合實驗室培養(yǎng)（可以液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)），安全，培養(yǎng)條件簡單，生長迅速，克隆方便，基因操作簡便是分子生物學(xué)，遺傳學(xué)和生物化學(xué)研究中的重要模式生物也用于人類感染性疾病和其他微生物研究的模式生物1997完成測序，4.3M，4400基因，近一半功能不清.海洋中的刺客——海膽

海膽（seaurchin）是生物科學(xué)史上最早被使用的模式生物，它的卵子和胚胎對早期發(fā)育生物學(xué)的發(fā)展有舉足輕重的作用。早在1875年，OscerHertiwig（1849-1922）就開始以海膽為材料研究受精過程中細胞核的作用。1891年，HansDriesh（1876－1941）在顯微鏡下把剛剛完成第一次卵裂的海膽胚胎一分為二，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分開后的兩個細胞各自形成了一個完整幼蟲。這一實驗的意義在于證明胚胎具有調(diào)整發(fā)育的能力，為現(xiàn)代發(fā)育生物學(xué)奠定了第一塊觀念里程碑。1890年后，海膽更在受精和早期胚胎發(fā)育的研究中起了重要作用。同種海膽精卵表面分子的特異性識別、精子頂體反應(yīng)、卵皮質(zhì)反應(yīng)等現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，為受精生物學(xué)奠定了最初的基礎(chǔ)。Caenorhabditiselegans自由之蟲——線蟲1.細胞程序性死亡的遺傳調(diào)控機制2.RNAi及其作用機制3.秀麗線蟲的功能基因組學(xué)及其他研究(衰老和壽命）線蟲在生命科學(xué)研究中的重要貢獻Drosophilamelanogaster揭示遺傳規(guī)律的王牌——果蠅

果蠅都是被用來研究遺傳發(fā)育及行為生物學(xué)的理想模式生物果蠅的“同性戀”果蠅求愛4步曲:雄果蠅發(fā)現(xiàn)異性的存在，便追上去。然后“溫柔的觸碰”，用前腿輕輕地敲打雌果蠅的身體，促使對方釋放出信息素——昆蟲的催情藥。第三步是“唱情歌”，雄果蠅伸出一只翅膀，以特定的方式振動，發(fā)出特殊的聲音。一只正常的雄果蠅，會花上兩分鐘來完成這前三個步驟.第四步則是”云雨之歡”.耶魯大學(xué)的KulbirGill在研究雌性不育的問題時發(fā)現(xiàn),有一群基因變異的雄果蠅不僅追求異性，也追求同性，而且會回應(yīng)同性的追求。而普通的雄果蠅不會主動追求同性，在被同性追求時會抗拒，拍著翅膀又踢又打。Gill為此把這個基因叫做fruity，即美國俚語里的“男同性戀”。普通雄果蠅(右)追逐雌果蠅；而fru基因變異的雄果蠅追求同性，有時它們會前后連成一串，每一只雄蠅都追求自己前面的那只雄蠅.異性戀同性戀異性戀植物中的果蠅——擬南芥特點：（1）形態(tài)個體小，高度只有30cm左右；（2）生長周期快，從播種到收獲種子一般只需6周左右；（3）種子多，每株每代可產(chǎn)生數(shù)千粒種子；（4）形態(tài)特征簡單；（5）基因組小，只有5對染色體。雖然這種植物在許多方面簡單，但它的大多數(shù)基因與其他復(fù)雜的植物基因具有很高的同源性，另外，由于這種植物的全部基因組測序已經(jīng)完成，因此可以預(yù)測，擬南芥在植物學(xué)所有領(lǐng)域的研究中將發(fā)揮更大的作用。zebrafish(Brachydaniorerio)實驗室明星——斑馬魚1．成魚個體小，方便飼養(yǎng)。2．發(fā)育快、繁殖能力強、性成熟期短。受精后約40分鐘，就完成了第一次有絲分裂。24小時后，主要器官已經(jīng)形成，腦室、眼睛、耳和體節(jié)等清晰可見。相當(dāng)人類第28天的胚胎。3個月可達到性成熟。3．體外胚胎發(fā)育方便觀察和操作4．擁有較完善的胚胎和遺傳學(xué)操作技術(shù)5．品系資源豐富目前研究中常用的是斑馬魚野生型品系主要為Tuebingen品系。此外，還有3000多個突變品系和轉(zhuǎn)基因品系。

斑馬魚作為模式生物的優(yōu)勢最小的哺乳動物之一(25-40g)，世代周期短生物進化上與人類接近(60-75百萬年)胎盤形成和早期胚胎發(fā)育與人類相近組織器官結(jié)構(gòu)和細胞功能與人類相似有高級神經(jīng)活動小鼠基因組測序計劃已完成人類99%的基因存在于小鼠，基因同源性高達78.5%基因組93%的區(qū)域基因排列順序與人類相同相同基因組改造的技術(shù)手段成熟小鼠作為模式生物的優(yōu)勢Whyme?小鼠的應(yīng)用領(lǐng)域安全性和毒性試驗：常選用小鼠進行食品、化妝品、藥物化工產(chǎn)品等的安全性實驗，急性、亞急性、慢性、毒性試驗，還可做致畸、致癌致突變試驗，半數(shù)致死量測定等。生物效應(yīng)測定和藥物效價比較

藥物的篩選放射學(xué)研究遺傳性疾病研究免疫學(xué)研究：各種免疫缺陷小鼠，如純系新西蘭黑色小鼠（NZB）有自身免疫性溶血性貧血，AKR/N品系小鼠有補體C5缺損，CBA/N小鼠無B細胞的免疫缺陷等，都是研究免疫機理和免疫缺陷病的良好實驗動物。二、轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)基因動物是指基因組中穩(wěn)定地整合有以實驗方法所導(dǎo)入的外源基因(或特定的DNA片段)的動物。這類動物由于外源性目的基因的穩(wěn)定存在而賦于子代動物個體。轉(zhuǎn)基因動物制備方法Pronuclearmicroinjection(原核注射）EStransgensis（胚胎干細胞）Cloning(nucleartransfer)（核移植）Retrovirusvector（逆病毒載體）Spermvector（精子載體介導(dǎo)）ICSI（卵母細胞胞質(zhì)內(nèi)單精子注射）SSCstransgensis（精原干細胞）

Transposon(轉(zhuǎn)座子)1.顯微注射法顯微注射法是建立得最早的轉(zhuǎn)基因方法，也是目前使用最為廣泛、最為有效的方法。其所具有的優(yōu)點是:基因的轉(zhuǎn)移率高，整合效率可達30%:可直接用不含有原核載體DNA片段的外源基因進行轉(zhuǎn)；常能得到純系動物;實驗周期相對比較短。外源基因基因微注射移植受精卵小鼠出生轉(zhuǎn)基因鼠的檢測繁殖后代顯微注射顯微注射轉(zhuǎn)GFP綠色熒光胚胎顯微注射2.精子載體法&精原干細胞精子確有攝入和攜帶外源DNA的能力。但是，通過SMTG真正產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的只有少數(shù)實驗室。他們的報導(dǎo)有待于進一步證實。此外，目前還不十分清楚外源DNA在進入精核后究竟是如如何被整合到基因組，進一步揭示其機理將有助于加快通過SMTG轉(zhuǎn)基因的研究和應(yīng)用。精子載體法NaturalfertilizationSpermvector精子載體法優(yōu)點：方便簡單，嵌合體比例低缺點：重復(fù)性差機制不清實證：精子能夠結(jié)合DNA假說：精子吸收、轉(zhuǎn)運DNA改進：提高精子通透性的方法（質(zhì)脂體，電擊）精子載體法精原干細胞法

精原干細胞(spermatogonialstemcells,SSCs)的研究是近些年來干細胞研究中新興的熱點。精原干細胞(SSCs)是成年雄性哺乳動物精子發(fā)生的基礎(chǔ),是一種獨特的在出生后仍能保持自我更新能力和具有進行定向分化潛能的細胞,也是唯一一種向后代傳遞遺傳信息的成體細胞。將精原干細胞在體外培養(yǎng)經(jīng)基因修飾之后,再進行移植入受體動物睪丸,使之分化為精子進行交配,產(chǎn)生后代,這一技術(shù)路線可以用于轉(zhuǎn)基因動物的制作。

把外源基因直接整合進精原干細胞,在細胞水平上篩選,繼而自體或異體移植,借助受體曲精細管的生精環(huán)境產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因精子,通過自然交配生成大量轉(zhuǎn)基因后代。這一技術(shù)供體來源廣泛,實驗成本低廉,且生產(chǎn)周期短,應(yīng)用前景廣闊。精原干細胞法適合大片段DNA或人工染色體（YAC、BAC、MAC…)嵌合體比例低效率高操作復(fù)雜，技術(shù)難度大涉及受精機理1999年，轉(zhuǎn)基因小鼠(Perryetal,Science)2001年，BACandMAC基因小鼠(Perryetal,NatureBiotech)2004年，YAC基因小鼠(Pedrodetal,BiolReprod)精原干細胞法哺乳動物核移植是指將胚胎單個卵裂球或體細胞核(核供體)移入去核的成熟卵母細胞或受精卵(核受體)中，采用一定的方法激活卵母細胞，使核供體和核受體融合為重構(gòu)胚，經(jīng)移植后發(fā)育成新個體的技術(shù)。通過核移植，可以不經(jīng)過有性繁殖過程，連續(xù)不斷地復(fù)制遺傳上相同的胚胎，再借用胚胎移植技術(shù)，生產(chǎn)大量基因型相同的動物系或動物群體。根據(jù)核供體的不同分為胚細胞核移植(胚胎克隆)和體細胞核移植兩種。3.核移植法*動物所有體細胞(紅細胞除外)的核中都包含了發(fā)育所需的全部遺傳信息核移植法原理核移植法核移植法核移植法核移植技術(shù)的應(yīng)用

①畜牧生產(chǎn)方面：培育良種動物。②保護瀕危動物。③醫(yī)藥衛(wèi)生方面：生產(chǎn)醫(yī)用蛋白、組織和器官移植等。核移植技術(shù)存在的問題

①成功率低。②克隆技術(shù)的各個環(huán)節(jié)有待進一步改進。③克隆動物存在健康問題，表現(xiàn)出遺傳和生理缺陷。將ES細胞植入動物囊胚后,可參與宿主胚胎的形成,直至達到種系嵌合,因此,可將其作為一種載體,把外源DNA導(dǎo)入ES細胞就可以實現(xiàn)由此發(fā)育而成的轉(zhuǎn)基因動物。該方法的優(yōu)點是外源基因的整合率很高,約50%,整合率在生殖細胞中的比例約為30%。缺點是不易建立ES細胞系。4.胚胎干細胞途徑胚胎干細胞途徑胚胎干細胞途徑胚胎干細胞途徑5.逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染法1974年，Jaenisch等人將SV40DNA導(dǎo)入小鼠早期胚胎的胚泡內(nèi)，在所發(fā)育成的成體小鼠中，發(fā)現(xiàn)有SV40DNA存在。由于逆轉(zhuǎn)錄病毒具有感染效率高、宿主范圍廣、結(jié)構(gòu)簡單易于準確控制等特點，是早期胚胎外源基因?qū)氲囊环N有效方法。優(yōu)點：1.外源基因在受體細胞的基因組中通常是一個拷貝整合。2.整合通常發(fā)生在逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR中，保證了外源基因結(jié)構(gòu)的完整性2.不需要昂貴的顯微注射設(shè)備缺點：1.做成的轉(zhuǎn)基因小鼠都是嵌合體2.能被導(dǎo)入的基因的大小有一定限制，通常為10kb左右。逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染法方法優(yōu)缺點原核顯微注射

傳統(tǒng)方法，主要用于小鼠轉(zhuǎn)基因，在大動物上，轉(zhuǎn)基因效率不到1%，而且隨機整合可能引起的有害的基因突變慢病毒性載體

轉(zhuǎn)基因效率高，但是慢病毒性載體不能攜帶大的DNA片段(>10)BAC,YAC載體

可攜帶大的DNA片段(BAC:300Kb,YAC2M)，BAC較YAC更理想精子載體

優(yōu)點是簡單易行，缺點是效果不確實核移植,胚胎干細胞

優(yōu)點是提供了對細胞進行轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)和選擇的機會。但是對胚胎進行顯微注射和隨后的胚胎移植，影響胚胎的成活率精原干細胞可以大量分裂增殖和自我復(fù)制，源源不斷地產(chǎn)生大量的精子，生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物不需要顯微注射-胚胎移植，從而提高了轉(zhuǎn)基因效率

轉(zhuǎn)基因動物的鑒定BiopsySouthernblotPCRanalysis(9.5dpc)GFP+,GFP-embryosGFP+tailGFP-,GFP+mice轉(zhuǎn)基因動物的鑒定基于表型三、轉(zhuǎn)基因動物在醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)上的應(yīng)用1.正?；蛉笔图膊〉霓D(zhuǎn)基因動物模型2.正?；蜻^量表達而引起的疾病模型3.致病基因表達而引起的疾病模型（一）遺傳病的轉(zhuǎn)基因動物模型（二）傳染性疾病的轉(zhuǎn)基因小鼠模型適用于那些對人類危害大、流行性強、其致病原對常用實驗動物又不易感的傳染性疾病。（如：乙肝和艾滋?。⒉≡w的基因組DNA通過顯微注射導(dǎo)入小鼠受精卵的雄原核，以得到基因組中整合有所導(dǎo)入的病原體DNA的轉(zhuǎn)基因小鼠，在根據(jù)組織學(xué)及血清學(xué)等方面的指標，篩選出符合醫(yī)學(xué)實驗要求的小鼠，并按一定的方式交配，從而得到穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因小鼠品系，作為實驗研究的動物模型。（三）轉(zhuǎn)基因小鼠在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用1.腫瘤發(fā)生的分子病理學(xué)研究：癌基因是如何表達？表達的產(chǎn)物是如何發(fā)生生物學(xué)效應(yīng)的。2.腫瘤的防治研究：有效藥物和治療方案的篩選3.化學(xué)藥物的致癌性檢測（四）炎癥性疾病類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎轉(zhuǎn)基因動物研究中存在的問題及對策存在問題：1.制作轉(zhuǎn)基因動物成功率低、成本高2.外源基因表達水平不高3.造成宿主基因突變啟動子的選擇整合的轉(zhuǎn)基因表達受位置效應(yīng)和基因座結(jié)構(gòu)的影響1.導(dǎo)入大片段基因2.基因搭救和共整合3.增添基質(zhì)附著區(qū)（MAR)基因診斷

一、基因診斷概念二、基因診斷方法三、基因診斷實例本章主要內(nèi)容醫(yī)學(xué)診斷臨床檢體診斷影像學(xué)診斷實驗室診斷組織（細胞）病理診斷基因診斷概念實驗室診斷生物化學(xué)檢驗免疫學(xué)檢驗血液學(xué)檢驗微生物學(xué)檢驗基因診斷基因診斷概念基因診斷：利用分子生物學(xué)技術(shù)從DNA水平檢測人類遺傳性疾病的基因缺陷，又稱DNA分析法。廣義的分子診斷：包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)分析。

傳統(tǒng)的診斷：表現(xiàn)型→基因型基因診斷：基因型→表現(xiàn)型（逆向診斷）基因診斷概念基因診斷的特征1.不受材料來源影響外周血、活體穿刺組織、孕婦外周血、血斑等2.癥狀前診斷尤其對于一些延遲顯性疾病如Huntingtong舞蹈病3.產(chǎn)前診斷避免患兒出生，提高人口質(zhì)量基因診斷概念前景2000年,DNA診斷試劑全球銷售額達到一個新的水平億美元;2004年,銷售額達到20億美元現(xiàn)代分子診斷試劑的生產(chǎn)和銷售已成為現(xiàn)代生物技術(shù)中利潤很高的一項行業(yè).二、基因診斷技術(shù)（一）Southern印跡雜交二、基因診斷技術(shù)（二）Northern印跡雜交二、基因診斷技術(shù)（三）斑點雜交點樣Probe-32P檢測AB1234二、基因診斷技術(shù)（四）熒光原位雜交二、基因診斷技術(shù)（四）熒光原位雜交二、基因診斷技術(shù)（五）聚合酶鏈反應(yīng)二、基因診斷技術(shù)（五）聚合酶鏈反應(yīng)☆

多重PCR在一個PCR體系中加入數(shù)對PCR引物，覆蓋區(qū)域不重疊用于檢測同一基因多個外顯子的缺失。E1E2E3二、基因診斷技術(shù)（六）實時熒光定量PCRPCR擴增反應(yīng)中，引入一種熒光化學(xué)物質(zhì)，對每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測可以得到熒光擴增曲線實現(xiàn)對起始模板定量和定性分析二、基因診斷技術(shù)（七）染料法的特點成本低

適合初步篩查先用SYBR篩查，再用探針法精確定量少數(shù)關(guān)鍵樣品熔解曲線鑒定PCR有無雜帶、引物二聚體無模板特異性不能分辨主帶與雜帶，給出的是總信號不能做多重檢測每孔只能檢測一個目標基因靈敏度低

適合于5000拷貝以上的基因定量信號強度與結(jié)合探針的DNA分子數(shù)成正比探針法的特點目標高特異性無需做熔解曲線，陰性結(jié)果確定重復(fù)性較好設(shè)計相對簡單只適合一個特定目標公司標記，價格高探針有一定本底熒光☆PCR-SSCP（SingleStrandConformationPolymorphism）單鏈DNA由于堿基序列不同可引起構(gòu)象差異，這種差異將造成相同或相近長度的單鏈DNA電泳遷移率的不同。據(jù)此，可用于DNA中單個堿基的替代、微小的缺失或插入的檢測。二、基因診斷技術(shù)（八）

primer

↓32P-dNTP摻入PCR擴增產(chǎn)物↓變性↓單鏈DNA↓

中性聚丙烯酰胺凝膠電泳

↓12345

自顯影↓

1為正常結(jié)果分析2、4、5為純合患者

3為雜合子

.

生物芯片二、基因診斷技術(shù)（九）三、基因診斷方法及實例直接診斷——直接檢測致病基因的突變基因突變類型——點突變、缺失、重復(fù)、插入等間接診斷——應(yīng)用DNA多態(tài)為遺傳標記進行連鎖分析，確定待測者是否得到帶有致病的染色體，從而間接地作出診斷

DNA多態(tài)——RFLP、VNTR、SNPDNA多態(tài)（DNAPolymorphism）：群體中每個個體DNA區(qū)域中等位基因（或片段）存在兩種或兩種以上的形式，對基因功能沒有影響，稱DNA多態(tài)。它通過孟德爾方式遺傳。常用做遺傳分析中的標記。DNA分析中常用的遺傳性多態(tài)性標記有3類：1）RFLP：稱限制性片段長度多態(tài)性，為第一代多態(tài)性標記；2）重復(fù)序列多態(tài)性（VNTR）：如短串聯(lián)重復(fù)序列（STR），為第二代多態(tài)性標記；3）單堿基多態(tài)性（SNP）：DNA序列的單個核苷酸的差別，為第三代多態(tài)性標記。一)

限制性片段長度多態(tài)性RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP由于堿基變異可能導(dǎo)致限制酶切點消失或新的酶切點出現(xiàn)，引起不同個體DNA在用同一限制酶切割時，產(chǎn)生不同長度的DNA片段，稱RFLP。RFLP按孟德爾（共顯性）方式遺傳，是非常有用的遺傳標記。AlleleII產(chǎn)生了新的酶切點

AlleleI

AlleleII12Kb8Kb4Kbprobe12Kb8Kb

RFLP—Southernblot檢測結(jié)果

AlleleII酶切位點消失二)數(shù)目變異串聯(lián)重復(fù)

variablenumbertandemrepeats,VNTR）重復(fù)序列以各自的核心序列（重復(fù)單元），首尾相連多次重復(fù)，稱為串聯(lián)重復(fù)序列，其重復(fù)次數(shù)在人群中存在變異，形成多態(tài)即VNTR。散在分布于染色體上。重復(fù)單位6~25bp長，稱為小衛(wèi)星DNA。

重復(fù)單位2~6bp長，如（TA）n,(CGG)n等，稱為微衛(wèi)星DNA。VNTR兩側(cè)酶切位點固定，但兩酶切點之間的串聯(lián)重復(fù)拷貝數(shù)不同，酶切后產(chǎn)生不同長度的片段。DNA多態(tài)可以通過PCR擴增后電泳來檢出，稱擴增片段長度多態(tài)（amplifiedfragmentlengthpolymorphism,Amp-FLP）VNTR酶切，電泳后的檢測結(jié)果

大小PCR-VNTR檢測PCR-VNTR三)單核苷酸多態(tài)性（SNP）（SingleNucleiotidePolymorphism）SNP：發(fā)生在基因組中的單個核苷酸的替代根據(jù)SNP在基因中的位置，分為：基因編碼區(qū)SNP

基因周邊SNP

基因間SNP在人類基因組中每1250個核苷酸就有一個SNPSNPs檢測方法的分類一、區(qū)分SNPs位點的方法1.基于雜交的方法2.基于酶的方法3.以構(gòu)象為基礎(chǔ)的方法4.直接測序的方法二、檢測分析技術(shù)1.凝膠分析技術(shù)2.熒光檢測技術(shù)3.DNA芯片4.質(zhì)譜檢測技術(shù)145Taqman

法采用高溫連接酶檢測反應(yīng)技術(shù)進行基因分析

其原是高溫連接酶檢測到模板DNA與兩條探針DNA的接頭處存在著堿基錯配，則連接反應(yīng)不能進行。左側(cè)探針與模板有一個堿基不配對，連接反應(yīng)不能進行。右側(cè)的探針與模板完全互補，連接反應(yīng)完成，進行測序后分型。MassARRAYiPLEX（分子量陣列技術(shù))）芯片技術(shù)二、基診斷方法及實例

直接檢測致病基因本身的異常。通常使用基因本身或鄰近DNA序列作為探針，進行Southern雜交，或通過PCR

擴增產(chǎn)物，以檢測基因點突變、缺失、插入等異常及性質(zhì)。主要適用于已知基因異常疾病的診斷。直接基因診斷及實例鐮形細胞貧血的Gene診斷

β珠蛋白鏈基因第6位密碼子發(fā)生突變

GAG——GTG

谷Aa——纈Aa1）Southernblot2)等位基因特異核苷酸探針

(Allele-specificoligonucleotide，ASO)診斷

已知突變Gene部位和性質(zhì)，合成寡核苷酸探針，32P標記，進行斑點雜交。

NormalβΑGene——與正常ProbeβΑ雜交穩(wěn)定

MutationβSGene——與異常ProbeβS雜交穩(wěn)定

等位基因特異性寡核苷酸探針（ASO）斑點雜交結(jié)果：

βΑ/βΑβΑ/βSβS/βS

正常探針

突變探針突變型遺傳病的直接基因診斷突變型遺傳病的直接基因診斷SSASASAA點突變的基因檢測:高分辨率溶解曲線

(HighResolutionMelt,HRM))雙鏈飽和染料高精確度PCR儀0.02度/step高通量：1次可同時檢測10-384樣本。高敏度：HRM檢測靈敏度達1%-0.1%，是傳統(tǒng)“PCR+測序”方法25-250倍。特異性好：PCR產(chǎn)物無需后續(xù)處理，特異性達100%。操作簡便：只需設(shè)計PCR引物，進行PCR反應(yīng)，無需序列特異性探針，無需測序，也不受突變堿基位點與類型的局限.成本低：相比傳統(tǒng)的SNP/突變分析法和定量探針法，簡化了操作時間和步驟，大大降低了使用成本，并且拓展了其應(yīng)用面。適用范圍廣：可用于新鮮或酒精固定、石蠟包埋的手術(shù)標本，也可用于微量的穿刺或活檢標本、血液標本、糞便標本等非手術(shù)標本的檢測。傳統(tǒng)“PCR+測序”方法難以檢測大部分不能手術(shù)的患者。HRM技術(shù)優(yōu)勢BamHIBamHIα2α1α210kb14kbprobe

1）地中海貧血的基因診斷

基因不同程度的缺失可引起不同類型的地中海貧血。直接基因診斷—

缺失型遺傳病的直接基因診斷

αα/αααα/α-αα/--α-/----/--

正常缺1缺2缺3缺414kb10kb缺失型遺傳病的直接基因診斷Southernblot檢測結(jié)果2）β地貧的Gene診斷β珠蛋白基因兩側(cè)有pstI酶切位點，pstI酶切正?？傻玫?.4kb片段β珠蛋白基因缺失0.7kb片段，pstI酶切則得到3.7kb片段為β0

缺失型遺傳病的直接基因診斷以βGene為探針，Southernblot方法檢測

βΑ/βAβΑ/β0β0/β0

4.4kb3.7kb缺失型遺傳病的直接基因診斷3）DMD的基因診斷DMD屬XRDMD基因是最大的基因，有79個外顯子DMD基因突變主要以缺失為主，可涉及基因的不同部位E1E2E3缺失型遺傳病的直接基因診斷病例外顯子12345678Pm34350136476052bp535113缺失型遺傳病的直接基因診斷二）間接基因診斷方法及實例

當(dāng)致病基因雖然已知，但其異常性質(zhì)未知時，或疾病Gene本身尚未知時，主要通過Gene和DNA多態(tài)的連鎖分析間接地作出診斷。

連鎖分析基于遺傳標記與Gene在染色體上連鎖，通過對受檢者及其家系進行連鎖分析，分析子代獲得某種遺傳標記與疾病的關(guān)系，間接推斷受檢子代是否獲得帶有致病基因的染色體，間接地判斷并做出診斷。遺傳標記是基因組中的DNA多態(tài)如：RFLP，VNTR等。間接基因診斷遺傳標記相關(guān)基因表型分析間接基因診斷是一種常染色體隱性遺傳疾病，主要是苯丙氨酸代謝異常。由于體內(nèi)的苯丙氨酸羥化酶基因突變，使體內(nèi)的苯丙氨酸羥化酶活性減弱或消失，造成的食入進入的苯丙氨酸不能正常的代謝，從而使苯丙氨酸及其代謝產(chǎn)物在體內(nèi)堆積，造成對神經(jīng)系統(tǒng)不可逆的損傷。

1.Southernblot--RFLP診斷苯丙酮尿癥(PKU)

PAH基因兩側(cè)有Msp1酶切位點,用該酶消化可產(chǎn)生23kb、19kb兩種等位片段，以PAHcDNA為探針與PKU家系成員外周血DNA雜交。間接基因診斷患者為19kb片段的純合子,說明患者缺陷的PAH基因與19kb片段連鎖其父、母親缺陷的PAH基因與19kb片段連鎖，其23kb片段與正常PAH基因連鎖。II2為23kb和19kb片段的雜合子，為表型正常的致病基因攜帶者。間接基因診斷2.成年型多囊腎病的診斷例：成年型多囊腎病——APKD，AD，臨床表現(xiàn)為腰痛，蛋白尿，血尿，高血壓，腎盂性腎炎，腎結(jié)石。最終導(dǎo)致腎功能衰竭和尿毒癥。APKD——Gene定位16p13，但致病基因尚未克隆，基因產(chǎn)物的生化性質(zhì)和疾病發(fā)病機理也尚未闡明，但已證實APKDGene與α珠蛋白基因3`端附近的一段小衛(wèi)星DNA序列（3`HVR）緊密連鎖，因此，可以通過ＲＦＬＰ連鎖分析進行診斷。間接基因診斷

以3`HVR為探針，與PvuII酶切后的家系有關(guān)成員的基因組DNA進行SouthernBlot

PvuII酶切變性變性基因組DNADNA片段轉(zhuǎn)膜探針雜交結(jié)果分析間接基因診斷1212345

5.7kb3.4kb2.3kb

間接基因診斷結(jié)果分析

患者（I1、II1和II2）有3.4kb片段，說明致病基因與3.4kb片段連鎖，并按孟德爾方式遺傳。II5不含3.4kb片段，產(chǎn)前診斷正常。間接基因診斷3.甲型血友病診斷（PCR-RFLP）甲型血友病的基因診斷：已知甲型血友病XR，獲得家系成員基因組DNA。

PCR142bpBcLI

142bp99bp43bp

電泳結(jié)果分析p1p2142bp99bp43bpBclIBclI-BclI+間接基因診斷間接基因診斷

142bp99bp12123ⅠⅡIII1間接基因診斷結(jié)果分析1）先癥者II1具有99bp片段而發(fā)病，該片段來自母親。2）II2有142bp/99bp，為雜合子。142bp來自父親，為正常片段，99bp片段是來自母親而成為攜帶者。3）Ⅲ1為99bp片段如果是男性為患者（99bp片段來自母親）；女性為攜帶者（來自父母雙方）間接基因診斷分子診斷的發(fā)展方向1）分子診斷的內(nèi)容從傳統(tǒng)的DNA診斷發(fā)展到核酸及其表達產(chǎn)物（mRNA、蛋白質(zhì)）的全面診斷；2）分子診斷的策略從利用分子雜交、PCR等單一技術(shù)的診斷發(fā)展到有機組合多項技術(shù)的聯(lián)合診斷；3）分子診斷的方法從定性診斷發(fā)展到半定量和定量診斷，核酸標記技術(shù)，特別是熒光標記技術(shù)的發(fā)展，熒光定量PCR技術(shù)等方法日益成熟；4）分子診斷的范圍從單基因疾病的診斷發(fā)展到多基因?。[瘤、心腦血管疾病、代謝病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病等）的診斷；5）分子診斷的應(yīng)用多治療性診斷發(fā)展到預(yù)防性分析評價，特別是針對高危人群進行疾病基因或疾病相關(guān)基因的篩查?；蛟\斷意義

現(xiàn)癥病人的診斷：爭取有效、針對性治療。產(chǎn)前診斷：意義更為重要，預(yù)防遺傳病患兒的出生

醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)楊雪艷第七講癌癥的分子遺傳學(xué)184第一節(jié)害群之馬:基因、細胞及癌癥的性質(zhì)細胞叛逆者：癌癥的起源腫瘤并非入侵的外敵，它們與構(gòu)成機體的正常細胞同宗同門；癌細胞是離經(jīng)叛道、罔顧公德、恣意妄為的細胞；細胞是在強大的選擇壓力下演變成為腫瘤細胞的；對于有機體而言，強有力的選擇機制以防止其死于癌癥由一個正常的上皮細胞轉(zhuǎn)變成具有侵襲力的癌平均需要6個連續(xù)的突變。機體1013個細胞，突變率10-7186癌的多階段演化過程187癌癥是一個特立獨行細胞的后代還是一幫怪異細胞集體倒戈？188腫瘤單克隆生長的證據(jù)IHforG6PDofintestinesections189190腫瘤單克隆的其他證明191第二節(jié)癌癥起源的線索：外部世界如何影響細胞內(nèi)部癌癥起源的線索：外部環(huán)境？癌癥直到19世紀仍是罕見的病種；1761年，英國醫(yī)生JohnHill注意到了鼻癌的發(fā)展與長期過度吸鼻煙有關(guān)；1775年，倫敦醫(yī)生Percival

Pott提出早年干過掃煙囪的男人易患陰囊癌；19世紀，德國東部瀝青鈾礦的礦工們患肺癌死亡；20世紀，與X線打交道的人易患皮膚癌和白血??；20世紀50年代，吸煙人群的肺癌發(fā)病率日益上升。不同國家之間癌癥的發(fā)病率存在巨大差異。193吸煙增加了患肺癌的風(fēng)險194不同癌癥的發(fā)病率與種群和生活方式均有關(guān)195哪些環(huán)境因素會引發(fā)癌癥？日本山際克三郎的兔子嚙齒類動物致癌測試上千種化合物具有致癌效應(yīng)致癌作用最強的化學(xué)物之一是黃曲霉毒素埃姆斯測試（Amestest）誘變力=致癌力196首次通過化學(xué)致癌物誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤1951年，KatsusaburoYamagiwa誘導(dǎo)兔耳產(chǎn)生的皮膚癌標本，此腫瘤經(jīng)煤焦油處理660天后收集保存。197測定致突變能力的Ames試驗198火上澆油：非誘變因素的致癌物酒精：反復(fù)接觸高濃度酒精會殺滅大多數(shù)口腔和咽喉內(nèi)壁細胞。組織內(nèi)部毗鄰細胞得到指令，進行生長和分裂來填補空缺。HBV：在受感染者肝臟內(nèi)長期且大批殺滅肝細胞，未受感染的幸存細胞前仆后繼地生長、分裂。雌激素：在經(jīng)期和孕期，雌激素促使乳腺管內(nèi)壁細胞增殖。乳腺上皮細胞每個月都要繁殖后死亡，周而復(fù)始。199第三節(jié)蛛絲馬跡：搜尋原癌基因病毒與腫瘤病毒導(dǎo)致人類許多人類疾病(如狂犬病，

天花，感冒等）絕大部分病毒因病毒在細胞內(nèi)瘋狂復(fù)制增殖,殺死細胞而引起疾病某些病毒的增殖過程不殺死細胞，還導(dǎo)致細胞不受控制地瘋狂生長20世紀70年代證實腫瘤病毒誘發(fā)的腫瘤只占人類腫瘤一小部分腫瘤病毒研究提供了揭開隱藏數(shù)百年的人類腫瘤秘密的鑰匙癌癥是一種基因病，可用分子生物學(xué)和遺傳學(xué)工具進行分析研究腫瘤病毒革命了人類癌癥病理學(xué)的研究201PeytonRous－

腫瘤病毒學(xué)的奠基人

1910年發(fā)現(xiàn)勞氏肉瘤病毒(Roussarcomavirus,RSV)引發(fā)雞腫瘤50多年后(1966)獲得NobelPrizeinMedicineandPhysiology202Roussarcomavirus(RSV)induceschickentumors203化學(xué)致癌說vs

腫瘤病毒說化學(xué)致癌說：腫瘤細胞內(nèi)的致癌基因并非源自病毒，是癌細胞自發(fā)產(chǎn)生的；致癌基因是由化學(xué)物質(zhì)或輻射引起正常細胞的基因改變。腫瘤病毒說：所有腫瘤細胞攜帶的是入侵腫瘤病毒強加的致癌基因；廣泛分布，偶然作惡可以解釋為何大多數(shù)人類癌癥的表現(xiàn)不同于傳染病。204Asetbackinresearchontumorviruses1913年丹麥人JohannesGribFibiger報道了大鼠胃中的螺旋菌導(dǎo)致胃瘤

1926年JohannesGribFibiger獲得了NobelPrize所稱胃瘤實際上是一些組織變形的胃表皮(meteplasticstomachepithelia).

組織變形的原因是嚴重缺乏維生素丟掉了Fibiger的實驗動物丟棄了感染性致病因子會引發(fā)腫瘤的學(xué)說205被RSV轉(zhuǎn)化的

雞胚成纖維細胞失去了接觸抑制特性

在培養(yǎng)皿中形成foci相差光鏡照片掃描電鏡照片正常CEFRSV轉(zhuǎn)化的CEF206RSVviruscarriesanextratransforminggene,srcRSV病毒就有兩種突變株:一種突變株能在感染細胞后產(chǎn)生新病毒，但不能轉(zhuǎn)化細胞，

另一種突變株感染細胞后能轉(zhuǎn)化細胞但不會產(chǎn)生新病毒。207在感染病毒和未感染的細胞中檢測src基因1974,MichaelBishopHaroldE.Varmus預(yù)期：正常細胞中沒有src癌基因；而受感染的細胞則至少有一個src基因，也就是RSV病毒輸入到細胞內(nèi)的那個癌基因。未感染的細胞核感染病毒的細胞中都有src的存在！src本是一個正常的雞基因！208所有鳥類都含有src基因Evolutionarytreeofthesrcgene209c-src

vs

v-srcc-src和v-src

是兩個非常相近的基因；c-src是一個正常細胞的基因，其作用與細胞的行為和個體的正常發(fā)育相匹配；

v-src

是由RSV病毒基因組攜帶的，是非常強的致癌基因，能將一個正常的細胞轉(zhuǎn)化成一個腫瘤細胞。210發(fā)現(xiàn)c-src原癌基因的革命性意義其他的誘變機理可能跟是激活了一個細胞原癌基因，將其轉(zhuǎn)變?yōu)榘┗?；可能致癌信息已?jīng)存在于正常細胞基因組中，等待著被發(fā)現(xiàn)；一個單個的癌基因可以引起細胞的一系列變化：包括性狀、代謝和生長行為；少數(shù)的基因足以將正常細胞變成癌細胞；其他致癌反轉(zhuǎn)錄病毒也許獲得了其他與src無關(guān)的細胞原癌基因；其他細胞原癌基因隱藏在基因組中，等著被經(jīng)過的反轉(zhuǎn)錄病毒攫取，激活。211各類致癌逆轉(zhuǎn)錄病毒及其攜帶的癌基因212J.MichaelBishopHaroldE.VarmusTheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1989fortheirdiscoveryofthecellularoriginofretroviraloncogenes213第四節(jié)一失足成千古恨：人類腫瘤中的癌基因人類腫瘤中發(fā)現(xiàn)細胞癌基因Transfection,apowerfulmethodtodetecttheoncogenefromhumantumorDNA215克隆人類膀胱癌基因H-ras的策略1x103Alu/cell1Alu/cell1x106Alu/cellT24/EJhumanbladdertumorcellcellDNA216定位人類膀胱癌基因H-ras217人類膀胱癌基因H-ras攜帶一個點突變這個H-Ras的發(fā)現(xiàn)代表著癌癥研究的的一個里程碑。首次發(fā)現(xiàn)一個基因的單個突變可誘發(fā)人類腫瘤的生長。這是一個體細胞突變產(chǎn)生的遺傳變異。218活化原癌基因的機制原癌基因點突變基因擴增原病毒插入激活

染色體易位導(dǎo)致原癌基因過表達染色體易位產(chǎn)生新結(jié)構(gòu)新功能的致癌蛋白基因的部分缺失突變

219基因擴增導(dǎo)致原癌基因激活erbB2/neu/HER2致癌基因擴增與乳腺癌

患者生存率反相關(guān)220人乳腺癌erbB2/neu/HER2

致癌基因擴增221N-myc擴增與神經(jīng)母細胞瘤的預(yù)后N-myc高擴增(>10拷貝)病人在癌癥確診和治療后的復(fù)發(fā)和癌癥相關(guān)癥狀再現(xiàn)率的比例遠高于N-myc低擴增病人，

時間也提早很多。222Myc基因家族的染色體內(nèi)、外的擴增Homogeneousstainingregions(HSRs)Myc家族的染色體內(nèi)擴增doubleminutes(DMs)Myc家族的染色體外擴增223經(jīng)常被擴增的染色體區(qū)域和其攜帶的已知基因224活化原癌基因的機制原癌基因點突變基因擴增原病毒插入激活

染色體易位導(dǎo)致原癌基因過表達染色體易位產(chǎn)生新結(jié)構(gòu)新功能的致癌蛋白基因的部分缺失突變

225原病毒插入導(dǎo)致原癌基因激活

>80%的雞白血病中AMV原病毒插入到c-myc的5’端；

大部分插入后轉(zhuǎn)錄方向與c-myc一致。226活化原癌基因的機制原癌基因點突變基因擴增原病毒插入激活

染色體易位導(dǎo)致原癌基因過表達染色體易位產(chǎn)生新結(jié)構(gòu)新功能的致癌蛋白基因的部分缺失突變

227染色體易位導(dǎo)致原癌基因過表達2:8

chain

(light)9％14:8heavychain75％22:8lchain(light)16％228B-細胞染色體易位導(dǎo)致正常c-myc基因在重鏈基因啟動子控制下組成型高表達229由于染色體異位導(dǎo)致的癌基因激活引起的各類癌癥FromG.M.Cooper,Oncogenes,1995230活化原癌基因的機制原癌基因點突變基因擴增原病毒插入激活

染色體易位導(dǎo)致原癌基因過表達染色體易位產(chǎn)生新結(jié)構(gòu)新功能的致癌蛋白基因的部分缺失突變

231染色體易位產(chǎn)生新結(jié)構(gòu)新功能的致癌蛋白(9:22)染色體易位形成bcr-abl致癌基因，導(dǎo)致白血病。bcr:

breakpointclusterregionabl:

最初在Abelsonmurineleukemiavirus發(fā)現(xiàn)的致癌基因232bcr-abl融合產(chǎn)生導(dǎo)致三種不同白血病的三種新致癌蛋白AcutelymphocyticleukeamiaChronicmyelogenousleukeamiaChronicneutrophilicleukeamia233活化原癌基因的機制原癌基因點突變基因擴增原病毒插入激活

染色體易位導(dǎo)致原癌基因過表達染色體易位產(chǎn)生新結(jié)構(gòu)新功能的致癌蛋白基因的部分缺失突變

234基因的部分缺失突變導(dǎo)致生長因子受體永久性激活1/3神經(jīng)膠質(zhì)母細胞肉瘤中，EGF受體缺少細胞外結(jié)構(gòu)域235第五節(jié)章回體小說：腫瘤的多步發(fā)育腫瘤一蹶而就還是多步發(fā)育？237癌癥發(fā)育的遷延進程女性肺癌：本世紀中葉，女性肺癌仍屬罕見。二戰(zhàn)以后大批美國婦女開始抽煙，25年以后，這些女性大量死于肺癌。二戰(zhàn)及此后十年海軍造船所短期工作的人大量接觸石棉，且是吞云吐霧的癮君子。20年，30年，乃至40年以后開始死于一種罕見癌癥——間皮質(zhì)瘤。238癌基因一蹶而就說的問題在哪里？通過基因移植注入癌基因，以一個簡單事件把正常細胞變成了癌細胞。這些細胞果真正常嗎？抑或它們已經(jīng)開始了部分癌癥之旅？采用的是永生化的小鼠細胞，已經(jīng)經(jīng)歷了明顯的癌前改變！1983年，癌基因被注入真正正常的細胞；單單注入癌基因，即使是強有力的ras也不能使完全正常的細胞變成癌細胞！嘗試將ras和myc同時注入正常細胞——這些細胞以變成癌細胞做出了回應(yīng)，而單獨應(yīng)用其中任何一種都不能產(chǎn)生這樣的結(jié)果。已知人類腫瘤攜帶多達6個突變基因。239第六節(jié)癌癥發(fā)生的剎車系統(tǒng)——抑癌基因的發(fā)現(xiàn)細胞融合實驗241癌癥表型是顯性的還是隱性的？推測：癌細胞表型（來源于獲得病毒癌基因）在癌細胞和正常細胞的雜交中是顯性的。實際上：雜種細胞沒有導(dǎo)致腫瘤的能力！242正常等位基因的功能丟失導(dǎo)致癌變tumorigenicHT1080cellnormalfibroblastcellnontumorigenichybridcellfusion+tumorcellAtumorcellBnontumorigenichybridcellfusion+tumorigenicHelacellminicellcarrieschromosome11nontumorigenicHelacellfusion+243視網(wǎng)膜母細胞瘤pedigreeofafamilialretinoblastoma244單側(cè)vs

雙側(cè)視網(wǎng)膜母細胞瘤散發(fā)性視網(wǎng)膜母細胞瘤：僅影響一只眼睛，通常終結(jié)于單側(cè)單個視網(wǎng)膜母細胞瘤；家族性視網(wǎng)膜母細胞瘤：兩只眼睛都發(fā)生腫瘤，最終雙側(cè)多個視網(wǎng)膜母細胞瘤。245二次打擊模型（Knudsonmodel）

視網(wǎng)膜母細胞瘤：缺失了兩份

拷貝的13q14;

家族性：基因組已經(jīng)丟失了一份拷

貝的13q14；

第二個拷貝丟失是由于體

細胞突變。

散發(fā)癌：

兩個拷貝的丟失都是由于

獨立的體細胞突變事件。246通過“有絲分裂重組”導(dǎo)致雜合性丟失12341,4和

2,3分離1,3和

2,4分離mitoticrecombinationfrequency10-5to10-4/cellgeneration247通過“基因轉(zhuǎn)換”導(dǎo)致雜合性丟失GeneconversionfrequencyIshigherthanthatofmitoticrec.248Rb基因發(fā)生LOH的實驗證據(jù)DemonstrationofLOHattheRblocus249結(jié)腸癌中染色體臂的LOH情況250目前克隆到的抑癌基因251鑒定抑癌基因的方法針對家族性癌癥：連鎖分析、核型分析定位基因；定位克隆鑒定候選基因；在患者中尋找突變，并在癌組織中驗證；針對候選基因：在原發(fā)癌癥和癌細胞品系里尋找該基因突變；將抑癌基因引入癌細胞系：體外實驗：軟瓊脂克隆轉(zhuǎn)化分析

細胞生長抑制分析體內(nèi)實驗：裸鼠腫瘤生長實驗構(gòu)建基因敲除小鼠（純合、嵌合、條件敲除小鼠）252醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)楊雪艷第九講癌癥的分子遺傳學(xué)（3）254第九節(jié)永生：生死有命，逃脫有術(shù)內(nèi)置自殺程序：凋亡胚胎發(fā)育過程中，凋亡像雕塑家的鑿子，毫不留情得剔除無用細胞；免疫系統(tǒng)內(nèi)，不能制造適當(dāng)抗體的細胞被大量拋棄；感染了各種病毒的細胞會努力激活凋亡程序，犧牲自己，保全周邊細胞（p53的發(fā)現(xiàn)就是來源于SV40病毒）。DNA受到不可修復(fù)損害的細胞不再試圖修復(fù)創(chuàng)傷，而是按規(guī)定自殺。凋亡的重要作用之一就是迅速消滅全身各處的越軌細胞，防止它們結(jié)黨生事。細胞內(nèi)部的生長控制系統(tǒng)存在一點點失控就會觸發(fā)死亡程序。Bcl-2癌基因?qū)ｉT阻止死亡程序的觸發(fā)，淋巴細胞通過激活該基因可以勝利大逃亡。256p53：癌基因？抑癌基因？非典型抑癌基因？將p53

cDNA克隆轉(zhuǎn)染大鼠成纖維細胞，揭示它可以和共轉(zhuǎn)染的ras癌基因共同轉(zhuǎn)化這些細胞——類似myc的癌基因？此處的p53是以來自腫瘤細胞的mRNA為模板合成的，含有一個點突變。野生型的p53等位基因?qū)嶋H功能是抑制細胞增殖——腫瘤抑制基因？大多數(shù)腫瘤抑制基因純合子失活時，幾乎無一例外的由于一個或多個組織的細胞不正常增殖而導(dǎo)致胚胎發(fā)育中斷；小鼠中兩個p53拷貝的完全缺失對絕大多數(shù)p53-/-小鼠胚胎發(fā)育并無明顯影響？——p53并不是簡單的細胞增殖負調(diào)控者；但p53仍是一個確定的腫瘤抑制基因——當(dāng)小鼠兩個p53拷貝都缺失時，生命周期會變短（約5個月），大多數(shù)死于淋巴瘤和肉瘤；p53似乎是專門阻止非正常細胞的出現(xiàn)。257基因組衛(wèi)士，死亡程序的主宰：p53細胞依賴p53感知DNA損傷，p53蛋白阻止細胞增殖，為修復(fù)機制贏得搜索和修復(fù)受損堿基序列的時間。如果消除損害，p53功成身退，細胞繼續(xù)生長。如果DNA大面積受損，p53蛋白達到很高的濃度，細胞的損害評估機制將衡量受損范圍，決定是否啟動凋亡程序。失去p53與DNA修復(fù)機制的重大缺陷一樣，摧毀了穩(wěn)定的基因組。缺乏功能正常的p53，過度累積基因副本的傾向?qū)⒃龃?000倍。缺乏p53在腫瘤不死過程中助一臂之力：沒有p53的細胞對端粒耗減視而不見，繼續(xù)生長，直至修復(fù)端粒，獲得永生。p53會誘發(fā)缺氧凋亡，缺乏p53細胞具有超長耐受力，可以堅持到成功建立血供的時刻。258p53激活信號和下游效應(yīng)259p53等位基因在人類腫瘤細胞中的突變頻率260細胞如何使p53失活的？腫瘤抑制基因的雙擊失活理論似乎不適合p53，無法解釋突變p53為何可以轉(zhuǎn)化大鼠細胞？絕大多數(shù)與腫瘤相關(guān)的p53等位基因都在編碼框中存在錯義密碼子，而不是無義密碼子；另外，p53的的序列缺失相對少見。p53是一種同源四聚體的核蛋白。答案——顯性負效應(yīng)（dominantnegative）！261p53點突變的顯性負效應(yīng)262p53水平的精細控制p53是一種半衰期才20分鐘的短命蛋白。Mdm2可以與p53結(jié)合使其調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的功能失活，并介導(dǎo)泛素與之連接并將p53從核內(nèi)轉(zhuǎn)運到胞質(zhì)中的蛋白酶體內(nèi)。純合Mdm2基因敲除小鼠在發(fā)育早期死亡，而Mdm2與p53都失活的小鼠，胚胎發(fā)育相當(dāng)正常。ARF（p16的可變剪接體）可以與Mdm2結(jié)合，將其軟禁在核仁內(nèi)，從而快速上調(diào)p53的水平。把雞蛋放在一個籃子里？p16可以調(diào)節(jié)pRB的磷酸化而其剪接體ARF可調(diào)節(jié)p53水平，更糟的是另一個pRB調(diào)節(jié)基因p15也與之連鎖，僅僅缺失40kb的染色體DNA就可以導(dǎo)致所有這些遺傳元件的丟失。

263p53等位基因種系突變導(dǎo)致的家族腫瘤易感性Li-Fraumeni綜合癥：孟德爾方式遺傳，對多種不同的腫瘤有著高度的敏感性；5歲易發(fā)生腎上腺皮質(zhì)癌→16歲易發(fā)生肉瘤→25歲時為腦腫瘤→37歲時為乳腺癌→50歲時為肺癌……大多數(shù)病例定位于19p1.3，恰好是p53的基因座位區(qū)域，測序發(fā)現(xiàn)存在p53等位基因突變。264觸發(fā)凋亡途徑細胞凋亡的內(nèi)途徑：由細胞內(nèi)部刺激信號起始；依賴p53和不依賴p53使線粒體釋放細胞色素C；細胞凋亡的外途徑：受細胞外信號活化；死亡受體+腫瘤壞死因子；由殺傷靶細胞的細胞毒素T淋巴細胞和自然殺傷（NK）細胞起始。265p53對于癌癥治療的影響原本設(shè)想化療和放療通過大面積地破壞DNA可以殺死癌細胞。現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)：劑量足以殺死癌細胞的化療和X線，實際上并沒有給癌細胞的基因組造成大范圍的損傷。相反，這些破壞剛剛夠激活p53和細胞凋亡程序。因此，治療癌癥不是大力擊殺癌細胞，而是扭曲癌細胞的控制機制，將它們推過正常生長和凋亡的分界線。癌細胞喪失p53后常常更具有耐藥性，顯然是因為難以哄騙癌細胞自殺。266“世代鬧鐘”的存在人體中許多組織的細胞注定會死亡；細胞必死性是一種重要的抗癌自衛(wèi)機制；發(fā)育著的腫瘤細胞群必定突破了細胞必死的屏障；細胞如何知道何時它用盡了分裂的份額呢？人體組織細胞中存在一個“世代鬧鐘”告訴它從受孕時算起細胞在生物體發(fā)展史上的位置。267體外培養(yǎng)的原代細胞和老化細胞的形態(tài)學(xué)差異原代細胞老化細胞268端粒的發(fā)現(xiàn)1938年，HermannMuller注意到染色體的末端跟其它區(qū)域的染色體不同，它非常穩(wěn)