《桿狀病毒昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)概述及案例分享》

桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)概述及案例分享Baculovirus–insect

cell

expression

system,BEVS-IC北京義翹神州科技股份有限公司BEVS-IC的組成與優(yōu)化1BEVS-IC的應(yīng)用2案例展示3CONTENT義翹神州BEVS-IC的組成與優(yōu)化01義翹神州義翹神州桿狀病毒：一類(lèi)具有囊膜包裹的雙鏈環(huán)狀DNA病毒，以節(jié)肢動(dòng)物為專(zhuān)一性宿主。表達(dá)用桿狀病毒通常是Autographacalifornicamultiplenucleopolyhedrovirus(AcMNPV)doi:10.1002/cpps.47義翹神州桿狀病毒：一類(lèi)具有囊膜包裹的雙鏈環(huán)狀DNA病毒，以節(jié)肢動(dòng)物為專(zhuān)一性宿主。表達(dá)用桿狀病毒通常是Autographacalifornicamultiplenucleopolyhedrovirus(AcMNPV)LifeCycleExpressionStartPromotersHoursPostInfectionInfectionDNAReplicationVirionProductionCellLysisImmediateEarly(0-6hpi)ie0ie1ie2DelayedEarly(3-6hpi)39kLate(3-24hpi)p6.9(basic)vp39VeryLate(18-24to72hpi)polyhedrinp10桿狀病毒發(fā)展重要節(jié)點(diǎn)：19831ProductionofHumanBetaInterferoninInsectCells1993BAC-to-BACExpressionSystem1953Firstcomprehensivereviewofbaculoviruschemistryandbiochemistry1962Establishedcellstrainsfromtissueculturedinvitro1971Discoveryandidentificationofthebaculovirus,Autographacalifornicanuclearpolyhedrosisvirus1972ThestructureofNuclearPolyhedrosisVirusesI.Theinclusionbody1973AcMNPVwasisolated1978~1992Analysisofbaculovirusgenomesandusedtodeveloptherecombinantbaculovirusvectors2008~2019flashBac2011~2016GeneticengineeringofbaculovirusThestorycontinues…2007~2017Insectcellengineering義翹神州昆蟲(chóng)細(xì)胞發(fā)展重要節(jié)點(diǎn)：1983Establishmentofsf9（）(Spodopterafrugiperda)1994EstablishmentofTn-5B1-4

(HighFive)(Trichopulsiani)1915spermatidfromSamiaceropia1915~1958

Exploreinsectcellcultureinvitro1959Establishmentofovariancellline(Bombyxmori)1962Establishmentofovariancellline(Antheraeaeucalypti)1970Establishmentofsf21(Spodopterafrugiperda)1986EstablishmentofTn-5B1(Trichopulsiani)2010EstablishmentofAo38Thestorycontinues…義翹神州BEVS-IC優(yōu)化義翹神州BEVS-IC的應(yīng)用02義翹神州昆蟲(chóng)-桿狀病毒與其他表達(dá)系統(tǒng)的比較：經(jīng)濟(jì)周期短高產(chǎn)量大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)后修飾匱乏易成包涵體難表達(dá)大分子蛋白酵母表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)濟(jì)快速BEVS-IC后修飾高產(chǎn)量高細(xì)胞密度可溶表達(dá)周期長(zhǎng)大分子蛋白成本高哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)修飾完全可溶表達(dá)周期長(zhǎng)成本高義翹神州特殊糖基化類(lèi)型

轉(zhuǎn)化難度高應(yīng)用場(chǎng)景重組蛋白的應(yīng)用生物藥結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究天然vs重組蛋白天然蛋白重組蛋白豐度豐度低無(wú)豐度限制動(dòng)物源有無(wú)產(chǎn)率低高批間差不可控可控andsomuchmore…工業(yè)酶生物材料藥物開(kāi)發(fā)VLP/亞單位疫苗開(kāi)發(fā)診斷試劑義翹神州表達(dá)流程義翹神州??SIMSF無(wú)血清培養(yǎng)基——專(zhuān)為Sf9和Sf21細(xì)胞設(shè)計(jì)貨號(hào)：MSF1特點(diǎn)：無(wú)血清、無(wú)蛋白最大細(xì)胞生長(zhǎng)密度：1.2×107cells/mLSf21細(xì)胞設(shè)計(jì)貨號(hào)：MSF1特點(diǎn)：無(wú)血清、無(wú)蛋白最大細(xì)胞生長(zhǎng)密度：1.2×107cells/mL：蛋白表達(dá)、Sf9/Sf21細(xì)胞培養(yǎng)、重組桿狀病毒的包裝和擴(kuò)增昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基義翹神州?SIMSF無(wú)血清培養(yǎng)基——專(zhuān)為Sf9和Sf21細(xì)胞設(shè)計(jì)貨號(hào)：MSF1

特點(diǎn)：無(wú)血清、無(wú)蛋白

最大細(xì)胞生長(zhǎng)密度：1.2×107

cells/mL

用途：蛋白表達(dá)、Sf9/Sf21細(xì)胞培養(yǎng)、重組桿狀病毒的包裝和擴(kuò)增?SIMHF無(wú)血清培養(yǎng)基——專(zhuān)為Hi-5細(xì)胞開(kāi)發(fā)貨號(hào)：MHF1特點(diǎn)：無(wú)血清、無(wú)蛋白最大細(xì)胞生長(zhǎng)密度：7.5×106cells/mL用途：Hi-5細(xì)胞的培養(yǎng)、重組蛋白表達(dá)?無(wú)動(dòng)物源、無(wú)血清SIMSF培養(yǎng)基貨號(hào)：MSF-AF特點(diǎn)：無(wú)血清、無(wú)蛋白、無(wú)動(dòng)物源用途：蛋白表達(dá)、Sf9/Sf21細(xì)胞培養(yǎng)、重組桿狀病毒的包裝和擴(kuò)增?無(wú)動(dòng)物源、無(wú)血清SIMHF培養(yǎng)基貨號(hào)：MHF-AF特點(diǎn)：無(wú)血清、無(wú)蛋白、無(wú)動(dòng)物源用途：Hi-5細(xì)胞的培養(yǎng)、重組蛋白表達(dá)相同培養(yǎng)條件下，Sf9細(xì)胞在義翹神州和競(jìng)爭(zhēng)品牌昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)水平相同培養(yǎng)條件下，Hi-5細(xì)胞在義翹神州和競(jìng)爭(zhēng)品牌昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)水平SIMHFCompetitorACompetitorB酶轉(zhuǎn)錄因子超大蛋白跨膜蛋白病毒結(jié)構(gòu)蛋白適用BEVS的蛋白類(lèi)型分泌蛋白復(fù)合體義翹神州案例展示03義翹神州重組表達(dá)策略制定ProteinIDAccession#(UniPortorNCBI)AA/cDNAsequenceBasicparametersStructuralFeaturesReferenceDisordernessCyscontentS-SprofileHydrophobicitydistributionInstabilityprofileAssessmentMw,pI…TM,PTM,domainsConstructconstruct,affinitytag,QCmethodsandstandardsPilotPOCScale-upFeasibilityassessmentTrouble-shootingFormulation,activity,stability…蛋白最終應(yīng)用決定表達(dá)和純化策略義翹神州構(gòu)建設(shè)計(jì)方案截去影響蛋白表達(dá)的區(qū)段Construct1Construct2

單次跨膜蛋白胞外區(qū)(MW=~90KDa)

昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)

純化分泌蛋白

刪去N端高疏水區(qū)促進(jìn)蛋白分泌表達(dá)義翹神州構(gòu)建設(shè)計(jì)方案功能區(qū)域串聯(lián)表達(dá)Full-length(2511AA)，~70%purity,Yield<0.5mg/LEnoylreductase+Ketoacylreductase(~1000AA)Methyltransferase+Ketoreductase(~700AA)>90%purity,Yield>20mg/L

重組人脂肪酸合成酶（FASN）

多功能域復(fù)合酶昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)純化胞內(nèi)蛋白

通過(guò)功能區(qū)串聯(lián)獲得高產(chǎn)重組蛋白義翹神州AlphaFoldmotif的靈活運(yùn)用Construct1：串聯(lián)形式1Construct2：串聯(lián)形式2功能性motif的構(gòu)建形式對(duì)蛋白的聚集情況有明顯影響義翹神州Buffer:PBSDetergentformula1Buffer:PBSDetergentformula2Buffer:PBSDetergent:DDMNi-affinitypurificationNi-affinitypurificationSECpurification不同Buffer蛋白對(duì)純化的影響義翹神州整體策略?xún)?yōu)化

重組表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子蛋白

蛋白高度無(wú)序，穩(wěn)定性差

昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)純化胞內(nèi)蛋白

構(gòu)建、培養(yǎng)和純化過(guò)程綜合優(yōu)化Construct1:Nt-GST-TF,pilotN端融合標(biāo)簽觀察到目標(biāo)蛋白表達(dá)

目標(biāo)蛋白未GSH梯度洗脫

目標(biāo)蛋白降解嚴(yán)重Construct2:Nt-TF-GST,pilot(V1)Construct2:Nt-TF-GST,scale-up

培養(yǎng)體積=10XV1

蛋白降解

培養(yǎng)體積=V1

收集Elute2并置換Buffer

目標(biāo)蛋白在高鹽buffer中較為穩(wěn)定Buffer[NaCl]=150mMBuffer[NaCl]=500mM高無(wú)序度蛋白Longestdisorderregion=166AA(166AA/384AA)Percentageofcoilstructure=79%C端融合標(biāo)簽觀察到目標(biāo)蛋白表達(dá)

目標(biāo)蛋白未GSH梯度洗脫

目標(biāo)蛋白降解緩解義翹神州美國(guó)子公司賓夕法尼亞州費(fèi)城區(qū)北京總部上海分公司歐洲子公司德國(guó)法蘭克福蘇州子公司泰州子公司廣州分公司日本子公司義翹神州義翹神州堅(jiān)持自主研發(fā)生產(chǎn)打造中國(guó)生命科學(xué)研究“一站式”試劑與服務(wù)支撐平臺(tái)人才與設(shè)施榮譽(yù)資質(zhì)設(shè)施：---25,000+平米研發(fā)中心

---7,000平米潔凈車(chē)間

團(tuán)隊(duì)：900+---碩士以上學(xué)歷占1/3---10+歐美深造經(jīng)歷14,000+

精品抗體6,500+

重組蛋白47,000+