WHO人類精液檢驗與處理實驗手冊第五版

/致謝本手冊的出版由UNDP/UNFPA/WHO/世界銀行人類生殖研究、發(fā)展和研究培訓特別規(guī)劃署與WHO人類生殖健康與研究部共同完成。我們對所有參與本手冊籌備、編輯和校訂的人員表示誠摯的感謝。另外感謝：MsCathyTreece,MsCharleneTollner和JimOverstreet教授(UniversityofCalifornia,Davis,CA,USA)提供形態(tài)學顯微照片以與對媒體文件的校對；DrRuneEliasson(SophiahemmetHospital,Stockholm,Sweden)幫助定義非精子細胞；DrGaryNClarke(TheRoyalWomen′sHospital,Carlton,Australia),DrRoelofMenkveld(TygerbergAcademicHospitalandUniversityofStellenbosch,Tygerberg,SouthAfrica)和PieterWranz教授(UniversityofStellenbosch,Tygerberg,SouthAfrica)對本手冊編譯工作提供附注。衷心感謝國際男科學會提供的經(jīng)濟支持。這個版本的手冊是為紀念已故前WHO男性生育調(diào)控方法學工作組負責人GeoffreyWaites(1928-2005)，他也是第二、第三和第四版實驗室手冊的共同編輯。編輯委員會全身心投入工作的動力來自于對Geoff誠實、公平和關(guān)心疾苦人格的欣賞?？s寫詞Abantibody抗體AIartificialinsemination人工授精AIDartificialinseminationwithdonorsemen供精人工授精AIHartificialinseminationwithhusband’ssemen夫精人工授精ALHamplitudeoflateralheaddisplacement頭側(cè)擺振幅ANOVAanalysisofvariance變量分析APAAPalkalinephosphatase:anti-alkalinephosphatasecomplex堿性磷酸酶:抗堿性磷酸酶復(fù)合物ARacrosome-reacted頂體反應(yīng)ARTassistedreproductivetechnology輔助生殖技術(shù)ASAanti-spermantibody抗精子抗體BCFbeat-crossfrequency(Hz)交打頻率BSAbovineserumalbumin牛血清白蛋白BWWBiggers,WhittenandWhittingham試液CASAcomputer-aidedspermanalysis計算機輔助精子分析CASMAcomputeraidedspermmorphometricassessment計算機輔助精子形態(tài)評估CBAVDcongenitalbilateralabsenceofthevasdeferens先天性雙側(cè)輸精管缺失CDcompactdisk壓縮盤CDcytoplasmicdroplet胞質(zhì)小滴CD45clusterofdetermination45(pan-leukocytemarker)決定簇45(全白細胞標記物)CD46clusterofdetermination46(acrosomalantigen)決定簇46(頂體抗原)CIconfidenceinterval可信區(qū)間CLconfidencelimits可信界限CO2carbondioxide二氧化碳DMSOdimethylsulfoxide二甲基亞砜DNAdeoxyribonucleicacid脫氧核糖核酸DPBSDulbecco’sphosphate-bufferedsalineDulbecco’s磷酸緩沖鹽溶液DVDdigitalversatiledisc數(shù)字多用盤EDTAethylenediaminetetra-aceticacid乙二胺四乙酸（依地酸）EQAexternalqualityassurance外質(zhì)量保險EQCexternalqualitycontrol外質(zhì)量控制ERCexcessresidualcytoplasm殘余胞質(zhì)FITCfuoresceinisothiocyanateFMLPformyl-methionyl-leucyl-phenylalanine甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸GIFTgameteintrafallopiantransfer輸卵管內(nèi)配子移植術(shù)GPCglycerophosphocholineH2O2hydrogenperoxide過氧化氫HBSSHanks’balancedsaltsolutionHanks’平衡鹽溶液HBVhepatitisBvirus乙肝病毒hCGhumanchorionicgonadotrophin人絨毛膜促性腺激素HCVhepatitisCvirus丙肝病毒HIVhumanimmunodefciencyvirus人免疫缺陷病毒HOPhamsteroocytepenetration倉鼠卵穿透HOShypo-osmoticswelling低滲腫脹試驗HPFhighpowerfield高倍視野HRPhorseradishperoxidase辣根過氧化物酶HSAhumanserumalbuminxiv人血清白蛋白IVHTFhumantubalfuid人輸卵管液IBimmunobead免疫珠IBTimmunobeadtest免疫珠試驗ICSIintracytoplasmicsperminjection胞漿內(nèi)精子注射Igimmunoglobulin免疫球蛋白IMimmotility不動IQCinternalqualitycontrol內(nèi)質(zhì)量控制IUinternationalunit國際單位IUIintrauterineinsemination宮腔內(nèi)人工授精IVFinvitrofertilization體外受精KRMKrebs-RingerMediumKrebs-Ringer培養(yǎng)液LINlinearity線性LLQlowerlimitofquantifcation定量下限LPFlowpowerfield低倍視野MADmeanangulardisplacement平均角位移MAImultipleanomaliesindex復(fù)合異常指數(shù)MARmixedantiglobulinreaction混合抗球蛋白反應(yīng)NAnumericalaperture數(shù)值孔徑NPnon-progressive(motility)非前向的（活力）PBSphosphate-bufferedsaline磷酸緩沖鹽溶液PDCAplan,do,check,actPMAphorbol12-myristate13-acetate(12-)十四酸佛波酯(-13-)乙酸鹽PMSGpregnantmareserumgonadotrophin孕馬血清PNPGp-nitrophenolglucopyranoside對硝基苯酚吡喃葡萄糖苷PRprogressive(motility)前向的（活力）PSAPisumsativumagglutinin碗豆凝集素QAqualityassurance質(zhì)量保險QCqualitycontrol質(zhì)量控制RCFrelativecentrifugalforce相對離心力RIrefractiveindex屈光指數(shù)RNAribonucleicacid核糖核酸ROSreactiveoxygenspecies活性氧類物質(zhì)rpmrevolutionsperminute每分鐘轉(zhuǎn)速SDstandarddeviation標準差SDIspermdeformityindex精子畸形指數(shù)SDSsodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸鈉SEstandarderror標準誤SOPstandardoperatingprocedure標準操作流程STRstraightness(VSL/VAP)直向TBSTris-bufferedsalineTris緩沖鹽溶液TGGTyrode’sglucoseglycerolTZIteratozoospermiaindex畸形精子癥指數(shù)VAPaveragepathvelocity平均軌道速率VCLcurvilinearvelocity曲線速率VSLstraight-line(rectilinear)velocity直線速率WHOWorldHealthOrganization世界衛(wèi)生組織WOBwobble(VAP/VCL)擺動第1章背景1.1導言鑒于人類精液檢查標準化需求的日益增加，世界衛(wèi)生組織于1980年首次出版了《世界衛(wèi)生組織人類精液與精子-宮頸粘液相互作用實驗室檢驗手冊》。至今，該手冊已改版三次，被譯成多國語言。過去30年中，該手冊作為全球范圍內(nèi)的標準被世界各地的臨床與科研工作者廣泛使用。盡管前幾版的發(fā)行很成功，但是隨著新證據(jù)的出現(xiàn)，先前版本中的一些推薦指標需要被修正就變得更明顯了。同時，對一些概念也需給出更多的解釋和支持證據(jù)。出于上述考慮，WHO成立了編輯委員會，回顧手冊中描述的各種方法，本版旨在修改、更新這些內(nèi)容。由于按照先前版本中講述的方法獲取的數(shù)據(jù)不充分，某些情況下修正工作變得異常困難。有時，某些實驗室可以獲得的一致結(jié)果，在其他實驗室卻無法得以驗證。鑒于這些情況，編輯委員會在對以往文獻資料評估后，達成一致，統(tǒng)一標準。由于需要對先前版本中講述的方法進行更詳細的描述，技術(shù)員和科學工作者們給出了補充推薦內(nèi)容。因為前幾版手冊缺乏對細節(jié)的描述，一些實驗室采用其它方法或是發(fā)展出自己的操作規(guī)程，然而他們卻仍申稱是按照WHO手冊進行精液分析的。為了使全球范圍內(nèi)的比較更容易實現(xiàn)，第五版手冊包含了更多的細節(jié)描述。當提出不同的分析方法時，手冊中對原由做了解釋。參照該手冊在發(fā)表論文中報道實驗結(jié)果時，我們推薦各個實驗室要指明所采用的是哪一種方法。1.2第5版第5版包含三部分內(nèi)容：精液分析（第2-4章），精子制備（第5、6章）與質(zhì)量評估（第7章）。第Ⅰ部分介紹精液分析，參照先前版本，但被分為三個小章節(jié)：標準化方法（介紹決定精液質(zhì)量的常規(guī)操作流程）；可供選擇的試驗（這些試驗用于某些特定情況下或由實驗人員選擇）；研究試驗（這些試驗?zāi)壳安蛔鳛榫撼Ｒ?guī)分析的方法）。由于通常在男科學實驗室不能開展精液培養(yǎng)，因此這些內(nèi)容僅在無菌化精液標本采集部分提與。精子制備章節(jié)的內(nèi)容從射出精液擴展到對睪丸和附睪獲得精子的制備。本手冊中散在分布的方法學注釋框有注解(方法學解釋)、評論（結(jié)果解釋）以與說明框(包括補充解釋的物質(zhì))。第5版手冊的主要特點如下所列：精液分析章節(jié)包括涉與工作溶液的配制、操作流程、精子計數(shù)與對結(jié)果解釋的詳細描述，以使所有給出的方法學都非常完整，與手冊中其它章節(jié)內(nèi)容的重疊極少。擴展了精子制備部分的內(nèi)容，增加了關(guān)于精子冷凍保存的新章節(jié)。與宮頸粘液分析相關(guān)的操作規(guī)程被分到可供選擇的試驗章節(jié)與附錄中粘液特征的檢查部分。與先前的版本相比，第五版的附錄內(nèi)容減少。這部分內(nèi)容僅限于特殊的或者很少被用到的信息。精子數(shù)目的評估。對于一份精液標本的檢查，精液的稀釋度和評估精子數(shù)目所需觀察的計數(shù)池區(qū)域的大小均有所改變，每次需計數(shù)200條精子。新版手冊中強調(diào)了抽樣誤差的重要性與計數(shù)結(jié)果的確定性。編輯委員會認為每次排精的總數(shù)目比精子密度能更準確的評估睪丸功能，但這要求對精液量的測定需準確無誤。無精子癥的評估。這盡管表面看起來簡單，但很多因素會影響無精子癥的診斷，包括計數(shù)太少數(shù)目精子導致的明顯誤差，觀察顯微鏡視野的數(shù)目，以與檢驗布滿碎片精子沉淀物的困難度。本手冊推薦改為檢驗固定后、未離心的標本，以與指出所用計數(shù)方法的靈敏度。然而，當需收集足夠數(shù)目的精子用于治療時，離心方法仍是必需的。另外，手冊中也介紹了通過檢驗未固定標本中的活動精子以評估輸精管切除術(shù)療效的方法。精子活力的評估。第五版與先前版本的主要不同在于對精子活力的分級。目前推薦精子活力被分為前向運動、非前向運動的不動精子（而不再分為a,b,c和d級）。精子形態(tài)的評估。一些實驗室僅僅評估正常精子的比例，然而有些人認為形態(tài)異常的類型、部位與程度更加重要。質(zhì)控。此章第五版為重新編寫。精液分析過程的健全對于精液分析嚴格質(zhì)控至關(guān)重要。當質(zhì)控結(jié)果不滿意時，文中的提示和建議有助于增進實驗室水平。參考范圍和參考低值。本手冊參考范圍值來自12個月以內(nèi)配偶獲妊娠的男性的精液數(shù)據(jù)。原始數(shù)據(jù)為來自3大洲的8個國家的可生育男性的400-1900份精液樣本。傳統(tǒng)統(tǒng)計學方法為取雙向參考區(qū)間的第2.5百分位作為閾值，低于此閾值則可認為來自不同的人群。但是，單向參考區(qū)間更適用于精液分析，因為任意參數(shù)的高值并不能對生育作出決定性的判斷。第5百分位可作為最低參考值，每一參數(shù)的完全分布區(qū)間見附錄1。1.3本手冊的范圍本手冊所載的方法可作為指南以增進精液的綜合分析和可比性。但并非為地方、國家或全球性的實驗室認證機構(gòu)所必備。精液分析在臨床和研究機構(gòu)對男性生育功能的調(diào)節(jié)和追蹤中，其對男性生育狀態(tài)和精子發(fā)生的監(jiān)控都是極為必要的。（上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院生殖中心曹少峰博士）第2章標準程序2.1簡介正常精液是一種混合物，在射精時由睪丸和附睪的分泌液與懸浮其中的精子與前列腺、精囊腺和尿道球腺的分泌物混合而成。最終射出的混合物是一種粘稠的液體，即射出的精液以團塊狀連續(xù)數(shù)次射出，通過輸精管切除術(shù)前后的比較顯示，就體積而言有90%是自附屬腺體的分泌物，其中主要是前列腺和精囊腺，少部分來自尿道球腺和附睪。精液的兩個主要量化指標：1．精子總數(shù)，反應(yīng)睪丸的生精狀況和睪丸后管道系統(tǒng)的通暢程度。2．體積反應(yīng)腺體的分泌能力。精子功能組要受精子自身的活力、運動、形態(tài)和精漿成份的影響。在性交排精時，最初富含精子和前列腺液部分的精液可能和延續(xù)在陰道中宮頸粘液絲相互接觸，而其余部分在形成而在實驗留取標本時，全部精液留取在一個容器中，精子限在由精囊腺分泌蛋白導致的凝塊中，隨后在前列腺分泌的酶作用下而水解。有證據(jù)表明精液樣本質(zhì)量的變化與取樣方式和地點有關(guān)，通常在家里用性交法留取的質(zhì)量較高，說明不同排精方式明顯影響樣本的檢驗結(jié)果。在固定條件下精液樣本質(zhì)量主要受睪丸生精功能、附屬腺體的分泌、近期患病情況尤其高熱性疾病，與其以它如禁欲時間的長短，這些在解釋監(jiān)測結(jié)果時都應(yīng)考慮進去。精液質(zhì)量分析結(jié)果主要受以下因素的影響：1．樣本收集是否完整。射精時前面富含精子部分的精液避免丟失，后面部分精液主要是由精囊腺的分泌物構(gòu)成，所以，前面部分精液的丟失比后半部分丟失對精液分析結(jié)果影響更大。2．在射精時，附屬腺體分泌物沖淡含高度濃度精子的附睪液。精子濃度不能直接反應(yīng)睪丸的精子產(chǎn)量，因為還受其他生殖器官功能的影響，而精子總數(shù)（精子密度X精液體積）精子密度對于年輕人和老年人沒有區(qū)別，但精子總數(shù)可能存在差異，至少人群中有部分人存在隨著年齡增大而精液體積和精子下降的現(xiàn)象。3．精子的活力和染色體不受禁欲時間長短的影響，除非附睪功能受到影響。由于前次射精不徹底，附睪沒完全排空，有部分精子殘存，精子老化會影響精子質(zhì)量，其程度很難確定，所以也很少做考慮。4．睪丸體積的大小不僅能反應(yīng)睪丸的生精水平還影響到每次射精的精子總數(shù)和精子形態(tài)。注釋：精液質(zhì)量的巨大生理變化是上述所列多種因素的反映(Castilla等.,2006)，因而同精液相關(guān)的所有分析都要精確全面。這些多變的非可控因素解釋了眾所周知的個體精液成分的變化(Baker&Kovacs,1985;Alvarez等,2003).圖2.1顯示了參與一個雄性激素避孕藥研究的安慰劑組的5名年輕志愿者，根據(jù)WHO推薦的方法的精液評估結(jié)果，其精液成分是伴隨時間發(fā)生變化的。這一變化表明要對精液分析進行如下說明：1．僅憑一次精液檢查不能確定精子質(zhì)量。2．檢查兩到三次有助于獲得可靠的基本數(shù)據(jù)(Poland等,1985;Berman等,1996;Carlsen等,2004;Castilla等,2006;Keel,2006)。雖然對整個精液樣本進行了分析，但其結(jié)果并不能確定那些少數(shù)到達受精部位精子的受精能力，精液分析能為臨床提供有關(guān)患者個人狀況的一些重要信息。樣本的采集和檢查都按照規(guī)范化程序進行，其結(jié)果才有價值。本章所述操作流程被認定為進行精液評估的基本組成步驟。圖2.1在超過18個月的時間內(nèi)精子總數(shù)目和精液濃度的變化（以上數(shù)據(jù)提供由先靈葆雅和拜耳藥業(yè)提供）精液分析包括以下幾個步驟（在以后章節(jié)中詳述）：【在最初五分鐘】將受精精液樣本容器放置在溫控臺或水浴箱里（37℃在30到60分鐘期間評估精液的液化情況和物理性狀。測量精液體積。如有需要則檢測精液的pH值。準備濕片觀察顯微鏡下精子的活動情況，計數(shù)時還需進行稀釋。如活動精子較少，需評估精子活動率。制作精液涂片評估精子形態(tài)。對精液進行稀釋后做精子密度評估。對精子進行計數(shù)。如有需要可進行抗免疫珠混合反應(yīng)檢測。如發(fā)現(xiàn)圓形細胞則可檢測過氧化酶陽性細胞。如有需要可對精子做免疫珠試驗的準備。如需檢測精漿生化指標則對精液進行離心。【在三小時內(nèi)】將精液樣本送至微生物檢驗室（如有需要）?！舅男r后】對精液涂片進行固定、染色以備精子形態(tài)學檢查。【在當日稍后（如冷凍樣本則可在次日）】檢查附屬腺體功能的指標。進行間接免疫珠試驗檢測（如有需要）。2.2樣本采集2.2.1準備為了減少外界溫度和樣本收集到檢測期間過長對精液檢測結(jié)果的影響，樣本采集應(yīng)在靠近實驗室比較私密的房間里進行。縮短樣本從采集到檢測的間隔時間，標本采集時間應(yīng)為禁欲至少兩天，最長不超過七天。如需復(fù)查每次禁欲的天數(shù)應(yīng)盡可能恒定。給患者一個明確的書面或口頭有關(guān)采樣指導說明，應(yīng)該強調(diào)樣本收集必須完整，如有樣本丟失與時告訴醫(yī)生。在報告中應(yīng)包括如下信息：患者姓名、出生日期、禁欲時間、采樣日期、樣本是否完整、采樣是否困難與從采樣到檢測的間隔時間。2.2.2為了診斷和研究目的樣本采集應(yīng)用手淫的方法取精液，并射入一干凈的、廣口的玻璃或塑料容器中。應(yīng)通過實驗證實容器對精子沒有毒性作用(見框2.1)。盛有精液的容器應(yīng)放置在20～37℃將盛有精液樣本的容器置于恒溫臺或水浴箱中，等待其液化。報告中應(yīng)注明樣本采集是否完整，尤其富含精子的射精最初部分。如有丟失應(yīng)在禁欲2～7天后再次采集作進一步檢測。

評述2.1精液收集管兼容性的判定選取若干精子濃度高且精子活力佳的精液樣本。每份標本的一半置入已知無毒的容器（對照）內(nèi)，另一半置入待測容器。室溫37℃2.2.3用于輔助受孕的精液樣本的消毒對于用來臨床診斷，但收集樣本容器、吸頭與用來混勻的吸管同樣要進行消毒。2.2.4對要進行微生物檢測精液樣本的采集這時，必須要避免來自精液以外的污染（外周皮膚）收集樣本容器、吸頭與用來混勻的吸管同樣要進行消毒?；颊咝璋聪铝胁襟E進行：排尿；用肥皂清洗手和陰莖；沖去殘留肥皂；用一次性毛巾擦手和陰莖；射入干凈的容器中。注：精液樣本的收集和實驗室顯微生物操作開始的時間間隔不可超過3小時。2.2.5家中樣本采集對于除了在自家以外的環(huán)境下取精的確困難者，可以在家中進行樣本采集。給患者以明確的書面或口頭形式的有關(guān)精液樣本的采集和轉(zhuǎn)運指導說明，應(yīng)強調(diào)采集樣本必須完整，如有部分丟失應(yīng)在報告中加以說明。對已標上姓名和身份證號的容器進行稱重，然后交給患者?；颊邞?yīng)記錄采集的時間，并在一小時內(nèi)送至實驗室。在送至實驗室途中樣本應(yīng)保持在20～37℃的環(huán)境中。報告中應(yīng)注明樣本采集的地點是在家還是在其他實驗室以外的地方。2.2.6用避孕套采集樣本對通過手淫法采集精液困難的情況下，才采用避孕套通過性交法獲取精液。只能用經(jīng)特殊設(shè)計對精子沒有毒性的避孕套來采樣，這種避孕套現(xiàn)已有售。應(yīng)告知患者使用避孕套方法以與如何將樣本轉(zhuǎn)運至實驗室。應(yīng)記錄樣本采集的時間，并在一小時內(nèi)送至實驗室。在送至實驗室途中樣本應(yīng)保持在20～37℃的環(huán)境中。報告應(yīng)注明樣本的采集是在利用避孕套通過性交法與采集地點。注：一定不可使用普通避孕套收集精液，因為它們一般含有干擾精子活力的成分(Jones等,1986).注釋1:體外射精不是精液收集的可靠手段，因為含有大量精子的精液初始部分可能遺失。而且，這可能造成樣本的細菌性或真菌性污染，且陰道內(nèi)的酸性環(huán)境會對精子活力造成不利影響。注釋2：如果患者無法提供精液樣本，性交后試驗（見3.3.1節(jié)）可能會提供其精子情況的相關(guān)信息。2.2.7樣本的安全處理精液樣本可能含有害的病原體（如乙肝病毒、HIV），應(yīng)作為生物污染物處理，如是為了宮腔內(nèi)人工授精、體外受精、單精子胞漿內(nèi)注射、培養(yǎng)，注意消毒應(yīng)嚴格按照附錄2中安全處理指南進行，實驗室試驗應(yīng)以安全為基礎(chǔ)。2.3初步肉眼觀察精液液化后經(jīng)簡單觀察應(yīng)立即進行檢查分析，最好在30分鐘內(nèi)完成，不要超過一個小時。以免水分丟失或溫度的變化而影響精液質(zhì)量。2.3.1液化精液射入容器后立即形成典型的半透明凝塊，室溫下在數(shù)分鐘內(nèi)，精液通常開始液化（變?。藭r可以看到不均勻的凝塊在液體中。隨著繼續(xù)液化，精液將變成均勻的水樣物，最后只看到很小的凝塊，室溫下一般在15分鐘內(nèi)通常都能完全液化，很少超過60分鐘。如在60分鐘內(nèi)沒完全液化，應(yīng)記錄這種情況，在家或利用避孕套采集的樣本通常在送達實驗室時都已液化。正常精液可以含有不液化的膠凍狀顆粒，這一現(xiàn)象似乎沒有任何臨床意義。粘液絲的出現(xiàn)可能干擾精液分析。注1：液化可以通過宏觀（如上所述）和微觀兩方面來斷定。固化精子可通過精液液化而獲得運動能力。如果在顯微檢測中觀察到固化精子，則需更多時間以保證液化過程的完成。注2：在液化過程中，持續(xù)輕柔的混勻或旋轉(zhuǎn)樣本容器可以降低精液密度測定過程中的誤差。注3：如果精液在30分鐘內(nèi)未液化，不要進行任何精液分析，而應(yīng)再等待30分鐘。如果在60分鐘內(nèi)精液仍未液化，則參照2.3.1.1節(jié)進行處理。2.3.1.1液化延遲偶有精液不液化，需另行處理，機械混勻或用酶消化可能是必要的。1．加入等量的培養(yǎng)液(如杜氏磷酸鹽緩沖液,詳見附錄4，A4.2節(jié))，然后重復(fù)用加樣器吹打也可以使某些樣本液化。2．用帶有規(guī)格為18或19號注射針頭的注射器對精液進行反復(fù)抽吸6～10次。3．用菠蘿蛋白酶或糜蛋白酶(EC3.4.22.32)的消化作用可以促進精液液化（見框2.2）。制備方法為10IU/l的菠蘿蛋白酶置入杜氏磷酸鹽緩沖液（見附錄A4.2）4．對液化確困難的精液，可以將樣本與酶按比例(1:2)進行混勻置于37℃注釋：這些處理可能會影響到精漿的生化性質(zhì)，精子活力以與精子外形，如有使用必須記錄。用菠蘿蛋白酶以1+1（1:2）的方式稀釋精液必須在評估了精子濃度后以其結(jié)果作為說明。2.3.2精液粘稠度液化后，用口徑約1.5mm的塑料吸管緩慢地將精液吸入，觀察在重心作用下精液形成粘液絲的長度，正常時為液滴不間斷落下，異常時粘液絲長超過2cm，也可以觀察用玻璃棒插入精液提起后形成粘液絲的長度，超過2cm即為異常，這都應(yīng)作記錄。部分不液化樣本，表現(xiàn)為精液粘稠度不隨時間延長而改變，對于那些高度黏稠的樣本減輕粘稠的方法同處理精液液化延長相同(見2.3.1.1注釋：高粘稠度會干擾對就精子活力、密度的判定以與對覆蓋在精子表面的抗體和生化標志物的檢測。2.3.3精液外觀正常精液液化后應(yīng)呈均質(zhì)、灰白色的外觀。如果精子密度非常低，精液可顯得透明一些。如有紅細胞，精液可呈紅褐色；病人如有黃疸或服用某些維生素，精液可呈黃色。2.3.4精液體積精液主要是由精囊腺和前列腺的分泌物和占小部分的尿道球腺和附睪分泌物構(gòu)成，體積的精確測量對評估精液非常重要，他影響精液中精子總數(shù)和非精子細胞數(shù)的計算。最佳辦法是采集樣本容器的稱重。用事先稱重的一次性清潔容器收集樣本；給裝有樣本的容器稱重；減去容器的重量；根據(jù)樣本重量計算體積，假定精液密度為1g/ml精液密度在1.043和1.102g/ml之間(Huggins等,1942;Brazil等,2004a;Cooper等,2007))。注：空樣本容器可能具有不同的重量，所以每一容器必須提前分別稱重。用不退色標記筆在容器上標明或粘貼標簽標識其重量。如粘貼標簽標識其重量，應(yīng)在稱重前即粘貼標簽。此外，可以直接測量精液體積。將精液直接射入廣口帶有刻度的錐形底量筒中，器材均可從市場上購得。從量筒上直接讀取數(shù)值（精確到0.1ml）。注：不推薦用移液器或是注射器從標本容器中吸取樣本然后注入量筒中測量體積，因該方式無法保證不損失樣本，而這會導致對體積的低估。該法導致的體積損失量在0.3到0.9ml之間（Brazil等，2004a；Iwamoto等，2006；Cooper等,2007）。注釋1：低精液體積是生殖道梗阻或先天性雙側(cè)輸精管缺如（CBAVD）(delaTaille等,1998;Weiske等,2000;Daudin等,2000;vonEckardstein等,2000)的特征。同時也可能是精囊發(fā)育不良的一個表現(xiàn)。注釋2：低精液體積也可能是在精液收集過程中產(chǎn)生了問題（如損失了部分精液），也可能為部分逆行射精或有男科缺陷。注釋3：高精液體積可以反映附屬性腺分泌旺盛，可能存在活動炎癥的情況。2.3.4.1參考值下限精液體積的參考值下限為1.5ml（95%置信區(qū)間（CI），1.4-1.7）。2.3.5精液pH值精液pH值主要反映出由精囊腺分泌的堿性液體和由前列腺分泌的酸性液體之間的平衡情況。應(yīng)在精液液化30分鐘后進行，無論如何不要超過1個小時，以免因CO2丟失而影響檢測結(jié)果，正常情況下選用范圍在6.0到10.0之間的試紙。均勻攪拌樣本(見框2.3)。將一滴精液在pH試紙上均勻展開。等待浸濕區(qū)域的顏色均勻一致（等候時間＜30秒）。與標準帶比色讀出其pH值。注：pH試紙的準確性應(yīng)該按照已知標準進行檢測。對于粘稠的樣本，可取小份樣本用專為測量粘稠溶液設(shè)計的pH量尺進行檢測。(Haugen和Grotmol,1998)。2.3.5.1參考值對于生育男性精液pH值的參考值尚未確定，現(xiàn)保持原有下限值7.2。注釋1：如低體積低精子數(shù)目的精液樣本的pH低于7.0，可能存在生殖道梗阻或先天性雙側(cè)輸精管缺如（CBAVD）(delaTaille等,1998;Weiske等,2000;Daudin等,2000;vonEckardstein等,2000)。同時也可能是精囊發(fā)育不良的一個表現(xiàn)。注釋2：精液的pH值如隨時間推移而升高，可能是由于自然緩沖物減少，所以高pH值不能提供有價值的臨床信息。2.4顯微鏡初檢建議使用相差顯微鏡對所有未染色的新鮮精液標本進行檢查，初檢的總放大倍數(shù)為100倍（即物鏡10×和目鏡10×），對標本進行一般觀察包括：粘液絲；精子凝集；非精子細胞包括：上皮細胞、圓形細胞（白細胞和未成熟精子細胞）與斷裂的精子頭部或尾部，這應(yīng)在總放大倍數(shù)為200或400倍的條件下進行；評估精子活力(見2.5節(jié))；根據(jù)精子計數(shù)要求決定稀釋倍數(shù)(見2.8節(jié))。2.4.1充分混勻精液和取樣充分均勻液化的精液本身就有利于解決化驗取樣是誤差的問題，如樣本不夠均勻，觀察同一份精液制備兩份標本有關(guān)精子活動、活力、密度與形態(tài)等結(jié)果時可能出現(xiàn)明顯偏差，為了給生育力的評估提供可靠資料，在檢測前，精液樣本必須充分混勻(見框2.3)，兩等份的數(shù)值必須相符才可接受測量結(jié)果。兩份標本經(jīng)泊松分類的精子數(shù)目（見框2.7和2.10，表2.4和2.5）和其百分率的二項分布（見框2.5和2.6，表2.1）需要一致?？?.3充分混勻精液：在取微量樣本進行檢測前，樣本必須在容器內(nèi)充分混勻，力度要輕柔以免氣泡產(chǎn)生，可通過向樣本中插入一個寬孔（直徑接近1.5mm）的一次性無菌塑料吸液管抽吸10次來達到混勻標本的目的。不可用高速渦旋器，以免對精子造成損傷。2.4.2濕片的制作充分混勻精液樣本（見框2.3)；混勻后立即取樣，以免精子在懸液中沉淀；再次取樣前還需進行混勻，進行分析檢查時精液體積和蓋玻片的尺寸必須標準化，以保持精子在固定厚度約20μm條件下自由游動將10μl的定量精液滴在干凈載玻片上；蓋上22mm×22mm的蓋玻片，形成近20μm厚度，蓋玻片的重量使標本均勻展開；應(yīng)注意避免在蓋玻片和載玻片之間產(chǎn)生氣泡；對新制成的濕片，等到玻片上界面不再晃動時應(yīng)盡快進行檢測。框2.4濕片的厚度：涂片的厚度（Dμm）是樣本的體積（V，μl=mm3）除以它的液面寬度（A，mm2）：D=V/A。如，體積為10μl的精液置于一張潔凈的載玻片上，加蓋面積為22mm×22mm的蓋玻片（面積為484mm2），則其厚度應(yīng)為20.7μm；若體積為6.5μl的樣本上加蓋一張18mm×18mm的蓋玻片（面積為324mm2），則其厚度為20.1μm；如體積為11μl的樣本上加蓋一張21mm×26mm的蓋玻片（面積為546mm2），則其厚度為20.1μm；偶爾會出現(xiàn)大厚度的情況，如40μl的樣本上加蓋一張24mm×50mm的蓋玻片（面積為1200mm2），則其厚度為33.3μm；注1：涂片的深度小于20μm會限制精子的旋轉(zhuǎn)運動(LeLannou等,1992;Kraemer等,1998)注2：如厚度過大，則會因為精子在視野中來回運動而難以進行精子評估。注3：如每一視野中精子的數(shù)目差異過大，則樣本可能是不具有代表性的。如出現(xiàn)此種情況則應(yīng)重新充分混勻精液標本（見框2.3）并按照上述步驟重新制備一張涂片。注4：欠缺代表性也可能會導致粘稠度和液化的異常（見2.3.1節(jié)），精子的聚集（見2.4.3節(jié)）或精子的凝集（見2.4.4節(jié)）。2.4.3精子聚集不活動精子之間、活動精子與粘液絲之間、非精子細胞成分或細胞碎片等粘在一起，為非特異性聚集（圖2.2），這種情況應(yīng)如實記錄。圖2.2精液中精子的非特異性聚集圖示為精子與上皮細胞（a），細胞殘渣（b）與精子（c，d）的聚集現(xiàn)象。顯微圖像由CBrazil提供2.4.4精子凝集精子凝集是指活動精子以不同方式，頭對頭、尾對尾或混合型，如頭對尾，彼此粘在一起。劇烈震蕩會使精子活力過度表現(xiàn)，但有時由于凝集會限制精子的活動力。任何精子的頭部，尾部或中段有粘附現(xiàn)象都應(yīng)如實記錄。凝集的類型（反應(yīng)其程度（1-4級））和吸附狀態(tài)（A-E級）也應(yīng)記錄（Rose等,1976）（見圖2.3）。一級：輕度聚集指每個凝塊中少于10條精子；二級：中度聚集指每個凝塊有10到50條精子，精子運動自如；三級：大片聚集指每個凝塊有多余50條精子，精子仍然運動自由；四級：整個精子聚集，所有精子聚集在一起彼此相互連接。根據(jù)程度又可分abcd。注：運動的精子粘附于細胞，細胞碎片或是非運動的精子（聚集）應(yīng)該記為凝集。圖2.3精子聚集程度分類表涉與部分聚集等級完全分離聚集精子數(shù)＜10個，多數(shù)精子為游離狀態(tài)中等聚集聚集精子數(shù)10~50個，有游離精子高度聚集聚集精子數(shù)＞50個，部分精子游離完全聚集所有精子均聚集一團，無游離精子1．輕度聚集指每個凝塊中少于10條精子；2．中度聚集指每個凝塊有10到50條精子，精子運動自由；3．大片聚集指每個凝塊有多余50條精子，精子仍然運動自由；4．整個精子聚集，所有精子聚集在一起彼此相互連接。A．頭對頭B．尾對尾C．尾端對尾端D．混合型E．糾結(jié)型注釋1：存在凝集并不能充分證實為不育的免疫性原因，但是能夠說明有抗精子抗體的存在；還需進一步檢查以明確診斷（見2.20節(jié)）。注釋2：嚴重的精子凝集能夠影響對精子活力和密度的評估。2.4.5其他非精子細胞成分精液中常含有一定的非精子細胞成分，部分與臨床關(guān)系密切。通常包括泌尿生殖道上皮細胞、前列腺細胞、生精細胞和白細胞，后兩種統(tǒng)稱為“圓細胞”(Johanisson等,2000)。這些細胞成分在染色后的涂片中（放大1000倍）難以區(qū)別(見2.12節(jié),表13和14,以與2.19節(jié))?？梢酝ㄟ^過氧化物酶技術(shù)和全白細胞單克隆抗原技術(shù)來進行鑒別。非精子細胞成分計數(shù)用與精子相同的方法進行，或根據(jù)染片(見2.18.1.5節(jié))中生精細胞或白細胞與精子的比例來進行計算。（山東中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院生殖中心董乾江蘇無錫婦幼保健院生殖中心王洪華）2.5精子活力分析精子活力程度與妊娠率有關(guān)，電腦輔助法評估精子的運動性見第3.5.2節(jié)。精子活力評估應(yīng)在精液樣本液化后盡快（最好在30分鐘之內(nèi)）進行，務(wù)必在射精后1個小時之內(nèi)進行。防止時間過長，因脫水、pH值與溫度的變化對評估結(jié)果產(chǎn)生的負面影響。過程如下：·將精液樣本混勻。·拌勻后立即（防止精子沉淀）取出一等份。·重新攪拌精液樣本的剩下部分，取出另一等份?！⑸厦娴膬煞輼颖痉謩e滴大約20μm深的濕制劑（見2.4.2節(jié)）的載玻片上?！さ鹊綐颖就Ｖ箲腋。?分鐘以內(nèi)）。·用200或者400倍率的相差顯微鏡觀察載玻片?！っ總€標本大概評估200個精子左右，以便算出各自不同類型精子的百分比?！と魳吮镜挠^察值在可接受的范圍，記錄下數(shù)據(jù)，否則重新制作標本。注1：該過程應(yīng)該在室溫或者顯微鏡載物臺預(yù)先加熱至37℃的標準試驗室內(nèi)進行，如果在37℃下進行評估，精液樣本需要放置在37注2：建議采用帶有網(wǎng)格標線的目鏡以便選擇觀察區(qū)域，先數(shù)積極運動型精子數(shù)量，然后數(shù)非積極運動型精子數(shù)量，最后評估完全不動型精子數(shù)量。（見2.5.1節(jié)）。2.5.1精子活力分類建議采用一個簡單的精液運動分類方法，該方法根據(jù)精子運動功能的不同分成以下幾類：·運動活躍型（PR）：精子運動活躍、線性運動或者在較大的范圍內(nèi)運動（不考慮運動的速度）?！し沁\動活躍型(NP)：精子運動但不活躍，如精子在較小的范圍內(nèi)運動，精子頭部輕微移位或盡有鞭毛擺動?！ね耆粍有停↖M）：精子完全不動。注1：該手冊之前的版本介紹的分類方法將積極活躍型根據(jù)精子運動速度的快慢進行細分，如將在37℃注2：當討論精子活動率時，細分精子的總能動性（PR+NP）和活躍精子能動性（PR）非常重要。2.5.2精液樣本的準備和評估如果在37℃的溫度下評估，提前10分鐘開啟恒溫箱，以確保溫度恒定在37·準備20μm深的計數(shù)板（見2.4.2節(jié)）?！び?00或者400倍率的相差顯微鏡觀察載玻片。·等到樣本停止懸浮。·在離蓋玻片至少5μm的區(qū)域內(nèi)觀察精子的運動（蓋玻片邊緣的精子運動性受到干燥物質(zhì)的影響）?！は到y(tǒng)性地觀察載玻片以防止重復(fù)觀察同一個區(qū)域，不斷改變觀察區(qū)域，避免基于精子活動數(shù)量多少來選擇觀察區(qū)域（觀察區(qū)域選擇應(yīng)該隨機）。·計數(shù)開始時間的選擇應(yīng)該隨機，計數(shù)要迅速，不要等到精子游到所選區(qū)域后才開始計數(shù)。·評估所選區(qū)域的所有精子的活動率，區(qū)域選擇最好通過目鏡標線來確定，選擇區(qū)域的大小應(yīng)根據(jù)精液的濃度，如當精液濃度較大時，選擇最上面一排網(wǎng)格，濃度低時，選擇全部的網(wǎng)格?！び嫈?shù)應(yīng)該迅速，避免運動精子的數(shù)量估計值比實際值多，快速計數(shù)網(wǎng)格內(nèi)的精子，避免因計數(shù)時間過長，將計數(shù)時游進網(wǎng)格的活動精子也計算入內(nèi)而導致估計值多于實際值?！な紫葦?shù)所選區(qū)域內(nèi)的運動活躍型精子（PR），然后是非運動活躍型精子（NP），最后是完全不動型精子（IM）。根據(jù)經(jīng)驗，也可以同時計數(shù)一個網(wǎng)格內(nèi)的三種類型的精子然后再數(shù)另一網(wǎng)格內(nèi)的三種類型的精子，直到將所選區(qū)域數(shù)完?！ねㄟ^實驗室計數(shù)器的輔助完成計數(shù)。·每個標本至少在5個不同的區(qū)域計數(shù)，所數(shù)的精子總數(shù)應(yīng)該不低于200個以避免小樣本錯誤。分別計算兩個標本的PR、NP和IM比例，然后計算各自的均值和差值。將計算的結(jié)果對照表2.1（在95%的置信區(qū)間內(nèi)，在某一均值下，兩個比例差距可接受的最大值）。參照表2.1若兩個比例差值在可接受范圍之內(nèi)，記錄PR、NP和IM比例的均值，若差值過大，超過可接受范圍，重新制作2個精液標本。通過四舍五入記錄PR、NP和IM比例均值的整數(shù)值。注1：僅計數(shù)完整的精子（有頭部和尾部，見2.7.3節(jié)）不要計數(shù)只能看見小部分的精子。注2：活性精子計數(shù)時往往會多數(shù)，要通過改變計數(shù)順序（如先數(shù)NP精子數(shù)或IM精子數(shù)），盡可能知到潛在影響計數(shù)的偏見（見7.13.3節(jié)）并避免它們。注3：有時，樣本不均勻，即使三個標本都不能得到可接受的差值，這時，記錄下兩兩的均值與差值。圖2.4目鏡標線對活性精子計數(shù)很有幫助（圖a），系統(tǒng)性地選擇計數(shù)區(qū)域，計數(shù)范圍應(yīng)該至少距蓋玻片5μm（圖b）。表2.1在某一均值下，兩個比例差距可接受的最大值（每個標本計數(shù)200個精子的情況下）?？?.6：關(guān)于百分比的比例值和差值處理百分比要四舍五入成整數(shù)，若尾數(shù)是0.5則將其轉(zhuǎn)換至離兩者均值較近的整數(shù)，如將32.5%寫成32%，而將3.5%寫成4%。這些四舍五入成的百分比全部加起來可能不等于100%。對照表2.1，若兩個標本PR、NP、IM比例的差值剛好等于可接受的最大差值，則接受該值。若差值大于可接受的最大值，一般認為是數(shù)錯了、吸取錯誤或者精液樣本沒有攪拌均勻。當差值大于可接受的最大值時，不要采納之前的數(shù)據(jù)，而應(yīng)重新制作標本重新計數(shù)。（千萬不要再做一份相同的標本，計算三個標本的平均值，或者選擇數(shù)據(jù)接近的兩個計算平均值）。2.5.3示例例1：某兩份精液標本（每個標本的精子數(shù)均大于200）的精子能動性分析如下，運動活躍型精子分別占30%和50%；非運動活躍型精子分別占5%和15%；完全不動型精子分別占65%和35%。占比例最大的為完全不動型，它們的均值為50%。對照表2.1，在均值為50%的情況下，差值大于10%，認為僅是偶然發(fā)生事件。觀察值大于10%（65%-35%），因此需重新制作兩份標本進行評估。例2：某兩份精液標本（每個標本的精子數(shù)均大于200）的精子能動性分析如下：運動活躍型精子分別占37%和28%；非運動活躍型精子分別占5%和6%；完全不動型精子分別占60%和66%，占比例最大的為完全不動型，它們的均值為63%。對照表2.1，在均值為63%的情況下，兩者差距大于10%，認為僅是偶然發(fā)生事件。觀察值小于10%（66%-30%），因此，接受該觀察值，并記錄如下：運動型精子占32%，非運動型精子占4%，完全不動型精子占63%。2.5.4參考下限總運動精子（PR+NP）比例的參考下限為40%（95%的可信度，38-42的可信區(qū)間）；積極運動精子（PR）比例的參考下限為32%（95%的可信度，31-34的可信區(qū)間）。注：一次射精的精液中的運動活躍型精子總數(shù)具有生理上的意義，它的值等于精液中的總精子數(shù)乘以運動活躍型精子的比例。2.6精子活率精子活率的評估通過精子細胞膜的完整性程度來完成，通常每個樣本都可以評估其活率。尤其當積極活躍型精子比例小于40%時，評估精子活性就非常必要。這時，精子活性評估可以檢驗精子能動性評估的正確性，因為死亡精子的比例不應(yīng)該超過完全不動型精子的比例，存活精子的比例應(yīng)該超過運動精子的比例。別舉活精子的比例通過評估精子細胞膜的完整程度來完成，而細胞膜的完整程度評估運用染色排除法或低滲透腫脹法。染色排除法基于以下原理：損壞的細胞膜，例如死亡細胞膜，允許有色物質(zhì)進入；滲透腫脹法則假設(shè)：在低滲透壓溶液中只有擁有完整細胞膜的細胞才會腫脹。下面將會對這兩種方法分例。精子活率的評估應(yīng)在精液樣本液化后盡快（最好在30分鐘之內(nèi)）進行，務(wù)必在射精后1個小時之內(nèi)完成。防止時間過長，因脫水與溫度的變化對評估結(jié)果產(chǎn)生的負面影響。注1：臨床上，知道完全不動型精子是否是活的非常有必要，因此，精子活率的評估要在精子能動性評估結(jié)果的基礎(chǔ)上進行。注2：若出現(xiàn)完全不動且為活性精子的比例較大的情況，則提示精子鞭毛存在結(jié)構(gòu)性缺陷；若完全不動且為死亡精子比例較大則提示附睪存在病理。2.6.1曙紅（伊紅）－苯胺黑法評估精子的活率這種方法通過苯胺黑染色劑，只需要一個步驟，增強精子頭部顏色與背景顏色的對比度，很容易就可以看出精子是否具有活率。將染色后的精液制成標本放到顯微鏡下觀察。2.6.1.1準備試劑1.曙紅Y：將0.67克曙紅和0.9克氯化鈉溶入到100毫升純凈水中，并輕微加熱。2.曙紅—苯胺黑：將10克苯胺黑加到配好的100毫升的曙紅Y試劑中。3.將其加熱至沸騰，然后冷卻至室溫。4.用濾紙（如90g/m2）濾掉渣滓與凝膠狀沉淀物，然后存儲于黑色密封的玻璃瓶內(nèi)。2.6.1.2步驟1.將精液樣本拌勻。2.將1/5的精液與5μl伊紅溶液混合，置于顯微鏡載玻片上，用移液管混勻，在載玻片上均勻展開。3.重新攪拌精液樣本，然后重復(fù)步驟2制作另外相同一份。4.將兩份樣本的懸浮液分別涂抹在不同的載波片上（見2.13.2節(jié)），然后置于空氣中風干。5.標本干后立即觀察，或者將其置于永久非水介質(zhì)（見2.14.2.5）中，以后再觀察。6.用100倍的油浸物鏡觀察。7.在實驗室計數(shù)器的輔助下，計數(shù)已被染色的精子（死亡精子）和沒有被染色的精子（活性精子）數(shù)量。8.為了避免樣本錯誤，每個標本至少要數(shù)200個精子。9．分別計算兩個標本活性精子的比例，以與兩者之間的差值。10.對照表2.1（在某一均值下，兩個比例差距可接受的最大值）以確定差值是否可以接受。11.若均值可以接受，記錄下兩個標本活性精子比例的平均值，否則，重新制作兩個相同的標本并且重復(fù)以上步驟。12.用四舍五入法記錄所得的比例值。圖2.5在明場視野鏡下觀察曙紅—苯胺黑精液標本圖頭部變紅的精子（D1）或者暗紅（D2）的精子認為是死的（細胞膜受損）；頭部為白色（L）或者淡粉色的精子認為是活的（細胞膜完整）。2.6.1.3計數(shù)1.苯胺黑使整個標本的背景成為黑色，因此容易分辨被染色的與未被染色的精子。2.在明場視野顯微鏡下，活精子具有白色頭部，而死精具有紅色或暗紅色頭部（見圖2.5）,淡紅色頭部的精子認為是活的。3.如果精子頭部僅有小部分被染色，認為是頸膜泄漏，不是細胞死亡和全部膜破壞的跡象。這種情況下認為該精子是活的。2.6.1.4正常參考下限活精子（細胞膜完整精子）比例的參考下限為58%（置信度為95%，置信區(qū)間為55-63）。注：一次射精量中（見2.8.7節(jié)），精子細胞膜完整的精子總數(shù)具有生理學意義，可以通過精子總數(shù)乘以具有完整精子細胞膜的比例得到。2.6.2僅用曙紅（伊紅）染料評估精子活力該方法簡單快速，但所制備濕片無法儲存以用于質(zhì)量控制。2.6.2.1試劑的制備1.NaCl，0.9%（w/v）：將0.9gNaCl溶于100ml凈化水中。2.曙紅Y染劑，0.5%（w/v）：將0.5g曙紅Y（比色指數(shù)，45380）染料溶于100ml濃度為0.9%的NaCl溶液中。注：一些商用曙紅溶液是會對精子結(jié)構(gòu)造成破壞的低滲溶液，這會造成假陽性結(jié)果。如果使用這種溶液，需向100ml溶液中添加0.9g的NaCl以提高滲透壓。2.6.2.2操作步驟1.充分混勻精液樣本（見框2.3）。2.吸取5μl的精液樣本，同5μl的曙紅溶液在載玻片上混勻?？墒褂靡埔浩黝^在載玻片樣本上充分攪拌以保證混合均勻。3.用22mm×22mm的蓋玻片覆蓋，反應(yīng)30秒。4.重新混勻精液樣本，重新吸取樣本，重復(fù)上述步驟2和3。5檢驗所制備的玻片，以放大倍數(shù)為200或400倍的負相位光學顯微鏡（正相位目鏡難以辨明染為淡粉色的頭部）檢驗為佳。6.用實驗室計數(shù)器來計數(shù)染色（死亡）和非染色（存活）細胞的數(shù)目。7.為了達到可接受的低樣本誤差，每張玻片評估200個精子（見框2.5）。8.統(tǒng)計所制備的兩張玻片中活動精子的平均數(shù)和百分率的差異。9.以表2.1或是圖A7.2，附錄7為標準（在僅考慮樣本誤差的前提下，均顯示95%的樣本其兩個百分率的最大差異是可以接受的），推斷是否為可接受的差異。10．如果其百分率上的差異是可以接受的，則可報告其活力的平均百分比。如果差異過高，則重新制備標本再次進行評估（見框2.6）。11.所報告的精子活力的百分比應(yīng)盡可能涵蓋所有的精子數(shù)目。2.6.2.3計分1.存活精子的頭部染色為白色或淡粉色，死亡精子的頭部染色為紅色或深粉色。2.如果染色僅限于頸部區(qū)域，剩余的頭部未染色，則可認為是“頸部細胞膜不全”，這并非是細胞死亡和細胞膜崩解的標志，此類細胞應(yīng)被認為是存活細胞。3.如果難以辨識淺染的頭部，可使用苯胺黑以增加背景的對比度(見2.6.1節(jié))。2.6.2.4正常參考下限活精子（細胞膜完整精子）比例的參考下限為58%（置信度為95%，置信區(qū)間為55-63）。注：一次射精量中（見2.8.7節(jié)），精子細胞膜完整的精子總數(shù)具有生理學意義，可以通過精子總數(shù)乘以具有完整精子細胞膜的比例得到。2.6.3活精子的低滲膨脹檢驗作為一種可供選擇的染色排除方法，低滲膨脹（HOS）檢驗可以用于評估精子的存活情況（Jeyendran等，1984）。當無法進行染色時，如選擇用于ICSI的精子，該法為最有效地評估方法。細胞膜完整的精子在低滲介質(zhì)中會于5分鐘膨脹，且其形狀會在30分鐘內(nèi)保持穩(wěn)定(Hossain等,1998)。使用方法：·如為常規(guī)診斷用途可孵化30分鐘·如果為治療目的則只可孵化5分鐘2.6.3.1試劑制備1.用于診斷的膨脹液的制備：將0.735g二水檸檬酸鈉和1.351g右旋果糖溶于100ml的凈化水中。該溶液需保存于-20℃2.如用于治療用途，以1+1（1：2）的比例用無菌凈化水溶解介質(zhì)。2.6.3.2操作步驟1.使用前溶解膨脹液充分混勻。2.以37℃3.充分混勻樣本（見框2.3）。4.吸取100μl的精液樣本并添加膨脹液。用移液器緩慢抽吸混勻。5.37℃下準確孵化5分鐘或30分鐘（見上），之后取10μl液體置于潔凈的載玻片上，加蓋22mm×22mm6.按上述步驟，再次混勻精液樣本，再次吸取標本，混入膨脹液，孵化，再次制備涂片。7.用放大倍數(shù)為200或400倍的光學顯微鏡檢測涂片。8.用實驗室計數(shù)器輔助計數(shù)未膨脹（死亡）和膨脹（存活）的細胞數(shù)目。9.為了保證較低的樣本誤差，每張涂片計數(shù)200個精子（見框2.5）。10.統(tǒng)計所制備的兩張玻片中活動精子的平均數(shù)和百分率的差異。11.以表2.1或是圖A7.2，附錄7為標準（在僅考慮樣本誤差的前提下，均顯示95%的樣本其兩個百分率的最大差異是可以接受的），推斷是否為可接受的差異。12.如果其百分率的差異是可以接受的，則可報告其活力平均百分比。如果差異過高，則重新制備標本再次進行評估（見框2.6）。13.所報告的精子活力的百分比應(yīng)盡可能涵蓋所有的精子數(shù)目。2.6.3.3計分1.通過細胞形狀的改變來確認膨脹的精子，如顯示為尾部卷縮（圖2.6）。2.精子尾部有膨脹表現(xiàn)則可認定為存活精子；將所有尾部膨脹的精子均計為存活精子。圖2.6低滲膨脹狀態(tài)下的人類精子的典型形態(tài)變化表現(xiàn)示意圖（a）無變化（b）—（g）不同的尾部變化灰色區(qū)域提示為腫脹的尾部。2.6.3.4正常參考下限HOS檢驗的參考值接近于曙紅檢驗的參考值（Carreras等，1992）?；钚跃樱毎ね暾樱┍壤膮⒖枷孪逓?8%（置信度為95%，置信區(qū)間為55-63）。注釋：一次射精的精液中的精子細胞膜的完整性的總數(shù)目是有生物學意義的。細胞膜完整的精子數(shù)目可通過一次射精的總精子數(shù)乘以細胞膜完整精子的百分率來獲得。2.7精子計數(shù)每次射精時精子的總數(shù)和精子濃度均與妊娠的時間(Slamaetal.,2002)與妊娠率(WHO,1996;Zinamanetal.,2000)有關(guān)，可通過其預(yù)測受孕(Bondeetal.,1998;Larsenetal.,2000)。此推論已為生殖率與精子總數(shù)之間關(guān)系的諸多資料所證明。射精時精子的數(shù)量，是由鑒定精液得出的精子密度來統(tǒng)計。對于正常射精，當男性生殖道是通暢的且禁欲時間短，每次射精時的精子總數(shù)均與睪丸容積有關(guān)(Handelsman等,1984;WHO,1987;Andersen等,2000;Behre等,2000)，所以，精子總數(shù)是衡量睪丸成生精子的能力(MacLeod&Wang,1979)與男性生殖道通暢的指標。與受精和妊娠率相關(guān)的精液中精子濃度受精囊(Eliasson,1975)和前列腺分泌多少的影響，并非是睪丸功能的特異性指標。注釋1：“精子總數(shù)”一詞與“精子密度”一詞并非同義詞?！熬用芏取敝傅氖敲繂挝惑w積精液中精子的數(shù)量，是射出的精子數(shù)目與液體稀釋體積的函數(shù)?！熬涌倲?shù)”指的是一次射精時全部精液中的精子總數(shù)，由精子密度乘以精液體積獲得。注釋2：一般說來，一次射出時的精子總數(shù)反映了睪丸的生精能力，但脊髓損傷、雄激素不足、延長禁欲后采集的樣本或不完全逆行射精的病患則是例外。注釋3：當精子密度（每單位體積的數(shù)）有意義時，“精子密度（每單位體積的量）”一詞不應(yīng)使用。精子計數(shù)的確定包括以下步驟（后續(xù)的細節(jié)章節(jié)有詳解）：·在載玻片上涂抹液化后未稀釋的混勻精液樣本，覆上蓋玻片進行檢驗，以確定適于使用的稀釋度和計數(shù)池（見2.8.1）。這即是通常用于鑒定活力的濕片（見2.4.2）?！⒕号c加入固定劑的稀釋液混合?！ぷ尵撼涮钛毎嫈?shù)器的一個計數(shù)池?！?0－15分鐘內(nèi)評估樣本（干燥后會在數(shù)精池內(nèi)出現(xiàn)明顯精子痕跡）?！っ看沃貜?fù)至少計數(shù)200條精子?！け容^每次重復(fù)的計數(shù)以了解其是否在可接受的誤差范圍。如是，則繼續(xù)計算；如否，則準備新的稀釋。·計算每ml精子密度。·計算每次射精的精子總數(shù)。2.7.1計數(shù)池類型推薦使用100μm深血球細胞計數(shù)器為計數(shù)池，因Neubauer（牛鮑氏）血球細胞計數(shù)器改良后的稀釋因素更適宜。使用另外深度的血細胞計數(shù)器計數(shù)池，有著不同的深度和網(wǎng)格模式，要求不同的計數(shù)因子。所使用的計數(shù)池對決定精子密度是有效的(Seaman等,1996;Mahmoud等,1997;Brazil等,2004b)，但改良后的Neubauer血球細胞計數(shù)器得到的結(jié)果將會不同。通過毛細管作用填充的淺計數(shù)池，由于流動精子不會均勻分布(Douglas-Hamilton等,2005a,2005b)。該誤差能夠被校正(Douglas-Hamilton等,2005a)，但校正并非是完全正確的(Bj?rndahl&Barratt，2005)。這種可選擇的計數(shù)池，其有效性須經(jīng)計數(shù)池核查量綱來確定(見附錄7,A7.8節(jié))，將Neubauer改良的血細胞計數(shù)器法得出的結(jié)果加以比較，獲得如客觀的質(zhì)量控制程序所顯示出的滿意操作性能。為實現(xiàn)低密度精子的精確鑒定，需采用大容積的數(shù)精池(見2.11.2)。2.7.2改良的Neubauer（紐鮑爾氏）血球細胞計數(shù)器改良的Neubauer血細胞計數(shù)器有兩個隔開的計數(shù)池，每個計數(shù)池均在玻片上gridlines蝕刻出顯微鏡下可見的3mm×3mm模式，采用專用的厚載玻片(厚度4號,0.44mm)，由0.1mm玻璃柱支撐，覆蓋網(wǎng)格。每個計數(shù)區(qū)分成九個1mm×1mm網(wǎng)格。這些網(wǎng)格見圖2.7中數(shù)字所示。圖2.7改良的Neubauer（紐鮑爾氏）血球細胞計數(shù)器蝕刻區(qū)略圖如下所示：血球細胞計數(shù)器計數(shù)池的所有九個網(wǎng)格（左邊面板）；25個大方格中的中央網(wǎng)格（5號）（中間面板）；顯微鏡下已充填的一個數(shù)精池的部分（右邊面板），即中央網(wǎng)格的25個方格之一（中間面板的圓圈所示），其由三重線圍出，包含16個小方格。2.7.3血球細胞計數(shù)器網(wǎng)格的使用·只對整個精子（包括頭和尾）進行計數(shù)。·以精子頭部位進行計數(shù)；尾的定向不重要；方格的邊界由三線的中間線標明，所以，需統(tǒng)計精子頭的大部分是否位于兩條內(nèi)線之間，而并非大部分頭部在兩條外線之間(圖2.8,左面板)。·為避免毗鄰方格內(nèi)的同一精子的重復(fù)計數(shù)，頭部位于劃分兩個毗鄰方格的線上的精子，應(yīng)只計兩條垂直界線之一上的精子。例如，精子大部分的頭部低于L型(見圖2.8,中間面板)中央界線或在其左邊的，可計數(shù)，而中央界線上方或右邊的不予計數(shù)（見圖2.8,右邊面板）。注意：如果有頭部缺失的精子尾（針頭）或無尾精子，在報告中應(yīng)記錄。若有需要，其濃度應(yīng)通過與正常精子計數(shù)同樣的方法進行評估(見2.8)，或其在精子中的比率可由染色法確定(見2.17.6)。2.7.4計數(shù)器的維護血球細胞計數(shù)器計數(shù)池須用專用的厚蓋玻片(厚度4號,0.44mm)?！な褂煤螅盟逑囱毎嫈?shù)器數(shù)精池和蓋玻片，然后用相機（鏡頭）專用紙充分干燥，這樣可避免干燥后的任何雜質(zhì)殘留。摩搓網(wǎng)格方格可除去先前樣本的任何殘留物?！ぴ谙緞┲羞^夜浸泡可重復(fù)使用的數(shù)精池和蓋玻片(見附件2,A2.4部分)，避免污染精液中潛在的傳染因子。三線的中間線確定了方格的邊界（黑線，左邊面板）。除頭部在兩條內(nèi)線之間（白圈）的精子之外，方格中央的所有精子均計數(shù)，但頭部在兩條外線之間的需計數(shù)（黑圈）。頭部大部分在中間線上的精子，如果該中線低于方格（白圈，中間面板）或是方格的左手線，則精子需計數(shù)，但如果該中線高于方格（黑圈，右邊面板）或是方格的右手線則不計數(shù)。圖2.8網(wǎng)格方格內(nèi)計數(shù)的精子2.7.5稀釋后精液的固定1．1000mL純水中溶解50gNaHCO3和10ml35%(v/v)甲醛溶液。2．如果急需，加0.25g臺盼藍（顏色所引23859）或5mL(>4mg/ml)飽和的結(jié)晶紫（顏色所引42555），以加亮精子頭部。3．4°C貯藏。若溶液中是以結(jié)晶形式存在，使用前用0.45-μ2.7.6計數(shù)足夠數(shù)量精子的重要性為降低樣本誤差，精子的臨界數(shù)量（大約200條重復(fù)計數(shù)時，總數(shù)400條以上更合適）（見框2.7和表2.2）?？?.7估計數(shù)值時的誤差精子數(shù)目的估算精度依賴于所計數(shù)精子的數(shù)目。在泊松分布中，計數(shù)（N）的標準誤差（SE）是單位體積精液中精子數(shù)目的平方根（√N），其95%的置信區(qū)間（CI）接近N±1.96×√N（或為N±2×√N左右）。如果計數(shù)100個精子，那么標準誤差（SE）即為10（√100），其95%的置信區(qū)間（CI）是80-120（100±20）。如果計數(shù)200個精子，則SE為14（√200），其95%CI為172-288（200±28）。如果計數(shù)400個精子，則SE為20（√400），其95%CI為360-440（400±40）。樣本誤差一般表達為計數(shù)的百分比（100×（√N/N））。詳見表2.2注意：這些評估僅是大致，因為評估時可信度的間隔不會總是均勻?；诓此煞植嫉木_的95%可信度間隔，一次計數(shù)400條時為361-441條；一次計數(shù)100條時為81.4–121條；一次計數(shù)10條時為4.80–18.4；一次計數(shù)1條時為0.03–5.57；一次計數(shù)0條時為0.00–3.70。表2.2參照精子計數(shù)總數(shù)的圓形樣本誤差（%）注釋1：太少的精子用于計數(shù)，將會得出不可確信的結(jié)果（見附錄7，A7.1節(jié)），對診斷和治療產(chǎn)生影響(見附錄7,A7.2)。當精子用于治療目的以與精子數(shù)量少時，這現(xiàn)象不可避免（見5.1節(jié)）。注釋2：當精液量少以與用于計數(shù)的精子少于推薦量時，所獲得的數(shù)據(jù)的精確度將顯著下降。如果每次重復(fù)少于200條精子，報告樣本誤差見表2.2。（廣西南寧第二醫(yī)院生殖中心劉峰）2.8常規(guī)計數(shù)程序如果在計數(shù)池4、5和6大方格或是其中之一中有大約200條精子，那么按1+4(1：5)和1+19(1：20）稀釋是合適的（見表2.3和框2.8）?？?.8每次重復(fù)計數(shù)時改良紐鮑爾氏計數(shù)池中央3個大方格的精子數(shù)達到200。在初始的濕片制備中，如果容積為4nl的每高倍視野（參閱2.9）有100條精子，理論上精子密度為25/nl(25000/μl或25000000/ml)。由于改良紐鮑爾氏計數(shù)池的中央大方格（5號方格）容積是100nl，則其內(nèi)的精子數(shù)目將是2500。以1+4(1:5)倍數(shù)稀釋樣本將會調(diào)整每個大方格精子數(shù)量為500，這樣可獲得足夠低的抽樣誤差。在初始的濕片制備中，如果每高倍視野有10條精子，則精子密度是25/nl，中央大方格的精子數(shù)目是250。建議以1+1(1:2)倍數(shù)稀釋樣本將會調(diào)整每個大方格精子數(shù)量是125。同樣，這可獲得足夠低的抽樣采樣誤差。注：由于計數(shù)的精子數(shù)目太少和計算的容積可能不太準確，上述濃度計算只是粗略的估計。未稀釋精液樣本濃度估計大約是稀釋精液樣品計數(shù)濃度的30％至130%。2.如果要準確測量未稀釋精液樣本的精子數(shù)量，將精液予以稀釋是必要的，這種方法也通常用于在濕片制備中評測精子活力（請參閱2.4.2節(jié)）。如2.4.2節(jié)中所述制作濕片并檢測其中之一，估計每高倍視野(×200或×400)的精子數(shù)。每高倍視野大約相當于16nl(在×200)或4nl(在×400）的容積（請參閱框2.9）。如檢測到精子，則按照2.8.2節(jié)的步驟予以計數(shù)，并根據(jù)表2.3確定需要的稀釋度。如果檢測不到精子，則檢測另一濕片。如果在第二張濕片中仍沒有檢測到精子，按照2.9節(jié)的步驟進行?？?.9池深為20μm的濕片中每高倍視野的容積每個顯微鏡檢測視野包含的精液量取決于該區(qū)域的面積（πr2，其中π大約是3.142，r為顯微鏡檢測視野的半徑）和池的深度（濕片制備中大約是20.7μm）。顯微鏡視野的直徑可以用鏡臺微尺測量，或可以通過目鏡的光圈直徑除以物鏡的放大倍數(shù)來估算。如使用×40的物鏡和口徑為20mm×10目鏡，則顯微鏡視野的直徑大約500μm(20mm/40)。這種情形下，r=250μm，r2=62500μm2，πr2=196375μm2，而該區(qū)域的容積是4064962μm3或大約4nl。如使用×20的物鏡和口徑為20mm×10目鏡，則顯微鏡視野的直徑大約是1000μm(20mm/20)。這種情形下，r=500μm，r2=250000μm2，πr2=785500μm2，而該區(qū)域的容積是16259850μm3或大約16nl。表2.3精液所需稀釋度、配制方法、使用的計數(shù)板和評估區(qū)域每×400視野的精子數(shù)每×200視野的精子數(shù)所需稀釋度所需精液量（μl）所需固定液（μl）使用的計數(shù)板評估區(qū)域>101>4041：20（1+19）50950改良紐鮑氏方格5、4、616-10064-4001：5(1+4)50200改良紐鮑氏改良紐鮑氏2-158-601:2(1+1)5050改良紐鮑氏改良紐鮑氏<2<81:2(1+1)5050改良紐鮑氏或更大容積整塊玻片的9個方格注1：白細胞移液管和依靠空氣置換原理的自動移液管并不足以將粘性精液準確稀釋，建議使用正向置換型移液管。注2：就診斷而言，用于分析的精液樣本不應(yīng)小于50μl，以避免因小容量樣本而造成的抽樣誤差。注3：如在推薦的稀釋倍數(shù)下每視野可見的精子數(shù)目太少，則以更低的稀釋倍數(shù)制備另一個濕片。如在推薦的稀釋倍數(shù)下每視野有太多的重疊精子，則以更高的稀釋倍數(shù)制備另一個濕片。注4：如果1+19(1:20)稀釋不合適，則使用1+49(1:50)稀釋。注釋1：如果初始濕片制備中精子數(shù)目太低(每×400高倍視野<4：大約1×106/ml)，此時可不要求計算準確的精子數(shù)量（請參閱2.10）。注釋2：為準確評估低密度精子（每×400高倍視野<2：大約0.5×106/ml)，建議對改良紐鮑爾氏計數(shù)池板的9個大方網(wǎng)格全部計數(shù)（請參閱2.11.1），或使用大容量的一次性計數(shù)板進行熒光檢測（請參閱2.11.2）。2.8.2稀釋精液并加樣于血細胞計數(shù)池吹打使血細胞計數(shù)池表面微微濕潤。將蓋玻片緊壓支持柱以固定于計數(shù)池上，可通過觀察兩層玻璃之間的虹彩（多重Newton環(huán)）來確認蓋玻片是否正確置放：光線越多，位置越合適；如只有1-2條光線則提示計數(shù)池深淺不一。采用正向置換型移液管將適量的固定劑（見表2.3）分配到兩個稀釋瓶中。將精液樣本混勻（請參閱框2.3）?；靹蚝罅⒓次脒m量的精液，以避免精子從懸浮液中沉降（見表2.3）。將移液管尖端的精液擦拭干凈，小心以避免碰到尖端的開口。將精液加入固定劑中，反復(fù)吸壓以洗刷移液管尖頭部。重新將精液樣本混勻，按以上步驟重復(fù)另一份稀釋。將第一次稀釋的液體置于振蕩器以最高的速度振蕩10秒鐘以充分混勻，立即吸取大約10μl的懸浮液以避免精子沉降。將移液管尖端仔細觸碰其中一個計數(shù)池v型槽的下緣。慢壓移液管槍栓，通過毛細管作用使樣本充滿計數(shù)池。在充池過程中蓋玻片不應(yīng)有移動，且計數(shù)池不應(yīng)過滿（此時可看到蓋玻片有移動）或不滿（此時可見計數(shù)池內(nèi)有氣泡）。如上將第二次稀釋的液體混勻，并立即吸取10μl懸浮液。重復(fù)以上步驟對另一計數(shù)池充池。將血細胞計數(shù)板平放置于濕盒內(nèi)（例如放在浸透水的過濾紙上并蓋上皿）以免干燥，在室溫下儲存至少4分鐘。這段時間不動的細胞將沉淀在方格內(nèi)。注1：有些計數(shù)池是由磨砂玻璃支持柱構(gòu)成，此時將不出現(xiàn)Newton環(huán)。在每側(cè)的磨砂玻璃支持柱邊滴注1.5μl的水可使蓋玻片保持其位置不變，但小心不要讓水滲入計數(shù)區(qū)域。注2：使用血細胞計數(shù)板夾保持蓋玻片位置不變將確保一個固定的池深(Christensen等，2005年)。注3：對于非常粘稠的精液樣品，如果混勻過程延遲5–10秒鐘，則精液可在稀釋液中凝集。遇到這種情況，應(yīng)在精液添加入固定液后立即旋渦式攪拌10秒鐘。2.8.3在計數(shù)池中檢測精子數(shù)量均應(yīng)在兩個血細胞計數(shù)池中檢測精子數(shù)量。如果兩個檢測值充分一致，其值可信(參閱第2.4.1節(jié))。在×200或×400放大倍數(shù)的光學相差顯微鏡下檢測血細胞計數(shù)池。每次至少重復(fù)計數(shù)200個精子以達到足夠低的抽樣誤差（請參閱框2.7和表2.2）。首先對其中一個改良紐鮑爾氏計數(shù)池的中央大方格（圖2.7中的5號）逐行進行計數(shù)。繼續(xù)計數(shù)直到至少200個精子和完整的一行(包括5個中方格）。計數(shù)必須包括完整的一行，不能在一行的中間停止。如果在中央大方格的5行中計數(shù)不夠200個精子，繼續(xù)在兩個相鄰大方格（圖2.7第4和6號)的各行中(每行包括4個中方格）計數(shù)。將計數(shù)達到至少200個精子所需要的行數(shù)予以記錄，檢測另一計數(shù)池時也要在相同的行數(shù)內(nèi)計數(shù)。借助實驗室計算器計算精子的數(shù)目和行數(shù)。切換至另一計數(shù)池，重復(fù)計數(shù)與第一次相同的行數(shù)（相同體積），即便計數(shù)結(jié)果少于200個精子。計算兩次計數(shù)的總數(shù)和差異值。根據(jù)表2.4或附錄7圖A7.1確定差異的可接受性(均顯示在95%的可信區(qū)間內(nèi)，單純抽樣誤差允許的兩個數(shù)值的最大差異值。)。如果差異可以接受，則計算精子密度（請參見2.8.4）；如果差異太大，則如章節(jié)2.8.2所述重新進行雙份稀釋并重新計數(shù)（請參閱框2.10）。取兩個有效數(shù)值的平均值作為精子密度予以報告。計算每次射精的精子總數(shù)(參閱2.8.7節(jié))。注1：如果在4、5和6號大方格中計數(shù)少于200個精子，不要繼續(xù)在1、2、3、7、8或9號大方格中計數(shù)，因為這些大方格中每行的容積不同于4、5和6號大方格(參閱2.7.2節(jié))。這種情況下，可降低稀釋倍數(shù)進行雙份稀釋和計數(shù)。如果需要1+1(1:2)稀釋，則按章節(jié)2.11的步驟進行。注2：對同一計數(shù)池進行兩次計數(shù)或?qū)ν淮蜗♂屘畛涞膬蓚€計數(shù)池進行計數(shù)都不是真正的重復(fù)計數(shù)，因為這樣并沒能對采樣、混合與稀釋所造成的誤差進行檢測?？?.10重復(fù)計數(shù)的比較兩個相對獨立數(shù)值的理想差異值為0，其標準差等于兩個數(shù)值之和的平方根。因此在95%的可信區(qū)限內(nèi)(N1–N2)/(√(N1+N2))應(yīng)該小于1.96。如果兩個數(shù)值之間的差異值小于或等于表2.4或表2.5給出的數(shù)值，則評估可被接受，精子密度可計算為兩個數(shù)值的均值。較大的差異值則意味著可能發(fā)生計數(shù)