不同時間脾切除聯(lián)用環(huán)孢素對協(xié)調(diào)性異種心臟移植物存活的影響

1/1不同時間脾切除聯(lián)用環(huán)孢素對協(xié)調(diào)性異種心臟移植物存活的影響不同時間脾切除聯(lián)用環(huán)孢素對協(xié)調(diào)性異種心臟移植物存活的影響不同時間脾切除聯(lián)用環(huán)孢素對協(xié)調(diào)性異種心臟移植物存活的影響作者：

王博，呂毅，張曉剛，李暉，仵正，潘承恩【摘要】目的探討脾切除聯(lián)用環(huán)孢素對協(xié)調(diào)性異種移植心臟存活時間的影響及其機制。

方法建立協(xié)調(diào)性異種心臟移植模型。

分別采用不同時間脾切除聯(lián)用環(huán)孢素，觀察異種移植物的生存時間。

用CH50法檢測各組動物血清中總補體活性。

應用流式細胞技術檢測動物血清中異種反應性抗體IgG、IgM的滴度變化。

移植物標本HE染色觀察病頑理學改變。

免疫組化染色觀察各實驗組不同時間移植物組織中IgG、IgM抗體箜的沉積。

結(jié)果脾切除聯(lián)用環(huán)孢素能夠顯著作延長移植物的生存時間(P【關鍵詞】茼異種移植；環(huán)孢素；心臟移植同種異體被器官移植成為終末期腎臟、心臟、肝臟等ィ疾病的常規(guī)治療手段，已經(jīng)為越來越多的顥患者所接受。

但是，人類供體器官缺乏一直困擾著器官移植的發(fā)展。

用合適的動物％作為器官供體，可能成為解決器官缺乏的波有效手段之一。

自20世紀60年代起，ㄏ人們用非人類器官進行異種移植的嘗試以赭來，已經(jīng)進行了腎、心、肝臟等器官異種倒移植。

但是，異種移植的免疫排斥反應較喋同種移植更為強烈。

協(xié)調(diào)性異種移植(c筅oncordantxenotrans肼plantation)中，移植物雖不芑發(fā)生超急性排斥反應，但是在移植術后3傾-4d內(nèi)將會發(fā)生急性血管排斥反應(acutevascularrejection,AVR)。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，誘ゼ生型異種反應性抗體(elicited籟xenotractiveantibody,EXA)在AVR中起到重要作用暌。

EXA結(jié)合于移植物血管內(nèi)皮細胞上，鎰激活補體、活化血管內(nèi)皮細胞，產(chǎn)生一系傴列黏附分子和前炎癥細胞因子，最終導致烷移植物被排斥[1]。

因此，通過調(diào)節(jié)移猁植術后早期EXA的產(chǎn)生可能延緩或減輕塾排斥反應的發(fā)生。

本試驗中，我們將通過嫁不同時間脾切除聯(lián)用環(huán)孢素對受者進行干俱預，觀察異種移植物在受者體內(nèi)的存活情況，初步探討異種反應性抗體在異種排斥示反應中的作用。

1材料與方法動讒物與分組供體為健康成年金黃地鼠7蝴0只，80-100g，雌雄不拘。

受體項SD大鼠70只，180-200g，均雖購自西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心。

咽采用雙套入法建立金黃地鼠對SD大加鼠協(xié)調(diào)性異種心臟移植模型。

將實驗動物煢隨機分為6組：

對照組(n＝10)，不蜴予任何治療措施；環(huán)孢素組(n=10)鸞，移植當日起每日腹腔注射環(huán)孢素10m癰g/kg；脾切除組(n＝10)，移植枋心臟復跳后即予以脾切除；D0脾切除＋笪CsA組(n＝15)，移植心臟復跳后嬤即予以脾切除，每日腹腔注射環(huán)孢素10mg/kg；D1脾切除＋CsA組(n店＝15)，移植術后1d予以脾切除，每拱日腹腔注射環(huán)孢素10mg/kg；D3抵脾切除＋CsA組(n=10)，移植術后3d予以脾切除，每日腹腔注射環(huán)孢素狙10mg/kg。

術后處理與觀察每組隨機選取5例實驗動物觀察移植心臟嘌存活時間。

移植心臟復跳至停跳的時間為軒異種移植物存活時間[2]。

移植心臟存莢活時間大于30d認為長期存活。

移植物磲在3d內(nèi)停跳，視為手術失敗。

血清鍇標本與組織標本的采集分別于移植術貽后1、2、3、7、14、30d剖殺動蕨物取血清、移植心臟標本，將血清標本?；４嬖?20℃低溫冰箱中，以備檢測血清侵中補體活性和異種反應性抗體IgG、IヱgM的滴度。

取供體心臟組織進行HE染放色的組織病理學檢測。

CH50實驗產(chǎn)檢測各實驗組血清補體溶血活性配制薔2%(體積分數(shù))綿羊紅細胞懸液。

各實槲驗組血清、正常大鼠血清(對照)稀釋2瘢0倍。

用生理鹽水將溶血素稀釋為2u/藜mL。

在各管中分別加入試劑和反應物，銓放入37℃水浴箱中溫浴30min。

選擇溶血程度與標準管相近的兩管在分光光猸度計上，540nm波長條件下，測量讀取吸光度A值。

每毫升血清總補體活性(４單位)＝1/血清用量稀釋倍數(shù)。

異種反應性抗體IgG、IgM的測定た應用流式細胞技術測定對照組、D1脾藁切除＋CsA組、D3脾切除＋CsA組羋大鼠血清中異種反應性IgG、IgM抗聳體[3]。

采用CellQuest軟件的分析系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)處理。

實驗動物血清中遺所含異種反應性IgG、IgM抗體相對木滴度應用下列公式表示：

異種反應性Ig膜G、IgM抗體相對滴度＝各實驗組血清菡平均熒光強度/正常大鼠血清平均熒光強捋度。

免疫組化染色檢測各實驗組移植櫪物組織中異種反應性抗體IgM、IgG毒的沉積石蠟切片脫蠟至水，3%(體貰積分數(shù))H2O2室溫下孵育20min焦。

微波抗原修復，10%(體積分數(shù))山羊血清封閉。

滴加一抗，抗體稀釋度為1蹼∶50，置冰箱4℃過夜。

加聚合物增強餐劑50-100L，在37℃反應20min后，每張切片滴加DAB顯色液。

移植物組織中IgG、IgM沉積時陽性痊表達的判定：

移植物血管內(nèi)皮細胞表面和組織中可見棕黃色顆粒樣物質(zhì)沉積。

統(tǒng)計學處理實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)標準差株(s)表示，軟件包進行數(shù)據(jù)分析，P厭2結(jié)果移植心臟存活時間脾切詼除組、D0脾切除＋CsA組、D1脾切笞除＋CsA組、D3脾切除＋CsA組移配植物存活時間明顯較對照組延長。

環(huán)孢素翊組移植物生存時間與對照組無顯著性差異ぇ。

各實驗組移植心臟存活時間見表1。

表音1不同組異種移植物的存活時間移榍植物的病理學改變對照組、環(huán)孢素組亦、脾切除組、D3脾切除+CsA組移植眈心臟發(fā)生排斥反應時，光鏡下可見廣泛血坳管內(nèi)血栓形成伴心肌組織間大量的出血。

章心肌組織中大量的單個核細胞、淋巴細胞畬浸潤(圖1A)。

D0脾切除+CsA組７、D1脾切除+CsA組移植術后第14天時，心臟組織中可見炎細胞浸潤，無明能顯出血、血栓形成。

移植術后第30天時，可見少量微血栓形成，未見明顯組織出⑦血，組織間有少量單個核細胞和淋巴細胞ｄ浸潤(圖1B)。

各組不同時間CH綈50值的變化正常SD大鼠血清總補む體活性為()u/mL(正常參考值范釘圍為50-100u/mL)。

本實驗中瀆，對照組、環(huán)孢素組、脾切除組、D3脾切除+CsA組受體體內(nèi)總補體活性在術鼯后明顯下降，提示受者體內(nèi)大量補體活化帝。

D0脾切除+CsA組和D1脾切除+旃CsA組受體血清CH50值在移植術后胬處于正常范圍內(nèi)。

異種反應性抗體I♂gG、IgM在移植心臟組織中的沉積對照組、環(huán)孢素組、脾切除組、D3脾餃切除+CsA組，移植心臟發(fā)生排斥反應時，組織中可見大量IgG、IgM沉積ㄈ于血管內(nèi)皮細胞表面(圖1C-D)。

D雀0脾切除＋CsA組和D1脾切除+Cs刪A組長期存活(生存時間大于30d)的櫛移植心臟血管內(nèi)皮細胞表面可見異種反應ぁ性抗體的沉積(圖1E-F)。

各實驗組動物體內(nèi)抗異種反應性抗體的變化對照組、D1脾切除＋CsA組、D3脾璺切除+CsA組大鼠血清中異種反應性I烙gM、IgG抗體的變化(圖2-4)。

碟3討論在協(xié)調(diào)性異種移植時，異種Ｄ抗原刺激受者免疫系統(tǒng)可以產(chǎn)生較高水平的誘生型異種反應性抗體(elicit嗆edxenotractiveantibody,EXA)[47]，抗體結(jié)合于異種移植物血管內(nèi)皮細胞表面，激活縉補體、活化內(nèi)皮細胞[8]，繼而導致排牙斥反應的發(fā)生。

排斥反應的發(fā)生與EXA灼IgM、EXAIgG關系密切[9]。

旄EXAIgG的產(chǎn)生是T細胞依賴性的。

逾這類抗體的產(chǎn)生可以被環(huán)孢素等T細胞免鞘疫抑制劑所抑制。

EXAIgM的產(chǎn)生是男T細胞非依賴性的，其產(chǎn)生不受環(huán)孢素等謹T細胞免疫抑制劑的影響。

異種移植中，脾臟是產(chǎn)生T細胞非依賴性抗體和B淋巴細胞介導的體液免疫反應的重要器官[1镅0]。

脾臟的超微結(jié)構(gòu)有利于抗原識別和踔抗原特異性效應細胞的產(chǎn)生[11]。

有萼研究表明，產(chǎn)生異種抗體的B淋巴細胞主倦要存在于大鼠脾臟內(nèi)[1214]。

因此，我們推測可以通過脾切除來抑制受者齜體內(nèi)異種反應性抗體的產(chǎn)生，從而延緩異玉種移植的急性血管排斥反應的發(fā)生。

本試郊驗中，我們通過不同時間脾切除聯(lián)用環(huán)孢詆素，觀察移植物在受者體內(nèi)的生存時間。

鄢環(huán)孢素組移植物生存時間與對照組間無顯凜著性差異，提示EXAIgM在急性血管墀排斥反應中起到重要作用。

脾切除組移植物生存時間較對照組延長2-3d，但不能使異種移植物長期存活。

證實協(xié)調(diào)性異撞種移植時，EXAIgG也參與了急性血嶄管排斥反應。

手術當天和術后第1天脾切啕除聯(lián)用環(huán)孢素后，異種移植物能夠在受者系體內(nèi)長期存活。

CH50實驗顯示對照組Ｃ、環(huán)孢素組、脾切除組、D3脾切除+C間sA組受者體內(nèi)的總補體活性逐漸升高，直至發(fā)生排斥反應。

然而，D0脾切除+龕CsA組和D1脾切除+CsA組受者體薇內(nèi)總補體活性始終處于正常范圍內(nèi)。

通過訕檢測受者體內(nèi)異種反應性抗體滴度后發(fā)現(xiàn)詢：

盡管D1脾切除+CsA組實驗動物體繆內(nèi)存在一定量的異種反應性抗體，但其一旺直處于低水平。

這與移植術后早期脾切除幀聯(lián)用環(huán)孢素有關。

其可能原因是：

低水平的異種反應性抗體不足以激活補體。

隨著掏移植時間的延長，受者體內(nèi)的異種反應性酎抗體雖然有升高趨勢，但移植物仍然沒有ァ被排斥。

這可能與移植物本身發(fā)生的一系列改變有密切關系，即低濃度的抗體對內(nèi)皮細胞的持續(xù)性刺激導致內(nèi)皮細胞對損傷的敏感性下降[1516]。

D3脾切腸除+CsA組由于在移植術后第3天進行暌脾切除，不能在早期抑制EXAIgM的撅產(chǎn)生。

因此，移植物不能長期存活。

綜上所述，通過抑制移植術后早期受者體內(nèi)異趼種反應性抗體的產(chǎn)生使其處于較低水平，總可以顯著延長異種移植物的生存時間，有棋利于減少排斥反應的發(fā)生。

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