E. coli表達(dá)策略及純化過程優(yōu)化

E.Coli表達(dá)策略及純化過程優(yōu)化北京義翹神州科技股份有限公司義翹神州CONTENT原核（E.coli）重組表達(dá)技術(shù)介紹1表達(dá)策略設(shè)計(jì)2原核重組表達(dá)產(chǎn)品純化過程優(yōu)化3原核（E.coli）重組表達(dá)技術(shù)介紹01義翹神州技術(shù)路線義翹神州根據(jù)目標(biāo)開發(fā)工藝規(guī)模需求質(zhì)量需求質(zhì)譜功能研究理化檢測基礎(chǔ)研究/抗原原料或治療性需求pgpg/ngμgmgg/kg極高質(zhì)量高質(zhì)量中等質(zhì)量純度/活性/內(nèi)毒素/宿主殘留/無菌……純度/活性/內(nèi)毒素……純度/活性/內(nèi)毒素……治療性蛋白藥物體外實(shí)驗(yàn)藥物原輔料，……蛋白試劑科研研究理化性質(zhì)鑒定，……免疫義翹神州表達(dá)策略設(shè)計(jì)02義翹神州蛋白表達(dá)策略

—表達(dá)不誤純化工前期調(diào)研二級結(jié)構(gòu)預(yù)測PDB數(shù)據(jù)庫文獻(xiàn)收集堿基序列優(yōu)化氨基酸序列優(yōu)化載體構(gòu)建本臺(tái)涵蓋經(jīng)濟(jì)常用商業(yè)載體標(biāo)簽的選擇共表達(dá)體系表達(dá)宿主是否表達(dá)表達(dá)量高低毒性蛋白表達(dá)含硫鍵蛋白表達(dá)低內(nèi)毒素表達(dá)密碼子偏好表達(dá)義翹神州蛋白表達(dá)策略

—表達(dá)載體與宿主菌載體系列pETpGEXpColdpBAD啟動(dòng)子T7/T7lacTaccspAaraBAD誘導(dǎo)劑乳糖或IPTG乳糖或IPTG溫度配合乳糖或IPTG阿拉伯糖優(yōu)劣勢最常用，標(biāo)簽形式多樣，高表達(dá)/易形成包涵體促溶，親和純化/GST標(biāo)簽降解，親和純化介質(zhì)成本高低溫誘導(dǎo)元件，溫度敏感蛋白，易形成包涵體蛋白表達(dá)/生長緩慢，表達(dá)量低毒性蛋白表達(dá)/配套阿拉伯糖分解代謝突變的宿主菌，表達(dá)受限使用頻率★★★★★★★★☆☆★☆☆☆☆★☆☆☆☆宿主菌BL21(DE3)、Rosetta(DE3)

、BL21(DE3)pLysS、ShuffleT7……義翹神州蛋白表達(dá)策略

—案例分析表達(dá)量和可溶性都有明顯的提升表達(dá)量提升20倍產(chǎn)品1優(yōu)化核酸序列對表達(dá)量的影響誘導(dǎo)前誘導(dǎo)后全菌誘導(dǎo)后上清誘導(dǎo)后沉淀誘導(dǎo)后全菌誘導(dǎo)后上清誘導(dǎo)后沉淀M11666.245.035.025.018.414.4核酸序列Ⅰ核酸序列Ⅱ洗脫上清沉淀M產(chǎn)品N在不同宿主菌中表達(dá)優(yōu)化洗脫上清沉淀M宿主A宿主B義翹神州蛋白表達(dá)策略

—共表達(dá)體系一個(gè)質(zhì)粒，一次轉(zhuǎn)錄，四次翻譯（pST39）一個(gè)質(zhì)粒，兩次轉(zhuǎn)錄，兩次翻譯（RSFDuet-1）兩個(gè)質(zhì)粒，兩次轉(zhuǎn)錄，兩次翻譯（pGEX/RSFDuet-1）A目標(biāo)蛋白(His)B伴侶蛋白表達(dá)后全菌Marker純化后復(fù)合物11666.245.035.025.018.414.4GelID:20220519-Gel-07-13%11666.245.035.025.018.414.4Marker純化后復(fù)合物B伴侶蛋白A目標(biāo)蛋白(His)通過調(diào)整緩沖液解除復(fù)合物之間的相互作用力GelID:20220523-Gel-37-13%義翹神州表達(dá)策略

—標(biāo)簽的選擇及切除重組蛋白的標(biāo)簽的選擇考慮因素：種類（實(shí)際需求）位置（對活性，轉(zhuǎn)錄翻譯及純化的影響）串聯(lián)標(biāo)簽（主要是純化及標(biāo)簽的去除和保留）標(biāo)簽去除（相應(yīng)工具酶和純化方式）Tag

純化促溶抗體效價(jià)細(xì)胞標(biāo)記His（6~10）+/?+/GST+++++/Sumo/++++/MBP++++/GFP/++++++Avi//?+++++Enzymes酶切位點(diǎn)EKDDDDK↓HRV3CLEVLFQ↓GPTEVENLYFQ↓GUIpSumoFactorXaIEDGR↓ThrombinLVPR↓GS常用工具酶及酶切位點(diǎn)常用標(biāo)簽義翹神州原核重組表達(dá)產(chǎn)品純化過程優(yōu)化03義翹神州目標(biāo)蛋白純化策略

—目標(biāo)產(chǎn)物和雜質(zhì)結(jié)構(gòu)

特點(diǎn)

目標(biāo)蛋白的認(rèn)識（穩(wěn)定性）（性質(zhì)）（來源）分類

來源

雜質(zhì)的認(rèn)識表達(dá)過程表達(dá)體系外源污染物異構(gòu)體降解聚集包涵體…宿主蛋白宿主DNA內(nèi)毒素培養(yǎng)成分…金屬離子去污劑有機(jī)溶劑…小分子代謝產(chǎn)物內(nèi)毒素DNA多糖等病毒20~300nm蛋白類1KD~750KD原核微生物0.15~10μm細(xì)胞5~30μm離心，過濾/超濾0.1nm1nm10nm100nm1μm10μm100μm種屬來源表達(dá)定位蛋白功能溫度pH蛋白酶金屬離子大小等電點(diǎn)親/疏水性tag義翹神州收集收集培養(yǎng)基上清（分泌表達(dá)）-A收集菌體（胞內(nèi)或周質(zhì)空間表達(dá)）菌體破碎高壓均質(zhì)超聲破碎滲透壓/反復(fù)凍融（周質(zhì)空間表達(dá)）獲取預(yù)處理樣品上清液-A沉淀（包涵體）-BA類樣品B類樣品原核表達(dá)重組蛋白提取流程圖目標(biāo)蛋白純化策略

—目標(biāo)產(chǎn)物提取流程義翹神州樣品預(yù)處理（換液/濃縮/過濾）樣品捕獲（快速/高效分離）樣品精純（平衡收率和純化效率）樣品預(yù)處理（包涵體洗滌/變性/純化）復(fù)性（復(fù)性緩沖液/復(fù)性方法/換液）復(fù)性后樣品再處理（濃縮/精純/質(zhì)控）義翹神州目標(biāo)蛋白純化策略

—A類樣品純化策略（CIPP）CapturePurificationPolishing目的：快速分離/濃縮/穩(wěn)定要求：快速高載/好的選擇性/高收率建議：大孔徑/壽命長/耐壓/流速快目的：去除大部分雜質(zhì)要求：高分辨率（選擇性）建議：孔徑適當(dāng)減小/高載填料（highperformanceHP）/高分辨率（Source30）目的：痕量雜質(zhì)（異構(gòu)/聚集/降解等）要求：高分辨率（選擇性/效率）建議：小孔徑/高分辨填料Source15，mono/SECResolutionSpeedCapacityYield義翹神州目標(biāo)蛋白純化策略

—A類樣品純化策略

StepsTechniqueCapturePurificationPolishingConsideration分子篩（SEC）★★★★上樣體積受限流速受限/時(shí)間長壽命短離子層析（IEX）★★★★★★★★★起始電導(dǎo)有要求疏水層析（HIC）★★★★★★高鹽上樣受溫度影響較大收率各層析技術(shù)中較低親和層析（AC）★★★★★★★特異性好，但是導(dǎo)致同樣敏感的雜質(zhì)也很難去除反相層析（RPC）★★★★pH極端/有機(jī)溶劑，導(dǎo)致蛋白失活CIPP純化策略中各層析技術(shù)使用頻率概況義翹神州目標(biāo)蛋白純化策略

—A類樣品純化策略Q&AQ1：帶有親和標(biāo)簽不掛柱什么原因？怎么處理？A：1）標(biāo)簽短未暴露；

2）結(jié)構(gòu)不正確，高度聚集，標(biāo)簽未暴露。Q2：產(chǎn)品在純化過程中發(fā)生了降解怎么辦？A：1）排除是培養(yǎng)過程中發(fā)生的降解，純化過程中解決辦法是加蛋白酶抑制劑和低溫環(huán)境，降低物理剪切力等；

2）如果出現(xiàn)在培養(yǎng)過程中，需要優(yōu)化培養(yǎng)條件。Q3：樣品在純化過程中收支不平衡是什么原因？A：樣品沉淀在層析柱上，可能出現(xiàn)的原因有，比如樣品對金屬離子敏感而發(fā)生沉淀，比如樣品對濃度有要求而導(dǎo)致發(fā)生的沉淀等……義翹神州目標(biāo)蛋白純化策略

—B類樣品純化策略前期預(yù)處理

包涵體的溶解

復(fù)性過程目標(biāo)產(chǎn)物質(zhì)量驗(yàn)證包涵體樣品的變復(fù)性處理義翹神州目標(biāo)蛋白純化策略

—前期預(yù)處理&包涵體溶解菌體破碎緩沖體系:PB,Tris去污劑:Tween20,TritionX-100,DOC添加劑:non-denaturingconcentrationsofchaotrophs(Urea,GdmHCl),salts,EDTA……SonicationHighpresshomogenization前期預(yù)處理包涵體溶解Buffer:PB,TrisChaotrophs:8MUrea,6MGdmHClreducingagent:DTT,β-ME,TCEP,GSH……Detegent:CHAPS,N-lauroylsarcosine,SDSpH:low,high溶解緩沖液包涵體洗滌義翹神州目標(biāo)蛋白純化策略

—復(fù)性過程復(fù)性緩沖液——文獻(xiàn)，廣譜篩選……復(fù)性方法——稀釋（透析，滴加等），柱上復(fù)性……復(fù)性條件——濃度，溫度，攪拌速率，時(shí)間，換液及換液方式復(fù)性緩沖液添加劑參考試劑可促進(jìn)二硫鍵形成的添加劑可提高天然結(jié)構(gòu)形成和抑制蛋白聚集沉淀的添加劑1）氧化還原系統(tǒng)：GSH/GSSG;

氧化型/還原型DTT

胱胺/半胱胺，等2）Cu2+催化空氣氧化3）S-磺化化學(xué)試劑1）氨基酸：L-Arg，Gly2）蔗糖或甘油（大于10%w/v）3）表面活性劑：CHAPs，等4）聚乙二醇（PEG）40005）高濃度Tris（0.4M-1M）6）輔基金屬離子或配體7）非去污劑型硫代甜菜堿（NDSBs）義翹神州目標(biāo)蛋白純化策略

—目標(biāo)產(chǎn)物質(zhì)量驗(yàn)證Electrophoresis(PAGE)DynamicLightScattering(DLS)CircularDichroism(CD)

ChromatographicTechnic(HPLC)Testofactivity(Elsia,cellactivity,etal)關(guān)于“北京義翹神州”堅(jiān)持自主研發(fā)生產(chǎn)打造中國生命科學(xué)研究“一站式”試