PCR技術(shù)的研究與現(xiàn)狀分析課程論文

PCR技術(shù)的研究與現(xiàn)狀分析摘要：PCR技術(shù)是一種體外酶促合成、擴(kuò)增特定DNA片段的方法。因其高強(qiáng)的特異性和靈敏度以及檢測速度快、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于水產(chǎn)、微生物檢測、臨床微生物、基因表達(dá)、腫瘤免疫、微小殘留病變的檢測，DNA拷貝數(shù)的測量、基因組變異和多態(tài)性等許多方面。本文主要介紹4種PCR技術(shù)及其在各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀。關(guān)鍵詞：PCR技術(shù)；分類；研究現(xiàn)狀；應(yīng)用；ResearchandApplicationStatusofPCRTechnologyClass1Bio-engineering10Student:LaoYangyanStudentID:1031250019Tutor:WeiDongmeiAbstract:PCRisaninvitroenzymaticsynthesis，amplificationofspecificDNAfragment.Becauseofitshigh-strengthspecificityandsensitivity，detectionspeedandgoodaccuracy，ithasbeenwidelyappliedinmanyfieldssuchastheaquatic，microbialdetection，clinicalmicrobiology，geneexpression，tumorimmunology，detectionofminimalresiduallesion，measurementofDNAcopynumber，genomemutation，polymorphismandsoon.Thisarticlesummarize4kindsofPCRtechnology，withitsapplicationstatusisanalysed.Keywords:PCRtechnology；Category；Progressresearch；Application引言聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)問世20多年以來,已經(jīng)在生物學(xué)研究領(lǐng)域內(nèi)得到了巨大的發(fā)展并不斷的完善,不僅廣泛應(yīng)用在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域,在疾病診斷等方面也有了越來越廣泛深入的研究和應(yīng)用。1985年，美國Karray等學(xué)者首創(chuàng)了PCR技術(shù)，并且由美國Cetus公司開發(fā)研制[1]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和突破，PCR技術(shù)已在多個(gè)領(lǐng)域得到廣泛地應(yīng)用，如微生物檢測、獸醫(yī)學(xué)、水產(chǎn)養(yǎng)殖等方面。由于該技術(shù)具有較強(qiáng)的靈敏度、準(zhǔn)確度和特異性，又能快速進(jìn)行檢測，因而其應(yīng)用領(lǐng)域也在不斷延伸[2]。隨著PCR技術(shù)的不斷發(fā)展，在常規(guī)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上又衍生出了許多技術(shù)，如多重PCR技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)、單分子PCR技術(shù)、變性梯度凝膠電泳技術(shù)。目前應(yīng)用最多的為熒光定量。本文主要介紹4種PCR技術(shù)及其在各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀。并對(duì)PCR的前景進(jìn)行了展望，讓其更好的服務(wù)于人們的生活。PCR技術(shù)原理PCR技術(shù)是根據(jù)待擴(kuò)增的已知DNA片段序列、人工合成與該DNA2條鏈末端互補(bǔ)的2段寡核苷酸引物，在體外將待檢DNA序列（模板）在酶促作用下進(jìn)行擴(kuò)增。PCR的整個(gè)技術(shù)過程經(jīng)若干個(gè)循環(huán)組成，一個(gè)循環(huán)包括連續(xù)的3個(gè)步驟：第1步是高溫條件下的DNA模板變性，即模板DNA在93~94℃的條件下變性解鏈；第2步是退火，即人工合成的2個(gè)寡核苷酸引物與模板DNA鏈3’端經(jīng)降溫至55℃退火；第3步是延伸，即在4種dNTP底物同時(shí)存在的情況下，借助TaqDNA聚合酶的作用，引物鏈將沿著5’-3’方向延伸與模板互補(bǔ)的新鏈[3]。經(jīng)過這個(gè)循環(huán)后，合成了新鏈，可將其作為DNA模板繼續(xù)反應(yīng)，由此循環(huán)進(jìn)行。循環(huán)進(jìn)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的量以指數(shù)方式增加，一般單一拷貝的基因循環(huán)25~30次，DNA可擴(kuò)增l00~200萬倍。PCR反應(yīng)的步驟很簡單，但是具體的操作是復(fù)雜的，如退火溫度的確定、延伸時(shí)間的長短以及循環(huán)數(shù)等。因此，不同的反應(yīng)體系應(yīng)該確定適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件，以避免假陰性或假陽性等情況的產(chǎn)生。PCR技術(shù)的分類在傳統(tǒng)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，根據(jù)人們的需要以及各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用要求，又衍生出很多種類的PCR技術(shù)。新技術(shù)在各領(lǐng)域廣泛應(yīng)用并逐漸改進(jìn)，為進(jìn)一步的研究提供了基礎(chǔ)。2.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)1996年，學(xué)者經(jīng)過研究，在傳統(tǒng)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，首創(chuàng)了實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，新技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用至醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、分子生物學(xué)和其他基礎(chǔ)研究領(lǐng)域。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)基于傳統(tǒng)技術(shù)的優(yōu)勢，還具有實(shí)時(shí)性、準(zhǔn)確性、無污染，實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化操作和多重反應(yīng)，是PCR技術(shù)研究史上從定性到定量的飛躍[4]。熒光定量PCR技術(shù)最大的特點(diǎn)是能將熒光基團(tuán)加入到PCR反應(yīng)體系中，借助于熒光信號(hào)，累積實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析[5]。實(shí)時(shí)監(jiān)測這一特點(diǎn)是常規(guī)PCR技術(shù)所不具有的，因?yàn)槠鋵?duì)擴(kuò)增反應(yīng)不能進(jìn)行隨時(shí)的檢測。常規(guī)PCR技術(shù)的擴(kuò)增終產(chǎn)物需要在凝膠電泳等條件下才能進(jìn)行，無法對(duì)起始模板進(jìn)行準(zhǔn)確的定量，而熒光定量PCR技術(shù)的反應(yīng)進(jìn)程可以根據(jù)熒光信號(hào)的變化做出準(zhǔn)確的判斷[6]。一個(gè)PCR循環(huán)反應(yīng)結(jié)束之后，定量PCR儀可以收集1個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，熒光信號(hào)強(qiáng)度的變化可以反映產(chǎn)物量的變化情況，這樣就可以得到1條熒光擴(kuò)增曲線[7]。熒光信號(hào)在指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物熒光信號(hào)的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性對(duì)應(yīng)關(guān)系，然后進(jìn)行定量分析[8]。2.2多重PCR技術(shù)多重PCR（mutiplexPCR）技術(shù)是PCR技術(shù)的一種，為同一管中加入多對(duì)特異性引物，與PCR管內(nèi)的多個(gè)模板反應(yīng)，在一個(gè)PCR管中同時(shí)檢測多個(gè)目標(biāo)DNA分子。多重PCR技術(shù)可以擴(kuò)增一個(gè)物種的一個(gè)片段，也可以同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)物種的不同片段[9]。在同一反應(yīng)體系中，多重PCR技術(shù)進(jìn)行多個(gè)位點(diǎn)的特異性擴(kuò)增時(shí)，引物間的配對(duì)、引物間的競爭性擴(kuò)增等會(huì)對(duì)擴(kuò)增效果產(chǎn)生重要影響。一方面，如果能選擇適宜的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，可極大地提高多重PCR的擴(kuò)增效果[10]。主要包括退火溫度、退火及延伸時(shí)間、PCR緩沖液成分、dNTP的用量、引物及模板的量等。另一方面，DNA的抽提質(zhì)量也影響多重PCR擴(kuò)增效率，如DNA抽提不干凈或降解都將影響PCR擴(kuò)增效果[11]。2.3單分子PCR技術(shù)（SM-PCR）單分子PCR技術(shù)是在傳統(tǒng)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展的，基本循環(huán)過程相同，但在反應(yīng)條件、模板數(shù)量、DNA聚合酶選擇、引物設(shè)計(jì)方面具有不同點(diǎn)。該技術(shù)是以少量或單個(gè)DNA分子為模板進(jìn)行的PCR[12]。單分子PCR技術(shù)反應(yīng)中，DNA模板濃度極低，這就要求模板有較高的質(zhì)量。因?yàn)檫@是試驗(yàn)成敗的決定性因素。在設(shè)計(jì)引物時(shí)，應(yīng)該嚴(yán)格控制GC的含量和Tm值，同時(shí)盡量避免引物間存在可配對(duì)序列。在反應(yīng)混合物模板數(shù)極低的情況下，若引物之間存在少量配對(duì)序列，擴(kuò)增時(shí)極易形成二聚體，使反應(yīng)無法進(jìn)行，得不到所需要的產(chǎn)物[13]。由于單分子PCR技術(shù)反應(yīng)的變性溫度（96~98℃）大多比常規(guī)PCR技術(shù)（94℃）略高，因而對(duì)DNA聚合酶熱穩(wěn)定性的要求也更加嚴(yán)格，需要有較好的熱穩(wěn)定性，以防止溫度過高而使其失活。其變性時(shí)間（5~15s）、退火時(shí)間及延伸時(shí)間也短于常規(guī)PCR技術(shù)。2.4變性梯度凝膠電泳PCR技術(shù)(DenaturingGradientGelElectrophoresis)PCR-DGGE技術(shù)是基于核酸序列的不同，將片段大小相同的DNA序列分開的一種技術(shù)方法[14]。在進(jìn)行變性梯度凝膠電泳時(shí)，序列不同的DNA片段因?yàn)閴A基組成和排列的差異，在聚丙烯酰胺凝膠中解鏈時(shí)需要不同的變性劑濃度，并會(huì)發(fā)生空間構(gòu)型的變化，最終導(dǎo)致電泳遷移率的差異。將通過PCR擴(kuò)增之后得到的等長雙鏈DNA分子，在含梯度變性劑(如尿素、甲酰胺)的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳時(shí)，電泳遷移率的差異會(huì)使不同序列的DNA片段停留在凝膠的不同位置，從而形成相互分開的條帶圖譜[15]。從理論上講,只要選擇的電泳條件足夠精細(xì),就可以分開僅有1個(gè)堿基差異的DNA片段[16]。PCR技術(shù)的應(yīng)用3.1PCR技術(shù)在水產(chǎn)上的應(yīng)用基因表達(dá)是檢測某個(gè)基因在不同發(fā)育期或不同組織中的表達(dá)量變化，或受到某種試驗(yàn)處理過程中的影響而出現(xiàn)表達(dá)量變化的情況。有學(xué)者應(yīng)用real-timePCR技術(shù)研究碳水化合物含量對(duì)翹嘴紅鲴糖代謝酶G6Pase、GK以及PEPCK表達(dá)量的影響[17]，研究結(jié)果可為翹嘴紅鲴飼料配方中的最合適糖含量提供理論依據(jù)[18]。孫淑娜等研究葉酸拮抗劑對(duì)斑馬魚心臟發(fā)育相關(guān)基因BMP2b及HAS2表達(dá)的影響，表明葉酸拮抗劑對(duì)早期胚胎的心臟發(fā)育影響較大，可導(dǎo)致斑馬魚心臟發(fā)育延遲及心臟形態(tài)異常，并下調(diào)斑馬魚心臟發(fā)育相關(guān)基因BMP2b及HAS2的表達(dá)，這可能是葉酸生物學(xué)活性受抑后導(dǎo)致心臟發(fā)育異常的機(jī)制之一。Sawyeretal以斑馬魚的未受精卵、胚胎、仔魚和成魚為研究材料，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測了P450aromA和P450aromB在不同組織的表達(dá)量，表明在各組織中均有2種基因的表達(dá)，但表達(dá)量顯著不同，呈現(xiàn)組織特異性。3.2PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光探針，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，除了具有常規(guī)PCR的快速、靈敏、操作方便等特點(diǎn)外，還具有以下優(yōu)點(diǎn)：全封閉反應(yīng)，無需凝膠電泳等PCR后處理，減小對(duì)環(huán)境的污染；不使用有毒試劑，操作安全；定量準(zhǔn)確；儀器在線實(shí)時(shí)監(jiān)測，結(jié)果直觀。多重PCR技術(shù)是通過對(duì)普通PCR技術(shù)的改進(jìn)而建立起來的一種技術(shù)，是將多條引物和多條模板混合在一個(gè)反應(yīng)體系中分別特異擴(kuò)增不同的目的條帶，或者多條引物和單一的模板DNA混合在同一反應(yīng)體系中擴(kuò)增同一模板的不同片斷，常用于對(duì)超長片斷的擴(kuò)增。與常規(guī)的PCR相比，還具有擴(kuò)增效率高、產(chǎn)物特異性高和經(jīng)濟(jì)簡便等特點(diǎn)，特別適合食品中多種致病菌的快速檢測。PCR-DGGE技術(shù)具有可檢測不可培養(yǎng)類細(xì)菌、檢測時(shí)間短、檢測率高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。近些年來，此技術(shù)在食品中檢測微生物后應(yīng)用也有報(bào)道。3.3PCR技術(shù)在臨床微生物中的應(yīng)用許多傳染病的特點(diǎn)是具有高度的變異率，這會(huì)嚴(yán)重影響對(duì)致病菌的評(píng)估，分子信標(biāo)可以用于病原菌的定量。它的優(yōu)點(diǎn)是:一個(gè)沒有熒光的淬滅物可以用于4個(gè)不同的熒光染料，這樣就可以同時(shí)檢測和定量4個(gè)樣本。在許多應(yīng)用領(lǐng)域需要同時(shí)對(duì)多個(gè)核酸進(jìn)行定量，這將大大降低檢測的花費(fèi)和所需的時(shí)間。這個(gè)方法的另一個(gè)好處在于加樣的誤差被最小化了，而且所有核酸都是在相同的條件下同時(shí)擴(kuò)增，這樣它所獲得的數(shù)據(jù)就更加精確可靠。當(dāng)然，多通道檢測比單通道檢測更為復(fù)雜也需要解決可能出現(xiàn)的更多問題。廣東省花都市人民醫(yī)院、中山醫(yī)科大學(xué)基因診斷中心采用熒光定量PCR檢測技術(shù)對(duì)淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒等5個(gè)項(xiàng)目進(jìn)行了定量測定，結(jié)果表明定量PCR方法可靠性和重復(fù)性好，且操作簡便、快速，結(jié)果判斷客觀。除此以外，目前已有用此方法對(duì)人類免疫缺陷病毒，肝炎病毒，結(jié)核桿菌，巨細(xì)胞病毒，EB病毒，流感病毒A、B等病原體進(jìn)行檢測的報(bào)道。3.4PCR技術(shù)在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用家育DNA多態(tài)性研究是近年來興起的分子水平遺傳標(biāo)記選擇技術(shù),對(duì)于開展品種問遺傳差異程度、種群間親緣關(guān)系、個(gè)體問遺傳相似性,親子鑒定等方面的工作,對(duì)于開展數(shù)量性狀的間接選擇,早期選擇,提高數(shù)量性狀選擇效率等研究均具有重要的意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。PCR技術(shù)的出現(xiàn)大大推動(dòng)了上述研究的進(jìn)程。以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的DNA多態(tài)性分析和檢測技術(shù),如PCR-RFLP(限制性長度多態(tài)性),PCR-SSCP(多聚酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的單鏈構(gòu)象多態(tài)性)和AFLP(擴(kuò)增片斷長度多態(tài)性)等,已經(jīng)在豬DNA多態(tài)性研究中得到了應(yīng)用,并且有可能迅速推廣到育種實(shí)踐中去。3.5PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品檢測中的應(yīng)用轉(zhuǎn)基因食品，是利用基因工程技術(shù)將有利的基因轉(zhuǎn)移到微生物,，植物或動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，使他們獲得有利的特性，再由這些轉(zhuǎn)基因物種生產(chǎn)或處理獲得的食品及添加劑。由此可增加食品的種類，提高產(chǎn)量，改進(jìn)營養(yǎng)成分的構(gòu)成，延長貨架期等，目前，轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品的安全性問題越來越引起消費(fèi)者的重視[25]。為了保護(hù)人類的健康，世界衛(wèi)生組織在20世紀(jì)90年代提出了對(duì)轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)的要求，對(duì)食品中的GMOs存在與否進(jìn)行標(biāo)示。因此，對(duì)食品中的GMOs進(jìn)行監(jiān)測，建立安全性檢驗(yàn)的技術(shù)與方法，成為管理和審批工作的重要基礎(chǔ)。在眾多的監(jiān)測方法中，PCR是最常用以及最適用的監(jiān)測轉(zhuǎn)基因食品的方法。PCR方法中，常用的幾個(gè)特定序列分為三類：1、調(diào)控序列：他們調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)入植物的基因的表達(dá)。由于大多數(shù)轉(zhuǎn)基因食品的基因都含有CaMV35S啟動(dòng)子和NOS終止子，因此，在檢測食品中是否含有GMOs時(shí)，可以直接檢測CaMV35S啟動(dòng)子和/或NOS終止子的存在與否，如果存在，即可說明其中存在GMOs。2、標(biāo)記序列，用于幫助在遺傳轉(zhuǎn)化中篩選和鑒定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，組織和再生植株，一般是抗生素抗性基因。3、目的基因，即轉(zhuǎn)入的基因，如抗蟲、抗除草劑基因。用PCR方法鑒定植株中檢出的目的基因，標(biāo)記基因，報(bào)告基因，35S，NOS等外源基因片段，為轉(zhuǎn)基因食品的篩選鑒定及為安全性評(píng)價(jià)提供敏感直接的數(shù)據(jù)，成為轉(zhuǎn)基因食品安全性檢驗(yàn)中一項(xiàng)重要的技術(shù)手段。PCR技術(shù)的應(yīng)用前景展望傳統(tǒng)PCR技術(shù)以及衍生出來的新型PCR技術(shù)自面世以來，已被廣泛應(yīng)用到生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。隨著技術(shù)方法的不斷改進(jìn)與完善，熒光定量PCR技術(shù)將會(huì)逐漸完善并廣泛應(yīng)用；多重PCR技術(shù)在食品病原微生物、非致病微生物及環(huán)境微生物檢測中將具有重要作用。未來的研究主要集中在去除食品抑制因子干擾、改進(jìn)樣品前處理技術(shù)等方面。隨著研究的不斷深入發(fā)展與完善，許多相關(guān)的新類型及改良的PCR技術(shù)將會(huì)不斷涌現(xiàn)，這些派生出的新類型和新方法必將在未來食品檢測中有非常好的應(yīng)用前景。參考文獻(xiàn):[1]常世敏,PCR在食品微生物檢測中的應(yīng)用[J].邯鄲農(nóng)業(yè)高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào),2004,21（4）:23-25.[2]唐永凱,俞菊華,徐跑,等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)及其在水產(chǎn)上的應(yīng)用[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2010（21）:422-426.[3]謝海燕.黑線倉鼠LHR部分序列克隆及組織器官的表達(dá)差異[D].曲阜：曲阜師范大學(xué)，2011.[4]KUBISTAM,ANDRADEJM,BENGTSSONM,eta1.Thereal-timepolymerasechainreaction[J].MoLecularAspectsofMedicine,2006,27（2-3）:95-125.[5]AGINDOTANBO,SHIELPJ,BERGERPH.Simultaneousdetectionofpotatoviruses,PLRV,PVA,PVXandPVYfromdormantpotatotubersbyTaqManreal-timeRT-PCR[J].JVirolMethods,2007,142（1-2）:l-9.[6]薛霜,獨(dú)軍政,高閃電,等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究進(jìn)展及其在獸醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2010（7）:11-15.[7]SCHUBERTJ,FOMITCHEVAV,SZTANGRET-WISNIEWSKAJ.DifferentiationofPotatovirusYstrainsusingimprovedsetsofdiagnostic-PCR-primers[J].JVirolMethods,2007,140（1-2）:66-74.[8]袁繼紅.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的實(shí)驗(yàn)研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2010（13）:20-22.[9]朱善元.生物檢測技術(shù)PCR及其在獸醫(yī)微生物檢測中的應(yīng)用[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),1999（11）:21-22.[10]銀花,胡曉湘,李寧,等.影響多重PCR擴(kuò)增效果的因素[J].遺傳,2003,25（1）:65-68.[11]陳諾,唐善虎，岑璐伽，等.多重PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用進(jìn)展[J].生物技術(shù)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