高中三年級(jí)上學(xué)期生物《蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用》教學(xué)課件

蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用一.蛋白質(zhì)工程

蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過(guò)改造或合成基因，來(lái)改造現(xiàn)有蛋白質(zhì)，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類生產(chǎn)和生活的需求。二.蛋白質(zhì)工程的實(shí)例--胰島素的改造（一）胰島素的發(fā)現(xiàn)及改造歷程

胰島素于1921年由加拿大科學(xué)家首先發(fā)現(xiàn)。1922年開始用于臨床，使過(guò)去不治的糖尿病患者得到挽救。

1955年英國(guó)F.桑格小組測(cè)定了牛胰島素的全部氨基酸序列，開辟了人類認(rèn)識(shí)蛋白質(zhì)分子化學(xué)結(jié)構(gòu)的道路。

70年代初期，英國(guó)和中國(guó)的科學(xué)家又成功地用X射線衍射方法測(cè)定了豬胰島素的立體結(jié)構(gòu)。這些工作為深入研究胰島素分子結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

1965年，中國(guó)科學(xué)家人工合成了具有全部生物活力的結(jié)晶牛胰島素，它是第一個(gè)在實(shí)驗(yàn)室中用人工方法合成的蛋白質(zhì)，稍后美國(guó)和聯(lián)邦德國(guó)的科學(xué)家也完成了類似的工作。（一）胰島素的發(fā)現(xiàn)及改造歷程二.蛋白質(zhì)工程的實(shí)例--胰島素的改造第一代胰島素-動(dòng)物胰島素

1921年弗雷德里克·班?。‵rederickBanting）與約翰·麥克勞德（JohnMacleod）合作首次成功提取到了胰島素，不同種族哺乳動(dòng)物（人、牛、羊、豬等）的胰島素分子的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)稍有差異，其中豬胰島素與人的最為接近。動(dòng)物胰島素是最早應(yīng)用于糖尿病治療的胰島素注射制劑，一般是豬胰島素，豬胰島素與人胰島素存在1至4個(gè)氨基酸的不同，因此容易發(fā)生免疫反應(yīng)，注射部位皮下脂肪萎縮或增生，胰島素過(guò)敏反應(yīng)，并且由于其免疫原性高，容易反復(fù)發(fā)生高血糖和低血糖，容易出現(xiàn)胰島素抵抗。（一）胰島素的發(fā)現(xiàn)及改造歷程二.蛋白質(zhì)工程的實(shí)例--胰島素的改造第二代胰島素-人胰島素

20世紀(jì)80年代，人們通過(guò)基因工程表達(dá)出高純度的合成人胰島素，其結(jié)構(gòu)和人體自身分泌的胰島素一樣。

對(duì)比動(dòng)物胰島素，人胰島素較少發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)或者胰島素抵抗，所以皮下脂肪萎縮的現(xiàn)象也隨之減少；由于人胰島素抗體少，所以注射量比動(dòng)物胰島素平均減少30%；人胰島素的穩(wěn)定性高于動(dòng)物胰島素，常溫25℃左右常溫可保存人胰島素4周。

在起效時(shí)間、峰值時(shí)間、作用持續(xù)時(shí)間上不能模擬生理性人胰島素分泌模式。需在餐前30分鐘注射、有較高的夜間低血糖風(fēng)險(xiǎn)。（一）胰島素的發(fā)現(xiàn)及改造歷程二.蛋白質(zhì)工程的實(shí)例--胰島素的改造第三代胰島素-胰島素類似物

20世紀(jì)90年代末,在對(duì)人胰島素結(jié)構(gòu)和成分的深入研究中發(fā)現(xiàn),對(duì)肽鏈進(jìn)行修飾:利用基因工程技術(shù),改變胰島素肽鏈上某些部位的氨基酸組合;改變等電點(diǎn);增加六聚體強(qiáng)度;以鈷離子替代鋅離子;在分子中增加脂肪酸鏈,加大與白蛋白的結(jié)合,均有可能改變其理化和生物學(xué)特征,從而可研制出更適合人體生理需要的胰島素類似物(insulinsimilitude)。胰島素類似物可緊臨餐使用，也稱為餐時(shí)胰島素或速效胰島素。1、動(dòng)物胰島素：從豬和牛的胰腺中提取，兩者藥效相同。2、超短效：注射后15分鐘起作用。

（例如門冬胰島素、賴脯胰島素）3、短效(速效)：注射后30分鐘起作用，持續(xù)5~8小時(shí)（皮下、肌內(nèi)、靜注）。

（如普通胰島素、正規(guī)胰島素）4、中效：注射后2~4小時(shí)起效，持續(xù)24~28小時(shí)（皮下）。

（如低精蛋白鋅胰島素）5、長(zhǎng)效：注射后4~6小時(shí)起效。

（精蛋白鋅胰島素）6、超長(zhǎng)效：注射后3~6個(gè)小時(shí)起效，維持時(shí)間為6~24小時(shí)（皮下）。

（地特胰島素、甘精胰島素）7、預(yù)混：注射后0.5個(gè)小時(shí)起效，維持時(shí)間為24小時(shí)（皮下）。

（雙時(shí)相胰島素）（二）胰島素的分類二.蛋白質(zhì)工程的事例--胰島素的改造（三）胰島素的結(jié)構(gòu)二.蛋白質(zhì)工程的事例--胰島素的改造

人胰島素由A、B兩個(gè)肽鏈組成。人胰島素(InsulinHuman)A鏈有11種21個(gè)氨基酸，B鏈有15種30個(gè)氨基酸，共51個(gè)氨基酸組成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四個(gè)半胱氨酸中的巰基形成兩個(gè)二硫鍵，使A、B兩鏈連接起來(lái)。此外A鏈中A6(Cys)與A11(Cys)之間也存在一個(gè)二硫鍵。（四）胰島素的改造二.蛋白質(zhì)工程的事例--胰島素的改造1、基于胰島素序列的改造預(yù)期蛋白質(zhì)功能設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)推測(cè)應(yīng)有的氨基酸序列

找到對(duì)應(yīng)的脫氧核苷酸序列

天然胰島素容易形成二聚體或六聚體，皮下注射胰島素后往往要經(jīng)歷一個(gè)逐漸解離為單體的過(guò)程，這在一定程度上延緩了療效。

人工設(shè)計(jì)胰島素時(shí)，希望降低胰島素寡聚形式的穩(wěn)定性，使胰島素更快地解離，進(jìn)入到循環(huán)系統(tǒng)中，快速達(dá)到治療效果。生產(chǎn)出自然界從來(lái)沒(méi)有過(guò)的蛋白質(zhì)根據(jù)人類對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的探究，推測(cè)將B28位脯氨酸替換為天冬氨酸，或?qū)28的脯氨酸和B29位的賴氨酸交換位置可

合成DNA（四）胰島素的改造二.蛋白質(zhì)工程的事例--胰島素的改造2、基于胰島素序列的其它改造ＮＰＨ胰島素，作用時(shí)間約持續(xù)１５～１８ｈ；進(jìn)入人體內(nèi)６ｈ后達(dá)到峰值，因此，它不能在睡前服用，以避免夜間低血糖的發(fā)生。開發(fā)了甘精胰島素；甘氨酸取代Ａ２１位的天冬酰胺，２個(gè)精氨酸殘基被添加到Ｂ鏈的Ｃ－末端，減慢了毛細(xì)血管對(duì)藥物的吸收，在很大程度上降低了夜間低血糖的發(fā)生率。由于該制劑顯酸性，不能與其它短效制劑混合使用，并且可能在注射期間導(dǎo)致疼痛。將Ｂ鏈的Ｃ－末端截短，消除了Ｂ３０處的蘇氨酸殘基，Ｂ２９處的賴氨酸被肉豆蔻基部分?；?。使其可以配制成ｐＨ中性溶液。同時(shí)用脂肪二酸替換肉豆蔻基，增強(qiáng)藥物的穩(wěn)定性，使胰島素的生物活性在體內(nèi)可持續(xù)２４ｈ。（四）胰島素的改造二.蛋白質(zhì)工程的事例--胰島素的改造2、基于胰島素二硫鍵的修飾胰島素及其類似物進(jìn)入人體后，存在潛在的問(wèn)題：二硫鍵對(duì)某些還原劑（如硫、醇）以及二硫化物異構(gòu)酶不穩(wěn)定，易導(dǎo)致結(jié)構(gòu)重排和活性喪失?；谶@種情況，研究人員向胰島素分子中引入更穩(wěn)定的電子等排體，例如，用三唑、硫醚、硒醚、內(nèi)酰胺等替換結(jié)構(gòu)中的一個(gè)或幾個(gè)二硫鍵，以使其具有更好的熱穩(wěn)定性。添加二硫鍵的胰島素類似物具有更好的熱穩(wěn)定性和功能活性，在Ａ鏈的第１０個(gè)氨基酸和Ｂ鏈的第４個(gè)氨基酸加入一個(gè)二硫鍵，所得到的胰島素類似物對(duì)胰島素受體的親和力增強(qiáng)，并且在動(dòng)物（大鼠）體內(nèi)的藥效動(dòng)力學(xué)效能顯著增強(qiáng)。（四）胰島素的改造3、基于胰島素二硫鍵增加的改造三.其它蛋白質(zhì)工程的實(shí)例干擾素（IFN）是一種廣譜抗病毒劑，并不直接殺傷或抑制病毒，而主要是通過(guò)細(xì)胞表面受體作用使細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，從而抑制病毒的復(fù)制；同時(shí)還可增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的活力，從而起到免疫調(diào)節(jié)作用。1、干擾素簡(jiǎn)介2、干擾素改造干擾素在體外保存相當(dāng)困難將干擾素分子上的一個(gè)半胱氨酸變?yōu)榻z氨酸，可保存半年。（一）、干擾素的改造（二）、單克隆抗體的改造由單一B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對(duì)某一特定抗原表位的抗體，稱為單克隆抗體。1、單克隆抗體簡(jiǎn)介2、單克隆抗體改造小鼠單克隆抗體會(huì)使人產(chǎn)生免疫反應(yīng)，導(dǎo)致治療效果降低將小鼠抗體上結(jié)合抗原的區(qū)域嫁接到人的抗體上，降低誘發(fā)免疫反應(yīng)的強(qiáng)度（三）、枯草桿菌蛋白酶的改造1、枯草桿菌蛋白酶簡(jiǎn)介2、枯草桿菌蛋白酶改造迄今為止，利用蛋白質(zhì)工程獲得的該酶的突變體已有上百種，從中可能篩選出一些符合工業(yè)化生產(chǎn)需求的突變體，從而提高這種酶的使用價(jià)值?？莶輻U菌蛋白酶催化水解蛋白質(zhì)為氨基酸,在有機(jī)溶劑中也能催化多肽的合成。這些堿性蛋白酶具有重要的應(yīng)用價(jià)值,被廣泛應(yīng)用于洗滌劑、制革及絲綢工業(yè)。產(chǎn)生這類酶的菌有地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌和南極嗜冷芽孢桿菌等。蛋白質(zhì)工程是一項(xiàng)難度很大的工程，主要是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)發(fā)揮功能必須依賴于正確的高級(jí)結(jié)構(gòu)，而這種高級(jí)結(jié)構(gòu)往往十分復(fù)雜?？茖W(xué)家要設(shè)計(jì)