銀杏MECT基因啟動子克隆及序列分析

銀杏MECT基因啟動子克隆及序列分析摘要：以前期獲得的銀杏（ＧｉｎｋｇｏｂｉｌｏｂａＬ．）ＭＥＣＴ基因的ｃＤＮＡ序列為模板，通過設(shè)計(jì)特異性引物及采用染色體步移的方法從銀杏基因組中克隆到ＧｂＭＥＣＴ翻譯起始位點(diǎn)上游９８２ｂｐ的啟動子序列，研究銀杏ＭＥＣＴ基因啟動子的結(jié)構(gòu)及功能特點(diǎn)。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，該啟動子序列中含有多種類型的順式作用元件，主要有典型的光響應(yīng)調(diào)節(jié)元件、激素響應(yīng)調(diào)控元件、抗病蟲害響應(yīng)元件ＴＧＴＣＡ序列、抗損傷應(yīng)答元件ＥＲＦ３和熱激響應(yīng)元件ＨＳＥ等。此外，在該啟動子片段中還含有氧脅迫和銅離子響應(yīng)元件、淀粉酶響應(yīng)元件等其他類型的作用元件，充分體現(xiàn)了啟動子對基因表達(dá)調(diào)控具有轉(zhuǎn)錄水平上的高效性和復(fù)雜性的特點(diǎn)。

關(guān)鍵詞 ：銀杏（ＧｉｎｋｇｏｂｉｌｏｂａＬ．）；染色體步移；２－Ｃ－甲基－Ｄ－赤蘚醇－４－磷酸胱氨酰轉(zhuǎn)移酶基因；調(diào)控元件

中圖分類號：Ｓ７９２．９５文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ文章編號：０４３９－８１１４（２０１５）０７－1746－０5

DOI:10.14088/jki.issn0439-8114.2024.07.055

在銀杏（ＧｉｎｋｇｏｂｉｌｏｂａＬ．）萜內(nèi)酯合成的ＭＥＰ途徑中，ＭＥＣＴ（２－Ｃ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｄ－ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ４－ｐｈｏｓｐｈａｔｅＣｙｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＭＥＰｃｙｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）是其第三步反應(yīng)的催化酶，催化２－Ｃ－甲基－Ｄ－赤蘚醇－４－磷酸（２－Ｃ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｄ－ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ－４－ｏｈｏｓｐｈａｔｅ，ＭＥＰ）形成４－（胞苷５－焦磷酸）－２Ｃ－甲基赤蘚糖［４－（ｃｙｔｉｄｉｎｅ５－ｄｉｐｈｏｓｐｈｏ）－２Ｃ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｄ－ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ，ＣＤＰ－ＭＥ］，并最終形成合成萜內(nèi)酯的前體物質(zhì)，因此ＭＥＣＴ是調(diào)控萜類物質(zhì)合成的一個關(guān)鍵酶。目前，已經(jīng)從銀杏（Ｇｉｎｋｇｏｂｉｌｏｂａ．Ｌ）［１］、擬南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）［２］、玉米（Ｚｅａｍａｙｓ）［３］、番茄（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）［４］、水稻（Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ）［５］、大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）［６］、火炬松（Ｐｉｎｕｓｔａｅｄａ）［７］等多種植物中克隆了ＭＥＣＴ基因。

研究發(fā)現(xiàn)，在ＤＮＡ水平上，銀杏ＭＥＣＴ基因與擬南芥和水稻ＭＥＣＴ基因相似度分別達(dá)到了７０．７％和７０．２％。盡管已從多種植物中獲得ＭＥＣＴ基因的ｃＤＮＡ序列，但目前關(guān)于該基因啟動子表達(dá)調(diào)控方面的研究報(bào)道較少，尤其缺乏對該基因啟動子的基本結(jié)構(gòu)和功能分析方面的探究，本試驗(yàn)通過染色體步移法克隆銀杏ＭＥＣＴ基因的啟動子，初步分析該啟動子所含的調(diào)節(jié)元件和作用特點(diǎn)，旨在為啟動子下一步的功能分析提供可靠依據(jù)。

１材料與方法

１．１試驗(yàn)材料

銀杏幼葉采自黃岡師范學(xué)院銀杏苗圃園，品種為家佛手１４年生實(shí)生苗。采后自封袋封裝，于－８０℃冰箱中冷凍保存。試驗(yàn)所用大腸桿菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）菌株Ｔｏｐ１０為經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

１．２試驗(yàn)試劑

各種限制性內(nèi)切酶、ＥｘＴａｑＤＮＡ聚合酶、ＰＣＲ產(chǎn)物克隆載體ｐＭＤ１８－ＴＶｅｃｔｏｒ、ｄＮＴＰ、ＤＬ２０００、Ｔ４ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ和Ｔ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ均購自大連寶生物工程有限公司；ＤＮＡ回收試劑盒為Ａｘｙｇｅｎ公司產(chǎn)品。各種寡核苷酸序列由上海生物工程有限公司合成。

１．３試驗(yàn)方法

１．３．１銀杏ＤＮＡ提取采用改良的ＣＴＡＢ法［８］大量提取銀杏基因組ＤＮＡ。

１．３．２基因組酶切與連接用平末端限制酶ＥｃｏＲⅤ、ＤｒａⅠ、ＳｓｐⅠ、ＰｖｕⅡ、ＳｔｕⅠ、ＨｐａⅠ、ＳｃａⅠ和ＳｍａⅠ分別進(jìn)行單酶切，３７℃酶切過夜（８ｈ），各?。郸蹋逃茫埃福サ沫傊请娪緳z測是否酶切完全，酶切產(chǎn)物分別純化回收；回收后與各自的接頭連接，體積為５０μＬ。連接反應(yīng)體系為ＤＮＡ酶切產(chǎn)物（模板）３０μＬ、Ｔ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅＢｕｆｆｅｒ（１０×）５μＬ、接連體１０μＬ、Ｔ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ３μＬ、ｄｄＨ２Ｏ２μＬ，反應(yīng)程序?yàn)椋保丁孢B接１２ｈ。

１．３．３引物設(shè)計(jì)及染色體步移擴(kuò)增根據(jù)Ｇｅｎｅｂａｎｋ提交的銀杏ＭＥＣＴ基因ｃＤＮＡ序列（登錄號ＤＱ１０２３６０）分別設(shè)計(jì)引物ＭＴ１、ＭＴ２（表１），與２個接頭引物ＡＰ１、ＡＰ２形成巢式引物，進(jìn)行第一次步移擴(kuò)增。將得到的目的片段連接到ｐＭＤ１８－Ｔ載體上，送出測序。根據(jù)第一次擴(kuò)增的啟動子序列，繼續(xù)設(shè)計(jì)引物ＭＴ３、ＭＴ４（表１）進(jìn)行了第二次步移并測序。

１．３．４目的片段回收、片段與載體連接、轉(zhuǎn)化及測序根據(jù)瓊脂糖電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果，采用膠回收試劑盒回收所需的目的片段。所用的Ｔ載體為ｐＭＤ１８－ＴＶｅｃｔｏｒ，之后與回收片段連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行鑒定和篩選，將含有目的基因重組子的菌株送去測序。

１．３．５生物信息學(xué)分析用ＤＮＡＭＡＮ等生物學(xué)軟件對序列進(jìn)行處理，然后將測序獲得的啟動子序列提交至ＰＬＡＣＥ（ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ/ＰＬＡＣＥ/）進(jìn)行在線分析，預(yù)測啟動子序列保守區(qū)域中潛在的順式作用元件。通過ＭｃＰｒｏｍｏｔｅ在線工具預(yù)測其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。

２結(jié)果與分析

２．１銀杏ＭＥＣＴ基因啟動子序列克隆及驗(yàn)證

將銀杏基因組用８個平末端限制性內(nèi)切酶（ＥｃｏＲⅤ、ＤｒａⅠ、ＳｓｐⅠ、ＰｖｕⅡ、ＳｔｕⅠ、ＨｐａⅠ、ＳｃａⅠ和ＳｍａⅠ）分別進(jìn)行消化，酶切產(chǎn)物加上接頭后作為模板與其特異性引物進(jìn)行步移擴(kuò)增，經(jīng)２輪ＰＣＲ后，電泳檢測結(jié)果如圖１所示，在ＳｃａⅠ的酶切體系中得到了５００ｂｐ左右的ＰＣＲ產(chǎn)物，將產(chǎn)物回收并測序。在第一次步移得到的上游啟動子序列（圖１Ａ）的５′端設(shè)計(jì)兩個下游引物，繼續(xù)進(jìn)行第二次步移擴(kuò)增，圖１Ｂ即為第二次擴(kuò)增結(jié)果。將２次步移的產(chǎn)物在ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ軟件中進(jìn)行序列拼接比對，得到了長９８２ｂｐ的目的片段，通過分析比較證實(shí)該片段３′端序列與ＭＥＣＴ基因ｃＤＮＡ序列的５′端部分片段重合一致，說明獲得的序列為銀杏ＭＥＣＴ基因上游啟動子的部分片段。

２．２銀杏ＭＥＣＴ基因啟動子區(qū)域序列的生物信息學(xué)分析

銀杏ＭＥＣＴ基因啟動子序列如圖２所示，通過ＭｃＰｒｏｍｏｔｅ預(yù)測其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)可能為位于９８２ｂｐ處的堿基Ａ，將此位點(diǎn)標(biāo)記為＋１。ＴＡＴＡ-ｂｏｘ位于上游－１０６ｂｐ處，ＣＡＡＴ-ｂｏｘ位于－１５０ｂｐ處，該啟動子序列上含有多種對光照、干旱、傷害、金屬離子和細(xì)胞周期誘導(dǎo)響應(yīng)的啟動子元件，也含有一些組織特異性啟動子元件，依據(jù)ＰＬＡＣＥｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ＰＬＡＣＥ／）分析結(jié)果已將部分作用元件在圖示中做了標(biāo)記。

２．２．１光調(diào)控元件分析發(fā)現(xiàn)銀杏ＭＥＣＴ啟動子序列含有多個與光調(diào)節(jié)相關(guān)的調(diào)控元件，如ＧＡＴＡ－ｂｏｘ（ＧＡＴＡ）、ＧＴ－１（ＧＲＷＡＡＷ）等，ＧＴ－１存在于許多光調(diào)節(jié)基因中，是ＧＴ－１轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的保守位點(diǎn)；另有Ｉｎｒｅｌｅｍｅｎｔ（ＹＴＣＡＮＴＹＹ）、ＡＳＦ１（ＴＧＡＣＧ）及Ｉ－ｂｏｘ（ＧＡＴＡＡ）等均是與光響應(yīng)有關(guān)的順式元件（表２）。

２．２．２抗逆境脅迫及與激素響應(yīng)相關(guān)的調(diào)控元件從預(yù)測結(jié)果分析來看，有些啟動子元件既能響應(yīng)逆境脅迫同時(shí)也與激素調(diào)節(jié)有關(guān)，說明逆境脅迫與激素調(diào)節(jié)存在一定的交叉作用，兩者互相關(guān)聯(lián)，體現(xiàn)了啟動子作用元件之間的互作性和復(fù)雜性。表３中有大量響應(yīng)激素調(diào)節(jié)的順式元件，與細(xì)胞分裂素相關(guān)的ＡＲＲ１（ＮＧＡＴＴ）８個，ＣＰＢＣＳＰＯＲ（ＴＡＴＴＡＧ）３個，是依賴細(xì)胞分裂素的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)；與脫落酸響應(yīng)相關(guān)的元件有ＭＹＣ（ＣＡＮＮＴＧ）和ＭＹＢ１ＡＴ（ＷＡＡＣＣＡ）２種，其中ＭＹＣ元件有６個；該序列中響應(yīng)赤霉素的順式元件較多，其中ＷＲＫＹ（ＴＧＡＣ）是一種赤霉素信號途徑的轉(zhuǎn)錄抑制子，此類型的調(diào)節(jié)元件共６個，此外還有ＴＡＴＣＣＡ序列、ＣＡＲＥｓ（ＣＡＡＣＴＣ）、ＧＡＲＥ（ＴＡＡＣＡＧＡ）和ＧＡ（ＴＡＡＣＡＡＲ）；另有２種與生長素作用相關(guān)的元件ＡＳＦ－１（ＴＧＡＣＧ）、ＣＡＴＡＴＧ序列；與乙烯作用相關(guān)的元件僅有１種ＡＣＳ（ＴＡＡＡＡＴＡＴ）。響應(yīng)逆境脅迫的元件有：抗病蟲害響應(yīng)元件ＴＧＴＣＡ、抗損傷元件ＥＲＦ３（ＴＧＡＣＹ）、熱激響應(yīng)元件ＨＳＥ（ＣＣＡＡＴ）及防衛(wèi)基因的誘導(dǎo)元件Ｗ－ｂｏｘ（ＣＴＧＡＣＹ）。

２．２．３其他類型調(diào)控元件除對光、激素及逆境脅迫相關(guān)的元件外，銀杏ＭＥＣＴ啟動子序列中還存在以下特異性元件：根組織特異性元件ｒｏｌＤ（ＡＴＡＴＴ）、與苯丙氨酸和木質(zhì)素代謝相關(guān)的元件ＭＹＢＰＬＡＮＴ（ＭＡＣＣＷＡＭＣ）、受糖抑制作用的元件ＳＲＥ（ＴＴＡＴＣＣ）、氧脅迫和銅離子響應(yīng)元件ＣｕＲＥ（ＧＴＡＣ）、淀粉酶響應(yīng)元件ａｍｙｌａｓｅ－ｂｏｘ（ＴＡＴＣＣＡＴ）等，詳見表４。

３小結(jié)與討論

本試驗(yàn)通過設(shè)計(jì)特異性引物，采用染色體步移的方法克隆了ＭＥＣＴ基因翻譯起始位點(diǎn)上游９８２ｂｐ的啟動子序列，對其調(diào)控區(qū)域進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。分析結(jié)果表明，銀杏ＭＥＣＴ基因啟動子中含有光響應(yīng)元件ＧＡＴＡ－ｂｏｘ（ＧＡＴＡ）、ＧＴ－１（ＧＲＷＡＡＷ）及Ｉ－ｂｏｘ（ＧＡＴＡＡ）等，其中ＧＡＴＡ－ｂｏｘ（ＧＡＴＡ）是捕光葉綠素ａ／ｂ蛋白復(fù)合體基因（ｃａｂ）中大量存在的光應(yīng)答元件，ｃａｂ即是典型的光依賴型基因。通常ＧＡＴＡ－ｂｏｘ（ＧＡＴＡ）作為一種光開關(guān)（Ｌｉｇｈｔｓｗｉｔｃｈｅｓ）存在于植物基因啟動子中。ＧＴ－１（ＧＲＷＡＡＷ）存在于某些光誘導(dǎo)啟動子中，但也可在不顯示光效應(yīng)的啟動子中存在，并且在某些光誘導(dǎo)啟動子中，ＧＴ－１缺失也不會完全喪失光調(diào)節(jié)特性。因此，ＧＴ－１在光調(diào)節(jié)表達(dá)中可能不是必需的。Ｉ－ｂｏｘ是光調(diào)節(jié)所必需的調(diào)控元件，若缺失或突變都會導(dǎo)致啟動子光誘導(dǎo)能力下降，在水稻Ｏｓｒｂｃｓ［９］、番茄ＰＳＹ［１０］、豌豆ｒｂｃＳ［１１］等基因啟動子中都存在。

在銀杏ＭＥＣＴ基因啟動子中還含有各種激素響應(yīng)元件，與細(xì)胞分裂素相關(guān)的ＡＲＲ１（ＮＧＡＴＴ）元件在作用過程中能與轉(zhuǎn)錄因子ＡＲＲ１結(jié)合，是植物對細(xì)胞分裂素的應(yīng)答調(diào)節(jié)因子［１２］。脫落酸響應(yīng)相關(guān)的元件ＭＹＣ（ＣＡＮＮＴＧ）、ＭＹＢ１ＡＴ（ＷＡＡＣＣＡ）也與逆境脅迫誘導(dǎo)相關(guān)，推測當(dāng)植物處于脫水、干旱等逆境脅迫條件時(shí)，ＭＹＢ、ＭＹＣ可作為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，以某種方式促進(jìn)脫落酸等植物內(nèi)源激素合成，通過落葉、促進(jìn)休眠等方式減少養(yǎng)分和水分消耗，以起到抗脅迫作用，維持植物正常生命活動。由此發(fā)現(xiàn)，許多響應(yīng)逆境脅迫的元件同時(shí)也是某些激素的響應(yīng)元件，如ＡＳＦ－１（ＴＧＡＣＧ）既是生長素的應(yīng)答元件同時(shí)也是一種抗病害的響應(yīng)元件。該啟動子中還含有熱激響應(yīng)元件ＨＳＥ（ＣＣＡＡＴ），這類熱誘導(dǎo)啟動子對刺激產(chǎn)生響應(yīng)的延遲時(shí)間短、活性強(qiáng)，一般能快速對高溫脅迫作出反應(yīng)［１３］。

由序列分析的預(yù)測結(jié)果可知，在銀杏ＭＥＣＴ基因啟動子序列中含有許多重要的順式作用元件。通過分析各種類型元件的作用特點(diǎn)，可以了解影響其作用的因素，從而對萜內(nèi)酯合成的影響因素做出初步判定，為后面啟動子的功能分析提供有效信息。

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