葡聚糖的檢驗與臨床

關(guān)于葡聚糖的檢驗與臨床12AIDS插管等侵襲性治療腫瘤和免疫抑制治療骨髓和實體器官移植廣譜抗生素治療

侵襲性真菌感染率上升—第2頁,共57頁，星期六，2024年，5月3嚴(yán)重真菌感染迅速上升勢頭

危重病人的存活期延長延長了真菌感染的高危期使此類患者業(yè)已增加的人數(shù)進(jìn)一步擴大醫(yī)學(xué)和相關(guān)科學(xué)的進(jìn)步是日益嚴(yán)重的威脅！第3頁,共57頁，星期六，2024年，5月4真菌感染的危險因素：中心靜脈插管 尿道插管廣譜抗生素氣管插管腹部外科腸胃外營養(yǎng)營養(yǎng)不良住院時間感染之前定殖第4頁,共57頁，星期六，2024年，5月5侵襲性真菌感染條件致病性真菌念珠菌病曲霉病隱球菌病其他第5頁,共57頁，星期六，2024年，5月6診斷方法影像學(xué)組織病理學(xué)/細(xì)胞學(xué)培養(yǎng)血清學(xué)分子生物學(xué)方法：

PlateliaAspergillusELISAFungitellassayPCR（unavailable）傳統(tǒng)的方法第6頁,共57頁，星期六，2024年，5月7真菌病實驗室診斷主要內(nèi)容準(zhǔn)確、快速檢出真菌病原體真菌鏡檢真菌培養(yǎng)組織病理生理生化血清學(xué)方法分子生物學(xué)第7頁,共57頁，星期六，2024年，5月8鏡檢和培養(yǎng)方法敏感性低

血培養(yǎng)：在腫瘤和血液病病人中，50%尸檢證實深部念珠菌感染的病例血培養(yǎng)陰性。培養(yǎng)結(jié)果陽性僅表示存在某種真菌，區(qū)分定植和感染困難培養(yǎng)時間長有些標(biāo)本采集困難第8頁,共57頁，星期六，2024年，5月9非培養(yǎng)方法優(yōu)點快速報告結(jié)果敏感性提高取材簡便多以真菌在致病狀態(tài)產(chǎn)生的物質(zhì)為檢測標(biāo)志物，結(jié)果陽性提示有致病性定量檢測可判斷感染嚴(yán)重程度及療效評估第9頁,共57頁，星期六，2024年，5月10非培養(yǎng)診斷的方法簡介真菌細(xì)胞壁成分（1-3）-β-

D-葡聚糖檢測（G試驗）

真菌抗原檢查半乳甘露聚糖（galactomannan)抗原（GM)

甘露聚糖(mannan)抗原真菌特異的代謝產(chǎn)物D-阿拉伯糖醇真菌DNA的檢測第10頁,共57頁，星期六，2024年，5月11臨床診斷、擬診的微生物學(xué)1合格痰標(biāo)本直接鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲，且連續(xù)培養(yǎng)≥2次分離到同種真菌2BALF經(jīng)直接鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲真菌培養(yǎng)陽性3痰液或BALF直接鏡檢發(fā)現(xiàn)新生隱球菌4乳膠凝集法檢測隱球菌莢膜多糖抗原陽性5G實驗連續(xù)兩次陽性6GM實驗連續(xù)兩次陽性第11頁,共57頁，星期六，2024年，5月12侵襲性真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)

EORTC/MSG2008修訂版宿主因素臨床特征病原學(xué)真菌鏡檢真菌培養(yǎng)組織病理學(xué)檢查血清學(xué)檢查方法（間接證據(jù)）CSF隱球菌抗原陽性——確診GM-test,G-test——臨床診斷ClinicalInfectiousDiseases2008;46第12頁,共57頁，星期六，2024年，5月13（1,3）-β-

D-葡聚糖檢測第13頁,共57頁，星期六，2024年，5月14b1,6葡聚糖

磷脂雙分子層幾丁質(zhì)麥角固醇b1,3葡聚糖合成酶mannoproteinsβ1,3真菌細(xì)胞膜、壁結(jié)構(gòu)羊毛固醇C－14去甲基化酶14位還原和7－8位異構(gòu)酶角鯊烯環(huán)氧化酶第14頁,共57頁，星期六，2024年，5月151,3-β-D-葡聚糖結(jié)構(gòu)葡聚糖廣泛存在于真菌細(xì)胞壁中1,3-β-D-葡聚糖占真菌壁成分50%以上，是真菌細(xì)胞壁上的特有成分以1,3-β-糖苷鍵連接的葡萄糖殘基骨架作為主鏈以分支狀1-6-β-D葡萄糖殘基作為側(cè)鏈第15頁,共57頁，星期六，2024年，5月161,3-β-D-葡聚糖特性對熱極為穩(wěn)定，高壓121℃并不能使其滅活。在念珠菌和曲霉菌細(xì)胞壁中含量較多，對G實驗靈敏。當(dāng)真菌進(jìn)入人體血液或深部組織后，經(jīng)吞噬細(xì)胞的吞噬、消化等處理后，(1-3)-β-D-葡聚糖可從胞壁中釋放出來，從而使血液及其它體液中含量增高。當(dāng)真菌在體內(nèi)含量減少時，機體免疫系統(tǒng)可將其清除。在淺部真菌感染中，(1-3)-β-D-葡聚糖未被釋放出來，故其在體液中的量不增高?？捎糜跈z測念珠菌、毛孢子菌、曲霉菌、鐮刀菌、卡氏肺孢子菌不可檢測隱球菌、接合菌（根霉/毛霉等）第16頁,共57頁，星期六，2024年，5月17“G”試驗緣何而來？第17頁,共57頁，星期六，2024年，5月18比濁法反應(yīng)機理

細(xì)菌內(nèi)毒素 （1-3）

-D-Glucan LAL-RM(反應(yīng)物)因子C 活化因子C

因子B 活化因子B活化因子G

因子G

凝固酶原 凝固酶

凝固蛋白原 凝固蛋白（凝膠）定量濁度儀 TurbidimetrictechniqueGEL第18頁,共57頁，星期六，2024年，5月19分析前注意事項采用無菌無熱原真空采血管抽血后4h內(nèi)送檢血標(biāo)本4-8℃最多存放48h檢測環(huán)境應(yīng)保持清潔第19頁,共57頁，星期六，2024年，5月201,3-β-D-葡聚糖相關(guān)影響因素以下情況可出現(xiàn)假陽性：使用纖維素膜進(jìn)行血透，標(biāo)本或患者暴露于紗布或其他含有葡聚糖的材料；靜脈輸注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血液制品；鏈球菌血癥；操作者處理標(biāo)本時存在污染；使用多糖類抗癌藥物、放化療造成的粘膜損傷導(dǎo)致食物中的葡聚糖或定植的念珠菌經(jīng)胃腸道進(jìn)入血液等也可能造成假陽性。第20頁,共57頁，星期六，2024年，5月211,3-β-D-葡聚糖檢測臨床價值早期診斷：侵襲性真菌感染增多且復(fù)雜，早期癥狀無特異性，往往被原發(fā)病掩蓋，病程長，發(fā)現(xiàn)較晚，死亡率高。因此對深部真菌感染治療成敗的關(guān)鍵在于早期診斷。指導(dǎo)用藥：快速確定真菌感染后，選擇好治療方案,有針對性使用抗真菌類藥物。為臨床選用副作用小，療效高，價格適宜的藥物提供準(zhǔn)確的依據(jù)。評價效果：應(yīng)用抗真菌藥物后，定期檢測血漿中葡聚糖濃度變化，評價選用藥物的有效性。監(jiān)護病程：監(jiān)護深部真菌感染易感人群的病發(fā)狀態(tài)。動態(tài)觀察：易感人群，監(jiān)測臨床療效。第21頁,共57頁，星期六，2024年，5月22曲霉菌半乳甘露聚糖（GM）Figure1-10Noncompetitivesandwichmethodofimmunoassay第22頁,共57頁，星期六，2024年，5月23中性粒細(xì)胞減少癥患者40例（發(fā)展為曲霉菌病的高危人群）該研究選擇1,3-β-D-葡聚糖（BG）和半乳甘露聚糖（GM）兩個指標(biāo)用于監(jiān)測中性粒細(xì)胞減少性成人曲霉菌病患者BG和GM兩項指標(biāo)均可用于指導(dǎo)臨床診斷和治療真菌性疾病,但BG可早于GM升高.BG和GM聯(lián)合檢測用于曲霉菌病的診療,其特異性和陽性率均為100%.例1CarmenPazos,JosePonton,etc.JOURNALOFCLINICALMICROBIOLOGY,Jan.2005結(jié)論：

BG和GM聯(lián)合檢測有助于臨床鑒定血液病患者是否合并真菌感染,并將單一試驗假陽性給診療帶來的影響降低到最小.1,3-β-D-葡聚糖與循環(huán)半乳甘露聚糖的檢測比較：用于治療和監(jiān)測中性粒細(xì)胞減少性成人曲霉菌病

第23頁,共57頁，星期六，2024年，5月24不同患者BG(●)andGM(?)體液變化情況侵襲性曲霉菌病合并急性髓樣白血病患者給予兩性霉素B和卡泊芬凈用藥治療過程中BG和GM變化情況第24頁,共57頁，星期六，2024年，5月25(b)侵襲性曲霉病合并慢性淋巴細(xì)胞白血病患者未使用兩性霉素B治療BG(●)和GM(?)變化情況第25頁,共57頁，星期六，2024年，5月26(c)多發(fā)性骨髓瘤患者(非侵襲性曲霉病)BG結(jié)果假陽性BG(●)和GM(?)第26頁,共57頁，星期六，2024年，5月27(d)Hodgkin’s淋巴瘤(非侵襲性曲霉病)患者GM結(jié)果假陽性BG(●)和GM(?)第27頁,共57頁，星期六，2024年，5月28(e)急性髓樣白血病患者(非侵襲性曲霉病)白色念珠菌和光滑念珠菌培養(yǎng)陽性

BG和GM結(jié)果假陰性BG(●)和GM(?)第28頁,共57頁，星期六，2024年，5月29(f)慢性淋巴細(xì)胞白血病患者(非侵襲性曲霉病)白色念珠菌培養(yǎng)陽性

BG和GM結(jié)果陰性BG(●)和GM(?)第29頁,共57頁，星期六，2024年，5月30120名兒童7月—8歲1,3-β-D-葡聚糖定量檢測結(jié)果：中位數(shù)32pg/ml平均值68±128pg/ml

高值5例

12歲348pg/ml2歲374pg/ml14歲491pg/ml13歲754pg/ml14歲947pg/ml

94例(78%)

<60pg/ml

8例(7%)

60-79pg/ml

18例(15%)

>180pg/ml例2P.BrianSmith,DanielK.Benjamin,Jr,etc.CLINICALANDVACCINEIMMUNOLOGY,July2007結(jié)論研究數(shù)據(jù)顯示,健康兒童的1,3-β-D-葡聚糖水平高于健康成人.該指標(biāo)用于兒童感染性疾病的診斷應(yīng)慎重,1,3-β-D-葡聚糖在兒童群體的正常值區(qū)間有待進(jìn)一步研究.兒童1,3-β-D-葡聚糖水平研究第30頁,共57頁，星期六，2024年，5月31非免疫功能低下兒童1,3-β-D-葡聚糖水平第31頁,共57頁，星期六，2024年，5月32收集患者82例侵襲性真菌感染組22例其他真菌感染組鐮刀菌/接合菌/絲孢菌感染17例

念珠菌感染23例對照組(血液腫瘤患者非真菌感染)20例414份血清標(biāo)本檢測GM409份血清標(biāo)本檢測BG侵襲性曲霉菌病患者在留取血清標(biāo)本前已接受抗真菌藥物治療

(包括聚烯類、氮雜茂類、棘球白素類等)半乳甘露聚糖和1,3-β-D-葡聚糖用于診斷血液腫瘤患者煙曲霉菌感染敏感性較低R.Y.Hachem,D.P.Kontoyiannis,etc.JOURNALOFCLINICALMICROBIOLOGY,Jan.2009結(jié)論對于血液腫瘤患者合并侵襲性真菌感染的診斷,BG的敏感度優(yōu)于GM.例3第32頁,共57頁，星期六，2024年，5月33侵襲性真菌感染或者GM和BG檢測結(jié)果比較第33頁,共57頁，星期六，2024年，5月34例41,3-β-D-葡聚糖和抗白色念珠菌細(xì)胞壁抗原的IgG亞型抗體用于系統(tǒng)性念珠菌感染診療系統(tǒng)性念珠菌病患者IgG亞型體液水平升高

抗細(xì)胞壁碎片IgG1抗體(IgG1-CW)

抗磷酸肽甘露聚糖片段IgG2抗體(IgG2-PPM)系統(tǒng)性念珠菌病患者IgG1-CW/IgG2-PPM比值升高結(jié)論1,3-β-D-葡聚糖以及IgG1-CW、IgG2-PPM可用于早期診斷系統(tǒng)性念珠菌病.1,3-β-D-葡聚糖與IgG亞型相結(jié)合檢測可提高陽性預(yù)測值，有效指導(dǎo)早期抗真菌藥物治療.N.Kondori,L.Edebo,etc.CLINICALANDDIAGNOSTICLABORATORYIMMUNOLOGY,Mar.2004第34頁,共57頁，星期六，2024年，5月35念珠菌感染患者14例1,3-β-D-葡聚糖結(jié)果陽性系統(tǒng)性念珠菌病患者14例1,3-β-D-葡聚糖檢測結(jié)果均大于20pg/ml第35頁,共57頁，星期六，2024年，5月36血漿1,3-β-D葡聚糖檢測對血液病患者侵襲性真菌感染的診斷價值本研究收集疑為IFI的血液病患者血漿標(biāo)本162例,其中化療后患者85例,造血干細(xì)胞移植后患者77例。按照歐洲癌癥研究治療組織及真菌研究組(EORTC/MSG)診斷標(biāo)準(zhǔn),所有病例中有確定診斷2例,臨床診斷18例,擬診75例,排除診斷67例。結(jié)果表明:以20ng/ml為診斷界值,G試驗的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值(PPV)和陰性預(yù)測值(NPV)分別為75%、91%、72.4%和92.4%。在75例擬診病例中,其中有51例G試驗陽性,且對廣譜抗生素?zé)o效而經(jīng)過抗真菌治療有效,經(jīng)過臨床回顧性分析符合IFI,表明G試驗使IFI診斷率提高31.4%。例5劉芳,吳彤,等.中國實驗血液學(xué)雜志JournalofExperimentalHematology2009第36頁,共57頁，星期六，2024年，5月37G試驗對IFI診斷率的影響在所有162例患者中,若無G試驗作為診斷標(biāo)準(zhǔn),僅20例患者達(dá)到確診+臨床診斷真菌感染標(biāo)準(zhǔn),占總病例數(shù)12.3%。若將G試驗陽性作為微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn),則有71例達(dá)確診+臨床診斷標(biāo)準(zhǔn),占總病例數(shù)的43.8%。在75例擬診病例中,其中51例真菌培養(yǎng)陰性而G試驗陽性的患者,均對廣譜抗生素?zé)o效而經(jīng)過抗真菌治療病情好轉(zhuǎn),經(jīng)過臨床回顧性分析符合IFI,故G試驗使IFI診斷率提高了31.4%。第37頁,共57頁，星期六，2024年，5月38血漿1,3-β-D葡聚糖對深部真菌感染診斷的研究例6趙勇,王紅,等.中國真菌學(xué)雜志2007年8月第2卷第4期該研究共留取用于檢測血漿葡聚糖的標(biāo)本182份,其中來自確診病例和高度疑似病例(真陽性)共18份,其余為可能感染病例(18份)和無深部真菌感染病例(146份,真陰性)。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果提示血漿葡聚糖水平對深部真菌感染診斷的準(zhǔn)確性優(yōu)于單純依靠各種標(biāo)本真菌培養(yǎng)或真菌涂片是否陽性對深部真菌感染的判斷。用于診斷深部真菌感染各指標(biāo)ROC曲線下面積第38頁,共57頁，星期六，2024年，5月39血清1,3-β-D-葡聚糖檢測在念珠菌菌血癥診斷中的價值例7對2007年1月至2009年4月的25例念珠菌菌血癥患者、60例細(xì)菌菌血癥患者、25例念珠菌口咽定植者、20例健康體檢者的血清1,3-β-D-葡聚糖含量進(jìn)行比較分析。念珠菌菌血癥組的血清1,3-β-D-葡聚糖含量為115.2±42.3ng/L,明顯高于其他各組,其他各組間的血清1,3-β-D-葡聚糖含量無顯著差異。結(jié)論:血清1,3-β-D-葡聚糖的檢測是診斷念珠菌菌血癥的有效指標(biāo)。四組間比較:F=119.493,P<0101;細(xì)菌菌血癥組、念珠菌口咽定植組、健康對照組三組間的比較:F=3104,P>0.105;念珠菌菌血癥組與細(xì)菌菌血癥組、念珠菌口咽定植組、健康體檢組的兩兩比較:P值均<0.01;細(xì)菌菌血癥組Vs念珠菌口咽定植組、細(xì)菌菌血癥組Vs健康對照組、念珠菌口咽定植組Vs健康對照組的兩兩比較:P值均>0.05.劉英其.中國衛(wèi)生檢驗雜志2009年9月第19卷第9期第39頁,共57頁，星期六，2024年，5月40血漿1,3-β-D-葡聚糖與抗深部白色念珠菌感染藥物療效關(guān)系的實驗研究例8李世榮,王紅,等.臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志2007年第6卷第6期本文采用110只小鼠隨機分成3組,空白對照組、模型組、氟康唑組,建立深部白色念珠菌感染的動物模型。定量檢測血漿中1,3-β-D-葡聚糖的含量,雙腎組織勻漿液培養(yǎng)計數(shù)菌落數(shù)。用于探討深部真菌感染小鼠血漿1,3-β-D-葡聚糖水平與抗真菌藥物療效的關(guān)系。各處理組不同時間點血漿1,3-β-D-葡聚糖的比較治療前模型組血漿(1→3)-β-D-葡聚糖水平明顯高于空白對照組,說明血漿1,3-β-D-葡聚糖水平異常升高可以反映深部真菌感染的存在。氟康唑組血漿1,3-β-D-葡聚糖水平隨著治療逐漸減低,從治療第5天開始與模型組相比,血漿1,3-β-D-葡聚糖水平差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),說明血漿(1→3)-β-D-葡聚糖水平與氟康唑的治療呈量效關(guān)系。第40頁,共57頁，星期六，2024年，5月41大鼠感染曲霉菌后1,3-β-D-葡聚糖水平變化該研究目的在于建立患侵襲性肺曲霉菌病動物模型,監(jiān)測其血清1,3-β-D-葡聚糖濃度變化,評價抗真菌感染療效.結(jié)論1,3-β-D-葡聚糖可用于早期檢測侵襲性肺曲霉菌病和評價抗真菌藥物療效NathanP.Wiederhold,LauraK.Najvar,etc.ANTIMICROBIALAGENTSANDCHEMOTHERAPY,Mar.2008例9大鼠感染曲霉菌后第三天1,3-β-D-葡聚糖水平明顯升高,49.2pg/ml→609pg/ml第41頁,共57頁，星期六，2024年，5月42卡氏肺孢子蟲肺炎血清學(xué)標(biāo)志物卡氏肺孢子蟲肺炎(Pneumocystispneumonia,PCP)

當(dāng)宿主防御機能受損時易引起疾病,最常見的是血液系統(tǒng)惡性疾病,淋巴增生性疾病,腫瘤化療和艾滋病等引起的細(xì)胞免疫缺乏.PCP因沒有特異性診斷指標(biāo)和明顯臨床癥狀較難治療,通常多藥物聯(lián)合治療,常引發(fā)多器官感染.該研究收集患者57例標(biāo)本—支氣管肺泡灌洗液BAL

檢測項目：

乳酸脫氫酶LDH(肺部感染炎癥指標(biāo))1,3-β-D-葡聚糖BG(真菌感染標(biāo)志物)KL-6(間質(zhì)性肺炎標(biāo)志物)結(jié)論1,3-β-D-葡聚糖為診斷PCP的最佳指標(biāo).LDH與氧分壓相結(jié)合適用于反映肺部組織損害程度.對于嚴(yán)重呼吸衰竭患者,BAL的1,3-β-D-葡聚糖水平能準(zhǔn)確反映患者病情.SadatomoTasaka,NaokiHasegawa,etc.Chest2007例10第42頁,共57頁，星期六，2024年，5月43PCP組與非PCP組LDH/BG/KL-6水平比較第43頁,共57頁，星期六，2024年，5月44第44頁,共57頁，星期六，2024年，5月45第45頁,共57頁，星期六，2024年，5月46各項目ROC曲線下面積為：

BG0.935KL-60.730LDH0.7041,3-β-D-葡聚糖的ROC曲線下面積明顯高于其他兩個指標(biāo)

(p<0.01)提示1,3-β-D-葡聚糖為診斷卡氏肺孢子蟲肺炎(PCP)的最佳指標(biāo)BG、LDH和KL-6ROC曲線第46頁,共57頁，星期六，2024年，5月471,3-β-D-葡聚糖和白色念珠菌芽管抗體用于診斷和治療成人中性粒細(xì)胞減少性念珠菌病檢測白念珠菌芽管抗體(CAGT)在系統(tǒng)性白念珠菌感染診斷中具有一定的診斷意義結(jié)論BG和CAGT聯(lián)合檢測利于血液病患者合并真菌感染的檢測兩試驗相結(jié)合可降低單一試驗的假陽性率CarmenPazos,María-DoloresMoragues,etc.RevIberoamMicol2006例11第47頁,共57頁，星期六，2024年，5月48不同患者BG(●)and抗CAGT(■)抗體動態(tài)變化情況侵襲性念珠菌病患者合并急性髓樣白血病使用兩性霉素B治療后BG和CAGT變化情況第48頁,共57頁，星期六，2024年，5月49(b)疑似侵襲性念珠菌病患者合并慢性淋巴細(xì)胞白血病未使用兩性霉素B治療BG和CAGT滴度變化情況BG(●)and抗CAGT(■)第49頁,共57頁，星期六，2024年，5月50(c)多發(fā)性骨髓瘤(非念珠菌感染)患者BG結(jié)果假陽性

BG(●)and抗CAGT(■)第50頁,共57頁，星期六，2024年，5月51(d)非Hodgkin’s淋巴瘤(非念珠菌感染)患者CAGT結(jié)果假陽性

BG(●)and抗CAGT(■)第51頁,共57頁，星期六，2024年，5月52天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院病例1患者A，女性，82歲。病史：2009年8月31日外傷后，面部、左上肢疼痛、伴大小便失禁5天入院，于干部保健科接受治療。NovDec送檢血培養(yǎng)(需氧+厭氧)需氧瓶報陽為季也蒙假絲酵母菌無厭氧菌生長再次送檢血培養(yǎng)結(jié)果同21日G試驗檢測:682.6pg/ml請感染科會診:診斷為真菌血癥且不除外真菌敗血癥給予科塞斯50mg靜滴因患者體弱給予輸入乳糜營養(yǎng)液數(shù)天科塞斯已用11天給予輸血漿200ml改變膠體滲透壓G試驗檢測:876.7pg/ml第52頁,共57頁，星期六，2024年，5月53病例1治療過程11月21日送檢血培養(yǎng)(需氧+厭氧)

需氧瓶報陽為季也蒙假絲酵母菌無厭氧菌生長11月23日再次送檢血培養(yǎng)(需氧+厭氧)

結(jié)果同上11月24日送檢G試驗報告結(jié)果為682.6pg/ml11月26日請感染科會診：患者為真菌血癥目前不除外真菌敗血癥給予科塞斯50