第4章 抗體制藥(三)課件

第六節(jié)抗體診斷試劑抗體診斷的理論基礎(chǔ)是抗體與抗原之間的特異性反應(yīng)。在體內(nèi)可表現(xiàn)為溶菌、殺菌、促進(jìn)吞噬和中和毒素等作用。在血清學(xué)檢驗(yàn)中，表現(xiàn)為凝聚。第4章抗體制藥(三)免疫學(xué)的迅速發(fā)展使診斷技術(shù)不斷更新，抗體用于診斷，體現(xiàn)在三類(lèi)診斷藥物中：①血清學(xué)診斷中使用的抗體制劑(體外診斷)②免疫標(biāo)記用的抗體制劑(體外診斷)③體內(nèi)導(dǎo)向診斷的抗體藥物(體內(nèi)診斷)第4章抗體制藥(三)血清學(xué)鑒定是指用已知抗體來(lái)鑒定未知的抗原型，主要用于疾病的病原菌診斷和血型鑒定。常用的方法是凝集。優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單快速，應(yīng)用廣泛，普及至基層。第六節(jié)抗體診斷試劑

一、血清學(xué)鑒定用的抗體試劑第4章抗體制藥(三)（1）常用診斷血清的品種和用途

診斷病原菌或相關(guān)抗原的試劑包括各種診斷血清、分群血清、分型血清、因子血清等。（2）診斷血清的制備：用病菌抗原免疫動(dòng)物，采血、離心分離得到血清。（3）診斷方法：直接凝集反應(yīng)，常用玻片做定性試驗(yàn)，簡(jiǎn)便快速。第六節(jié)抗體診斷試劑

一、血清學(xué)鑒定用的抗體試劑

1.鑒定病原菌的抗體試劑（診斷血清）第4章抗體制藥(三)第4章抗體制藥(三)第六節(jié)抗體診斷試劑

一、血清學(xué)鑒定用的抗體試劑

2.乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的反向被動(dòng)血凝診斷試劑用純化的抗體致敏醛化血細(xì)胞測(cè)定相應(yīng)抗原，稱(chēng)為反向被動(dòng)血凝試驗(yàn)(RPHA)。（1）診斷試劑的制備：用HBsAg免疫豚鼠，獲得抗HBs血清，實(shí)質(zhì)是含HBsAg抗體（HBsAb）的血清；甲醛處理紅細(xì)胞，與抗HBs血清混合，紅細(xì)胞大量吸附血清中的包括HBsAb在內(nèi)的蛋白。待測(cè)樣品中有HBsAg時(shí)，發(fā)生凝聚。（2）RPHA法測(cè)定HBsAg通常在V型血凝板上進(jìn)行，操作時(shí)應(yīng)附有陰性、陽(yáng)性和空白對(duì)照。第4章抗體制藥(三)第六節(jié)抗體診斷試劑

一、血清學(xué)鑒定用的抗體試劑

3.妊娠診斷試劑孕期三個(gè)月的婦女血液和尿液中的人絨毛膜促性腺激素(humanchorionicgonadotrophin,HCG)處于高峰值。測(cè)定體液中HGG的方法常用生物試驗(yàn)法、膠乳間接凝集試驗(yàn)法、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法和放射免疫測(cè)定法等。（1）用膠乳試劑測(cè)定HGG：①間接凝集法（不發(fā)生凝集為陽(yáng)性結(jié)果）；②直接凝集法（發(fā)生凝集為陽(yáng)性結(jié)果）（2）膠乳的致敏方法：①物理吸附法；②化學(xué)交聯(lián)法。第4章抗體制藥(三)第六節(jié)抗體診斷試劑

一、血清學(xué)鑒定用的抗體試劑

4.抗ABO血型系統(tǒng)血清血型有多個(gè)系統(tǒng)，其中最重要的是ABO血型系統(tǒng)，按人紅細(xì)胞表面帶有的A或B種凝集原來(lái)分型。第4章抗體制藥(三)為了提高診斷的靈敏度，用放射性同位素、熒光素或酶對(duì)抗體做標(biāo)記，放大抗體—抗原反應(yīng)的表象，是免疫標(biāo)記診斷的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。結(jié)合顯微鏡或電子顯微鏡技術(shù)，還能對(duì)抗原物質(zhì)作出組織內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)的定位測(cè)定，除了診斷外，還能為探討發(fā)病機(jī)制提供有力的研究手段。第六節(jié)抗體診斷試劑

二、免疫標(biāo)記用的抗體試劑第4章抗體制藥(三)（一）熒光抗體診斷試劑免疫熒光技術(shù)：用異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)、羅丹明(Rhodamine)或藻紅素等熒光色素標(biāo)記抗體，直接向組織切片或細(xì)胞懸液滴染，在熒光顯微鏡下或用流式分光光度計(jì)（流式細(xì)胞儀）觀察。第4章抗體制藥(三)熒光抗體的制備

免疫熒光測(cè)定方法（1）直接法：采用熒光抗體直接與抗原反應(yīng)。優(yōu)點(diǎn)：特異性高；缺點(diǎn)：每種抗原須單獨(dú)制備相應(yīng)的熒光抗體。（2）簡(jiǎn)接法：用熒光標(biāo)記抗球蛋白抗體（熒光第二抗體）來(lái)檢測(cè)未知抗原。只需制備一種熒光標(biāo)記的抗體，即可用以檢測(cè)多種抗原抗體系統(tǒng)，敏感度比直接法高5～10倍。第4章抗體制藥(三)免疫熒光（神經(jīng)元）免疫熒光顯像系統(tǒng)第4章抗體制藥(三)（二）免疫酶抗體診斷試劑用酶標(biāo)記來(lái)檢測(cè)抗原，分為免疫酶染色（組比法）和酶免疫測(cè)定兩種類(lèi)型。免疫酶染色法用酶標(biāo)記抗體，稱(chēng)為酶標(biāo)抗體。測(cè)定時(shí)酶標(biāo)抗體與抗原發(fā)生特異性結(jié)合，發(fā)生組化反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)，可在光學(xué)顯微鏡下直接觀察。常用辣根過(guò)氧化物酶(horseradishpeiroxidase，HRP)標(biāo)記抗體，加入酶底物－二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)。如果抗體與抗原結(jié)合，底物將被分解，呈現(xiàn)棕褐色。第4章抗體制藥(三)酶免疫測(cè)定（ELA）是一種在液相內(nèi)微量待檢抗原物質(zhì)的定量測(cè)定方法。酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)：ELISA酶免疫測(cè)定在方法上的一個(gè)重大改進(jìn)，使抗原或抗體吸附在聚苯乙烯塑料等表面上進(jìn)行反應(yīng)，大大簡(jiǎn)化了抗原抗體結(jié)合物的分離過(guò)程。用途廣泛，敏感度高，既可定性也可定量。第4章抗體制藥(三)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)――ELISA第4章抗體制藥(三)酶聯(lián)免疫反應(yīng)示意酶標(biāo)儀第4章抗體制藥(三)間接法：用于檢測(cè)血清中抗體載體抗原＋抗體（待檢血清）＋酶標(biāo)抗抗體＋底物-→顯色反應(yīng)夾心法：檢測(cè)標(biāo)本中抗原載體抗體＋抗原（待檢標(biāo)本）＋酶標(biāo)抗體（特異性）＋底物-→顯色反應(yīng)第4章抗體制藥(三)ELASA（競(jìng)爭(zhēng)法）第4章抗體制藥(三)生物素-酶標(biāo)抗生素蛋白系統(tǒng)抗體診斷試劑（BAS-ELISA）生物素-抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶復(fù)合物可作為一種指示劑，組成一個(gè)新的生物放大系統(tǒng)。該法特異性強(qiáng)、結(jié)合穩(wěn)定，在與抗體、酶、熒光素等結(jié)合后不影響后者的生物活性，可用于檢測(cè)多種抗原抗體系統(tǒng)。靈敏度：擴(kuò)散試驗(yàn)<電泳試驗(yàn)<凝集試驗(yàn)<ELISA<BAS-ELISA、放射免疫分析試驗(yàn)。第4章抗體制藥(三)（三）放射免疫用抗體診斷試劑放射免疫技術(shù)：靈敏度最高的檢測(cè)手段。診斷試劑設(shè)計(jì)中考慮的是用放射性同位素131I和125I標(biāo)記抗體，放射自顯影檢測(cè)。把同位素分析的高靈敏性與抗原抗體反應(yīng)的特異性?xún)纱筇攸c(diǎn)結(jié)合起來(lái)。在醫(yī)學(xué)實(shí)踐中可用放射性自顯影法檢測(cè)微量抗原物質(zhì)。第4章抗體制藥(三)放射免疫（競(jìng)爭(zhēng)法）結(jié)合態(tài)的標(biāo)記抗原（B）與游離態(tài)的標(biāo)記抗原（F）第4章抗體制藥(三)第4章抗體制藥(三)第六節(jié)抗體診斷試劑

三、導(dǎo)向診斷藥物在體內(nèi)直接診斷病原的抗體試劑被稱(chēng)為導(dǎo)向診斷藥物。放射免疫顯像定位技術(shù)是把特異性與病原細(xì)胞表面抗原結(jié)合的抗體預(yù)先同重金屬絡(luò)合劑—二乙基三胺五乙酸(DTPA)耦聯(lián)成Ab-DTPA，注入體內(nèi)，“自動(dòng)尋的”與病原細(xì)胞結(jié)合；再注入In-113M（放射性核素，銦），使其與DTPA絡(luò)合。放射免疫顯像定位技術(shù)通過(guò)放射自顯影，可以對(duì)病原細(xì)胞(如腫瘤)進(jìn)行組織定位、顯示腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移形成的病灶、觀察抗體在血液中的功能半衰期、確定肌體對(duì)抗體做出的不良反應(yīng)等。第4章抗體制藥(三)導(dǎo)向診斷藥物的顯像第4章抗體制藥(三)腫瘤標(biāo)記物放射免疫顯像第4章抗體制藥(三)

白細(xì)胞分化抗原是不同譜系白細(xì)胞分化、成熟的不同階段表達(dá)的細(xì)胞表面抗原分子，亦即白細(xì)胞表面標(biāo)記。它們參與機(jī)體重要的生理和病理過(guò)程。例如：（1）免疫應(yīng)答過(guò)程中免疫細(xì)胞的相互識(shí)別，免疫細(xì)胞抗原識(shí)別、活化、增殖和分化，免疫效應(yīng)功能的發(fā)揮；（2）造血細(xì)胞的分化和造血過(guò)程的調(diào)控；（3）炎癥發(fā)生；（4）細(xì)胞的遷移如腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移等。

第六節(jié)抗體診斷試劑

四、CD單克隆抗體系列第4章抗體制藥(三)應(yīng)用以單克隆抗體鑒定為主的聚類(lèi)分析法，將識(shí)別同一分化抗原的來(lái)自不同實(shí)驗(yàn)室的單克隆抗體歸為一個(gè)分化群，簡(jiǎn)稱(chēng)CD（clusterofdifferentiation)，按照發(fā)現(xiàn)的順序，白細(xì)胞分化抗原的命名從CD1、CD3，已達(dá)到CD247。用異硫氰酸熒光黃或羅丹明標(biāo)記這些分子，在免疫學(xué)上認(rèn)識(shí)淋巴T細(xì)胞的功能、分化、信息傳遞等具有十分重要的意義。第六節(jié)抗體診斷試劑

四、CD單克隆抗體系列第4章抗體制藥(三)CD4細(xì)胞第4章抗體制藥(三)第七節(jié)抗體治療藥物抗體治療藥物：以抗體為載體的導(dǎo)向治療藥物。其應(yīng)用上的障礙是抗體相對(duì)分子質(zhì)量大，穿透力低，不能到達(dá)靶部位或其攝取量低；另外就是鼠源性單克隆抗體的排斥反應(yīng)。目前正致力于抗體小型化和人源化的研究。第4章抗體制藥(三)第七節(jié)抗體治療試劑

一、放射性同位素標(biāo)記的抗體治療藥物放射性同位素標(biāo)記腫瘤特異性抗體，以抗體作為導(dǎo)向載體，導(dǎo)向病灶，利用放射性同位素的電離輻射能量治療病灶，使腫瘤細(xì)胞接受最大的電離輻射能量，殺傷腫瘤細(xì)胞。已經(jīng)研究的放射性同位素有131I、212Bi、109Pd、186Re等。第4章抗體制藥(三)優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，同位素和抗體的用量小，且能觀察到藥物在體內(nèi)的分布和藥物動(dòng)力學(xué)，就用前景好。

缺點(diǎn)：有些同位素來(lái)源困難，且需放射性保護(hù)和污物處理。第4章抗體制藥(三)第七節(jié)抗體治療試劑

二、與抗癌藥物耦聯(lián)的抗體治療藥物常用的抗癌藥物：氨甲喋呤(methotrixate,MTX) 阿霉素(adriamycin,ADM) 絲裂霉素(mitomycin,MMC) 環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,CTX) 新抑癌蛋白(neocarzinostaitin,NCS) 正定霉素(doxorubincin,DOX)以人血漿白蛋白作為中間載體，可明顯提高每分子抗體所攜帶的MTX量，使體外細(xì)胞毒性體高二倍。第4章抗體制藥(三)抗體藥物偶聯(lián)物對(duì)化學(xué)療法耐藥的細(xì)胞株仍然有效。

腫瘤細(xì)胞對(duì)抗原藥物可產(chǎn)生多藥耐藥性（MDR）。MDR是由基因調(diào)控的，其編碼蛋白稱(chēng)為P糖蛋白，其中P170是與腫瘤耐藥相關(guān)的主要蛋白。P蛋白是ATP酶依賴(lài)性藥泵，藥物進(jìn)入細(xì)胞后與P蛋白結(jié)合，利用ATP水解釋放的能量將藥物泵出胞外，使胞內(nèi)藥物蓄積減少，因而產(chǎn)生耐藥性?？贵w導(dǎo)向酶—前藥療法（ADEPT）可以大為提高化療的特異性，避免對(duì)正常組織的破壞。ADEPT的關(guān)鍵在于選擇適當(dāng)?shù)幕罨?前藥對(duì)。第4章抗體制藥(三)第七節(jié)抗體治療試劑

三、與毒素耦聯(lián)的抗體治療藥物在導(dǎo)向藥物中，毒素與抗體的交聯(lián)物稱(chēng)為免疫毒素。 白喉毒素(diphtheriatoxin,DT) 綠膿桿菌外毒素(pseudomonasexotoxin,PE)產(chǎn)氣夾膜桿菌磷脂酶(perfringens-pholipasePLC) 蓖麻毒素(ricintoxin,RT)。第4章抗體制藥(三)第一代免疫毒素是由包含A、B鏈的完整毒素和抗體的交聯(lián)物。

第二代免疫毒素則是利用抗體或抗體片段與毒素的A鏈或A鏈作用相似的單鏈核糖體失活蛋白的結(jié)合物。用基因克隆方法改造毒素基因，再和小分子抗體基因重組表達(dá)，成為第三代免疫毒素——重組免疫毒素。第4章抗體制藥(三)毒素的來(lái)源，主要是細(xì)菌毒素和植物毒素，如DT、PE、PLC、RT等。載體主要是將毒素?cái)y帶至靶細(xì)胞表面，且與其結(jié)合，使毒素進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)起作用。作為毒素的載體，必須相對(duì)分子質(zhì)量要小，識(shí)別與結(jié)合靶細(xì)胞能力強(qiáng)，特異性好。載體的種類(lèi)：小分子抗體FV或scFV；細(xì)胞生長(zhǎng)因子；激素；CD4。必須先把毒素基因分離與克隆出來(lái)，用基因重組技術(shù)去掉不必要的順序，只保留毒素決定部位的核苷酸順序，再與載體基因的cDNA連接，形成融合蛋白基因，轉(zhuǎn)化受體菌，表達(dá)的蛋白就是重組免疫毒素。第4章抗體制藥(三)免疫毒素的臨床作用：免疫毒素用于治療腫瘤、自身免疫病，并能克服組織移植排斥反應(yīng)?？蓡为?dú)結(jié)藥，或包裹在脂質(zhì)體及其他微粒中結(jié)藥。（1）腫瘤的免疫治療（2）骨髓移植

包括自體和異體骨髓移植。第4章抗體制藥(三)第四章復(fù)習(xí)題

1、畫(huà)圖說(shuō)明抗體分子