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鞋類(lèi)和鞋類(lèi)部件抗細(xì)菌性能評(píng)估試驗(yàn)方法國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)I——GB/T6682—2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法(ISO3696:1987,MOD)。1ISO3696分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法(Waterforanalyticallaboratoryuse—Specification25.2生物安全柜。5.5濕度培養(yǎng)箱。溫度可控制在(37±2)℃,相對(duì)濕度不低于90%。5.11控溫?fù)u床。溫度可控制在(37±2)℃,頻率為(126試劑和培養(yǎng)基6.1原則注:可依據(jù)ISO11133,或依據(jù)國(guó)家法律法規(guī)。僅使用ISO3696規(guī)定的三級(jí)水。水1000mL。攪拌調(diào)節(jié)pH至7.2±0.2(室溫)。在電熱板或沸水浴中攪拌加熱至成分完全溶解。用高壓滅菌鍋6.3營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)攪拌調(diào)節(jié)pH至7.2±0.2(室溫)。在電熱板或沸水浴中攪拌加熱至成分完全溶解。用高壓滅菌鍋3吐溫807.0g;若中和能力不足,吐溫80或卵磷脂的用量可進(jìn)行調(diào)整,或添加其他中和6.5氯化鈉溶液(生理鹽水)a)金黃色葡萄球菌(AS1.89或b)肺炎克雷伯氏菌(AS1.1736或ATCC4352)。將菌種接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)(6.3)上,在(37±2)℃下培養(yǎng)24h。在(5±3)℃下保藏(不應(yīng)超過(guò)1個(gè)月),作為保藏菌種。每個(gè)月轉(zhuǎn)接一次。4使用無(wú)菌接種環(huán),將一個(gè)菌落(7.2)移至20mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB)(6.2)中,在(37±2)℃搖床(5.11)中培養(yǎng)約16h(隔夜培養(yǎng))。使用顯微鏡或其他方法估算細(xì)菌的數(shù)量。準(zhǔn)備含有1%營(yíng)養(yǎng)肉湯所取樣的材料,面積應(yīng)占材料或部件面積的80%以上。若單一材料面積不足80%,需裁取2種主試樣的面積約500mm2。對(duì)于方法A(見(jiàn)附錄A),試樣厚度應(yīng)小于2.0mm。試樣的面積和重量應(yīng)表1列出了不同情況所適用的試驗(yàn)方法。1吸水性菌液吸收法(附錄A)2膜接觸法(附錄B)3吸水性和非吸水性振蕩法(附錄C)不同的鞋類(lèi)部件材料;成型材料;具有非溶出抗菌技術(shù)的5T?——接種0h后3個(gè)試樣菌落數(shù)的平均值,用CFU/mL,表示。h)不同材料或部件的抗菌率;i)與本試驗(yàn)方法的任何偏差。6(規(guī)范性附錄)將6個(gè)試樣和6個(gè)對(duì)照樣分別置于無(wú)菌廣口瓶(5.7)中。移取(1.0±0.1)mL第8章制備的接種液在3個(gè)接種后的試樣和對(duì)照樣(如果有)中加入20mL,SCDLP培養(yǎng)基(6.4)。塞緊瓶塞,用約將3個(gè)接種后的試樣和對(duì)照樣(如果有)在(37±2)℃條件下培養(yǎng)(24±1)h。依據(jù)A.1.2進(jìn)行。用無(wú)菌移液管移取1mLA.1.2以及A.1.4制備的洗脫液至試管中,加入((6.5)搖勻。用生理鹽水(6.5)稀釋洗脫液制備10倍梯度溶液。在營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)(6.3)上接種各梯度緩沖液100pL,平行雙份,將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒置培養(yǎng)培養(yǎng)后,記錄數(shù)量在30~300之間的菌落數(shù)。若菌落數(shù)量低于30,仍記錄平皿中菌落數(shù)量。若平M=Z×B×20M——每一樣品的活菌數(shù)量;Z——兩平皿上活菌數(shù)的平均值;7A.2.2有效性判斷3個(gè)對(duì)照樣接種和培養(yǎng)后菌落數(shù)極差△(lgC)≤1。對(duì)照樣在接種后菌落數(shù)平均值至少為1×103CFU。在平板計(jì)數(shù)法中,用式(A.2)計(jì)算細(xì)菌生長(zhǎng)值(F),F應(yīng)≥0。式中:F——對(duì)照樣細(xì)菌生長(zhǎng)值;C,——3個(gè)對(duì)照樣培養(yǎng)后的菌落平均值,用CFU/mL表示。C?——3個(gè)對(duì)照樣接種后的菌落平均值,用CFU/mL表示。當(dāng)以上條件都滿(mǎn)足時(shí),試驗(yàn)結(jié)果有效。若不滿(mǎn)足所有的條件,試驗(yàn)結(jié)果無(wú)效,應(yīng)重新測(cè)試。A.2.3抗菌率的計(jì)算依據(jù)第11章計(jì)算抗菌率。8GB/T38017—2019/ISO16187:2(規(guī)范性附錄)膜接觸法B.1樣品制備B.1.1試樣若樣品量充足,盡量取比9.2規(guī)定尺寸大的樣品。試樣尺寸應(yīng)在試驗(yàn)報(bào)告中注明。B.1.2覆蓋膜覆蓋膜的尺寸和形狀應(yīng)與試樣和對(duì)照樣相匹配。應(yīng)保證接種液不能從膜邊緣溢出。覆蓋膜應(yīng)比樣品小。實(shí)際尺寸和形狀需在報(bào)告中注明。覆蓋膜由PE、PP、PET等不影響細(xì)菌生長(zhǎng)的材料制成。其厚度約為0.05mm~0.1mm。B.1.3樣品的滅菌(可選)作為9.3給出的一個(gè)可選步驟,可依據(jù)以下要求進(jìn)行。用70%乙醇溶液擦拭對(duì)照樣與試樣表面。5min后,用無(wú)菌蒸餾水沖洗,自然晾干。不用能乙醇處理的樣品可直接用無(wú)菌蒸餾水沖洗,或使用其他不影響抗菌效果和試驗(yàn)結(jié)果的滅菌方法。B.2試驗(yàn)步驟B.2.1接種將6個(gè)試樣和6個(gè)對(duì)照樣分別置于培養(yǎng)皿中,試驗(yàn)面向上。準(zhǔn)確移取0.1mL~0.2mL菌懸液至試驗(yàn)表面。用無(wú)菌夾鉗將覆蓋膜(5.8)移至試驗(yàn)面上,不能有氣泡,以保證接種液能均勻接觸樣品。蓋上皿蓋。見(jiàn)圖B.1。圖B.1接種及覆蓋膜的位置9若沒(méi)有合適的對(duì)照樣,在沒(méi)有樣品的培養(yǎng)皿中接種作為對(duì)照樣來(lái)判定結(jié)果有效性。在接種后的3個(gè)試樣和空白樣的培養(yǎng)皿中,分別添加10mLSCDLP培養(yǎng)基(6.4)。用二維或三維振蕩器(5.10)以50r/min的頻率振蕩5min,使細(xì)菌從試樣或?qū)φ諛由舷疵撓聛?lái)。將3個(gè)試樣和3個(gè)對(duì)照樣在(37±2)℃,相對(duì)濕度不低于90%的條件下培養(yǎng)(24±1)h。B.2.4培養(yǎng)后洗脫(24h)依據(jù)B.2.2進(jìn)行。B.2.5活菌數(shù)量的測(cè)定依據(jù)A.1.5測(cè)定B.2.2或B.2.4每個(gè)樣品洗脫液中的活菌數(shù)量。B.3結(jié)果表達(dá)B.3.1菌落數(shù)的計(jì)算用式(B.1)計(jì)算每一試樣的活菌數(shù)量:M=Z×B×10×I…………(B.1)式中:M——每一樣品的活菌數(shù)量;Z——兩平皿上活菌數(shù)的平均值;B——稀釋倍數(shù);10——洗脫液的體積,單位為毫升(mL);I——稀釋因子,0.1mL接種液為10,或0.2mL,接種液為5。B.3.2有效性判斷a)對(duì)照樣在接種后菌落數(shù)平均值至少為1×101CFU。b)3個(gè)對(duì)照樣接種后活菌數(shù)量的對(duì)數(shù)值需滿(mǎn)足式(B.2)的要求:式中:Lmx——最大活菌數(shù)的常用對(duì)數(shù)值(基于10的對(duì)數(shù));Lmin——最小活菌數(shù)的常用對(duì)數(shù)值;Lmc——平均活菌數(shù)的常用對(duì)數(shù)值。對(duì)照樣不應(yīng)有明顯抗細(xì)菌性能。培養(yǎng)后每個(gè)對(duì)照樣的活菌數(shù)不應(yīng)小于接種后活菌數(shù)的1/10。若B.3.3抗菌率計(jì)算依據(jù)第11章計(jì)算抗菌率。(規(guī)范性附錄)C.1試驗(yàn)步驟C.1.1接種將6個(gè)試樣和6個(gè)對(duì)照樣分別置于250mL,無(wú)菌錐形瓶中。移取(50.0±0.5)mL第8章制備好的接種液于每個(gè)試樣和對(duì)照樣。從3個(gè)接種后的試樣和對(duì)照樣中分別移取2mL溶液至含有18mLSCDLP培養(yǎng)基(6.4)的無(wú)菌燒依據(jù)C.1.2進(jìn)行。依據(jù)A.1.5測(cè)定C.1.2或C.1.4每個(gè)樣品洗脫液中的活菌數(shù)量。C.2結(jié)果表達(dá)C.2.1活菌數(shù)的計(jì)算M=Z×B×10Z——兩平皿上活菌數(shù)的平均值;B——稀釋倍數(shù);10——中和劑的稀釋比例。C.2.2有效性判斷3個(gè)對(duì)照樣接種和培養(yǎng)后菌落數(shù)極差△(lgC)≤1。對(duì)照樣在接種后菌落數(shù)平均值至少為1×103F=1gC,-1gC?………………F——對(duì)照樣細(xì)菌生長(zhǎng)值;依據(jù)第11章計(jì)算抗菌率。D.1背景樣品1#織物A(附錄A),C(附錄C)A(附錄A),C(附錄C)B(附錄B)B(附錄B),C(附錄C)5#PU涂層織物(灰色)B(附錄B)6#PU涂層織物(灰色)B(附錄B)注:樣品5#和6#的抗細(xì)菌性不同?!獙?duì)于樣品1和樣品2,無(wú)論用方法A(附錄A)還是方法C(附錄C),各實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性都很好。這意味著采用試驗(yàn)方法A或C的試驗(yàn)結(jié)果(R和R*)是相似——樣品3以方法B進(jìn)行試驗(yàn)的結(jié)果(R和R*)可重復(fù)性與樣品1和樣品2的一樣好?!?yàn)椴煌臏缇幚碛绊懺囼?yàn)結(jié)果,樣品4和樣品5以方法B進(jìn)行試驗(yàn)的結(jié)果相似?!袇⒓訉?duì)比試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室都報(bào)告樣品6的抗菌性差。[1]ISO5725(allparts),Accuracy(truenessandprecision)ofmeasurementmethodsanceformicrobiologicalexaminaionofculturemedia—Part1:Generalguidelinesofculturemediainthelabandproductionofculturemedia—Part2:Practicalguidelinesonperformancetestingofculturemedia[5]ISO20645,Textilefabrics—Determination[6]ISO20743,Textiles—Determinationofantibacterialactivityoftextileproducts[7]ISO22196,Measurementof[8]ISO/IEC17025,Generalrequirements[9]IEC60068-2-10,Environmentaltesting—Part2-10:Tests—TestJandguidauationofbasicbactericidalactivityofchemicaldisinfectantsandantis[11]EN12353,Chemicaldisinfectantthedeterminationofbactericidal,sporicidalandfungicidalactivity[12]ASTME1054,StandardTestM[13]AS

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