化學農藥環(huán)境安全評價試驗準則 第13部分：溞類急性活動抑制試驗 編制說明

《化學農藥環(huán)境安全評價試驗準則第13部分：溞類急性活動抑制試驗》編制說明（一）任務來源根據(jù)國標委發(fā)[2023]64號國家標準化管理委員會關于下達2023年國家標準制修訂計劃的通知（2023年12月28日發(fā)）第897項，由農業(yè)農村部農藥檢定所主持承擔“化學農藥環(huán)境安全評價試驗準則第13部分：溞類急性活動抑制20233466-T-326。（二）制定背景我國是農業(yè)大國，也是農藥生產和使用大國。農藥是一種特殊商品，它既是農業(yè)生產必需的生產資料，它的使用對控制病、蟲、草害，保障糧食安全發(fā)揮著巨大的作用，但同時也可能對生態(tài)環(huán)境造成不容忽視的污染和危害，甚至對人類健康產生嚴重威脅。農藥對生態(tài)環(huán)境的污染危害已成為全球廣泛關注的重大環(huán)境問題，農藥的安全性（包括環(huán)境和人體健康）管理也已逐步成為全球農藥管理的重點。為了加強農藥的環(huán)境管理，以便在使用農藥的同時保護日益脆弱的生態(tài)環(huán)境，世界各國都加大了監(jiān)管力度。農藥環(huán)境管理的法律、標準不斷完善，歐盟、美國、日本、澳大利亞、加拿大、巴西等國家和地區(qū)先后建立了農藥環(huán)境風險評估技術體系。我國也于2016年發(fā)布了NY/T2882《農藥登記環(huán)境風險評估指南》系列農業(yè)行業(yè)標準，建立了農藥對水生生態(tài)系統(tǒng)、鳥類、蜜蜂、家蠶、地下水、非靶標節(jié)肢動物和土壤生物的環(huán)境風險評估方法。據(jù)農業(yè)農村部測算，2020年我國水稻、小麥、玉米三大糧食作物農藥利用率約為40%，其余少數(shù)部分通過飄移、徑流、淋溶等方式進入水環(huán)境，可能對水生生物造成危害，其中溞類是主要的水生生態(tài)系統(tǒng)中無脊椎動物之一，對水環(huán)境中的多種化學物質非常敏感。因此，確定農藥對溞類的急性毒性是評估農藥環(huán)境安全性的基礎。2017年新發(fā)布的《農藥登記資料要求》（農業(yè)部2569號公告）也規(guī)定化學農藥申請農藥登記時需要提交溞類急性活動抑制試驗資料以及環(huán)境風險評估報告。我國國家標準GB/T31270.13-2014《化學農藥環(huán)境安全評價試驗準則第13部分：溞類急性活動抑制試驗》（以下簡稱原標準）在我國的農藥管理與新農藥的開發(fā)研制過程中發(fā)揮了重要作用。但該標準中試驗程序的描述比較簡單，與國際標準不同處較多。隨著綠水青山就是金山銀山的理念深入人心，國家、社會和公眾對我國的農藥管理工作提出了更高的要求。因此，為了滿足農藥管理的需求，促進我國農藥的國際貿易，進一步加強與規(guī)范農藥對生態(tài)環(huán)境的安全評價工作，修訂《化學農藥環(huán)境安全評價試驗準則第13部分：溞類急性活動抑制試驗》國家標準是非常必要的?！痘瘜W農藥環(huán)境安全評價試驗準則第13部分：溞類急性活動抑制試驗》國家標準的修訂，旨在進一步完善我國農藥環(huán)境安全評價技術體系，通過農藥登記前的環(huán)境安全性評價，從源頭控制農藥對環(huán)境可能產生的污染。同時試驗準則的標準化、規(guī)范化，可保證試驗結果的準確可靠及可比性。因此，國家標準的修訂，對于規(guī)范我國農藥環(huán)境安全評價工作，使之適應新形勢的要求，從而更好地為我國的農藥登記和農藥環(huán)境管理提供技術支持具有重要意義。GB/T31270.13-2014至今已實施近10年，廣泛應用于農藥登記、新農藥研制篩選和科研等領域，測定化學農藥溞類急性活動抑制毒性方面具備深厚的研究基礎和實踐經驗。2004年OECD適用于化學品測試的“溞類急性活動抑制試驗”試驗指南（OECD,2004:Guideline202:Daphniasp.,ofChemicals）以及EPA的相關指南文件（USEPA(1996).Guidelines.）可以為標準的修訂提供方法參考。（三）起草過程部農藥檢定所組織相關專家成立了標準起草工作組,提出標準修訂實施方案。起草組成員主要包括：陳朗、楊海榮、袁善奎、曲甍甍、周欣欣、卜元卿、蒲倩云、安雪花、陳麗萍、續(xù)衛(wèi)利、周彬彬、張海情。（2）文本起草。2024年2-6月，標準起草工作組查閱了經濟合作與發(fā)展組織（OECD）、美國環(huán)保署（USEPA）關于溞類急性活動抑制試驗的試驗準則，調研了我國農藥登記環(huán)境影響試驗單位的現(xiàn)狀，確定了本標準的框架結構和主要內容。并同時按照GB1.1-2020《標準化工作導則第1部準編寫規(guī)則第4部分試驗方法標準》的要求編寫完成標準征求意見稿和編制說明。二、標準編制原則、主要內容及其確定依據(jù)，修訂行業(yè)標準時，還包括修訂前后技術內容的對比；本標準的主要內容包括化學農藥溞類急性活動抑制試驗的試驗條件、試劑或材料、儀器設備、樣品、試驗步驟、試驗數(shù)據(jù)處理、質量控制以及試驗報告等的基本要求。修訂這些內容時遵循科學合理、可操作可重復的原則?？茖W合理性體現(xiàn)在方法設計以確保所獲得的毒性終點——半數(shù)效應濃度（EC50）能準確反映供試農藥的毒性屬性為目標，從而為農藥登記環(huán)境風險評估提供科學數(shù)據(jù)支持?？刹僮骺芍貜腕w現(xiàn)在把“科學性第一”放在首位的基礎上，標準修訂過程中充分考慮國內實驗室現(xiàn)有技術能力和平臺，確保對試驗各相關要素都進行了全面的、充分的描述，確保各要素的有關規(guī)定具有可操作性，確保農藥登記環(huán)境安全性數(shù)據(jù)的可靠。同時，本標準還遵循以下原則：1.規(guī)范性原則格式的規(guī)范性方面，本標準的編制要符合GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》等基礎標準的規(guī)定；二是指內容的規(guī)范性，標準規(guī)定的試驗方法，力求做到試驗條件的規(guī)范化。2.針對性原則本標準主要瞄準以化學農藥為研究對象開展的溞類急性活動抑制試驗的標準化，標準旨在為化學農藥這一特殊性被試物開展以登記為目的的試驗提供具體依據(jù)。3.前瞻性、先進性原則充分考慮與國際通用試驗準則的接軌。注意吸收國內外相關標準，國際農藥環(huán)境安全性評價技術最新進展。1.范圍。給出了本標準的適用范圍。2.規(guī)范性引用文件。給出了難處理農藥這類被試物配制試驗藥液時應采用的方法標準以及大型溞的標準化培養(yǎng)方3.術語和定義。給出了難處理農藥這類被試物配制試驗藥液時應采用的方法標準。4.原理。概述了化學農藥溞類急性活動抑制試驗的目的和基本方法。5.試驗條件。規(guī)定了試驗期間溫度、光照和培養(yǎng)條件等方面的要求。6.試劑或材料。規(guī)定了試劑、供試生物（種類、日齡、馴養(yǎng)、健康狀態(tài)等）、試驗容器（規(guī)格、材質）和試驗用水（類別、水質）等方面的要求。7.儀器設備。列出了試驗所需的儀器設備。8.樣品。對被試物和參比物的信息進行描述。其中，針對被試物給出了可供試驗設計參考的各類數(shù)據(jù)信息。9.試驗步驟。給出了試驗方法（靜態(tài)/半靜態(tài)/流水式）的選擇原則，預試驗、正式試驗和限度試驗流程，試驗藥液的制備方法，染毒與培養(yǎng)方法，觀察與測定方法（活動受抑制與中毒癥狀、水質參數(shù)被試物濃度檢測方法等試驗實施方面的要求。10.試驗數(shù)據(jù)處理。規(guī)定了數(shù)據(jù)整理方法、繪圖要求，以及EC50統(tǒng)計方法、結果表達方法。11.質量控制。規(guī)定了對照組受試溞受抑制率限制要求，試驗溶解氧含量的標準、被試物濃度檢測要求以及參比物試驗等質量控制要求。12.試驗報告。給出了試驗報告中至少應包含的內容。附錄A（資料性）重組水的配制。規(guī)定了ISO標準稀釋水等的配制方法。附錄B（資料性）試驗用水水質要求。列出了合格試驗用水的物理化學特性。附錄C（資料性）農藥對溞類毒性等級劃分。列出了農藥對溞類毒性的四個等級。主要內容參考經濟合作與發(fā)展組織（OECD）2004年發(fā)布的化學品溞類急性活動抑制試驗準則（202:Daphniasp.,AcuteImmobilisationTest.OECDGuidelinesfortheTestingofChemicals）制定（后續(xù)簡稱OECD202）。該文件是國際通行的研究溞類急性毒性試驗準則，內容較為完善，大多數(shù)國家農藥管理機構接受按該準則開展的農藥急性毒性試驗資料。本標準參考其制定。除文字性修改外，本標準與OECD對性”等原則和近年來標準起草單位和國內主要實驗室的經驗，本標準的修訂過程中在OECD202基礎上進行了擴展和細化。具體如下：本標準限定了標準的適用范圍為化學農藥而開展的溞類急性活動抑制試驗，即對被試物進行了限定。同時，鑒于NY/T刪除了GB/T31270-2014版關于“不適用于易揮發(fā)、難溶解的化學農藥”的相關描述。2.規(guī)范性引用文件。給出了易揮發(fā)、難溶解等難處理農藥這類被試物配制試驗藥液時應采用的方法標準——NY/T3273難處理農藥水生生物毒性試驗指南。NY/T3273主要參考OECDGD23（2000）制定，該導則文件也是OECD202的重要補充。增加了大型溞實驗室培養(yǎng)應采用的方法標準：NY/T4195.5《農藥登記環(huán)境影響試驗生物試材培養(yǎng)第3.術語和定義。與GB/T31270-2014版相比，保留了半數(shù)抑制濃度、活動抑制的定義，新增了靜態(tài)試驗法、半靜態(tài)試驗法、流水式試驗法等本標準涉及的術語定義。刪除了被試物、參比物、原藥、制劑、有效成分等的定義。4.原理。概述了化學農藥溞類急性活動抑制試驗的基本流程和目的。在GB/T31270-2014版基礎上進行了文字性修5.試驗條件。對有關試驗期間溫度、光照、水質和承載量等方面的具體要求參照OECD202進行了修改，與OECD202基本一致。6.試劑或材料。增加了試劑方面的總結，有關供試生物（種類、日齡、馴養(yǎng)、健康狀態(tài)等）、試驗容器（規(guī)格、材質）和試驗用水（類別、水質）等方面的具體要求參照OECD202進行了修改，與OECD202基本一致。7.儀器設備。儀器設備類型參照OECD202進行了修改，8．樣品。對被試物和參比物的信息描述參照OECD202進行了修改，與OECD202基本一致。9.試驗步驟。給出了試驗方法（靜態(tài)/半靜態(tài)/流水式）的選擇原則，預試驗、正式試驗和限度試驗流程，試驗藥液的制備方法，染毒與培養(yǎng)方法，觀察與測定方法（活動受抑制數(shù)與中毒癥狀、水質參數(shù)濃度檢測方法等試驗實施方面的要求。與OECD202基本一致，但做了以下補充和細化：1）針對被試物為農藥中的特殊劑型——微囊懸浮劑、微囊懸浮-懸浮劑、緩釋粒劑等緩釋劑型，根據(jù)被試物特性及環(huán)境風險評估的需要，規(guī)定這類被試物應采用靜態(tài)試驗法。2）針對近年來評審中遇到問題，農藥登記相關試驗報告鮮有描述試驗藥液狀態(tài)，導致對于有疑惑的試驗結果進行原因分析時缺少該類關鍵信息，難以判斷試驗結果的科學性。因此，本次修訂在9.3.2試驗藥液制備部分，規(guī)定了觀察并描述試驗液狀態(tài)、顏色等的要求。2）針對農藥作為被試物時，針對部分具有揮發(fā)性強、吸附性強、在測試條件下不穩(wěn)定和/或難溶于水而難以達到或者保持暴露濃度的情形，要求參照NY/T3273《難處理農藥水生生物毒性試驗指南》采取相應措施配制試驗藥液。3）操作方面，對于試驗藥液短暫靜置后出現(xiàn)沉淀的情形，根據(jù)《農藥登記環(huán)境影響試驗常見問題解答》給出了去除沉淀物的操作方法，從而給試驗人員提供更多的技術參考，詳見9.3.2.3。4）針對被試物為農藥中的特殊劑型——混配制劑，為避免實驗室通過簡單的直接離心、過膜等方法制備儲備液，出現(xiàn)其中溶解度相對小的有效成分大部分被濾掉，進而導致試驗藥液中各有效成分的濃度比相較于產品中的配比發(fā)生極大變化的情況，在9.3.2.3部分特別指出應避免類似操作。5）在染毒（9.3.3）和培養(yǎng)（9.3.4）環(huán)節(jié)規(guī)定了受試溞隨機分配以及試驗容器在培養(yǎng)區(qū)域內須隨機擺放。6)與OECD202的要求一致，規(guī)定化學分析時應充分考慮被試物的“溶解態(tài)濃度”。在此基礎上，為便于指導國內技術人員達到技術要求，給出了具體的水樣前處理方法，詳見9.3.6.3。7）與OECD202的要求一致，規(guī)定對于不穩(wěn)定的被試物，對采集的樣品應立即進行分析檢測。在此基礎上，給出了如未進行即時分析情形下的技術要求：須有儲存穩(wěn)定性分析數(shù)據(jù)的支持，進一步細化了操作要求。8）針對被試物為農藥中的特殊劑型——微囊懸浮劑、微囊懸浮-懸浮劑，根據(jù)被試物特性及環(huán)境風險評估的需要，規(guī)定這類被試物應同時測定全態(tài)濃度和游離態(tài)濃度。10.試驗數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)整理方法、繪圖要求，以及EC50統(tǒng)計方法、結果表達方法等均參照OECD202進行了修改，與OECD202基本一致，但針對被試物為農藥中的特殊劑型——微囊懸浮劑、微囊懸浮-懸浮劑，規(guī)定以全態(tài)濃度和以游離態(tài)濃度計的試驗結果，便于全面了解其毒性并應用于風險評估。11.質量控制。對照的受抑制率要求，溶解氧含量標準、被試物濃度檢測要求以及參比物試驗質量控制要求，與GB/T31270-2014、OECD202基本一致。新增了對試驗中偏離試驗準則的情形進行描述和評估的要求，有利于獲得兼有完整性和科學性的試驗報告。12.試驗報告。給出了試驗報告中至少應包含的內容。參照OECD202進行了修改，與OECD202基本一致,但根據(jù)國內實驗室目前試驗報告完整性方面的短板，做了一些細——要求必要時附水質檢測報告、預試驗結果；——要求描述試驗藥液外觀、為測定溶解性濃度所做的相關操作、分析方法的重現(xiàn)性及靈敏度、回收率、最低定量限、試驗過程中發(fā)生的可能影響結果的事件，偏離試驗準則的情況、后果及相關解釋與評價等；——對試驗藥液濃度分析結果的呈現(xiàn)形式做了細化，使數(shù)據(jù)更加直觀、完整：要求將測定濃度與設定濃度、“舊液”和“新液”測定濃度以比值形式體現(xiàn)；要求被試物為混配制劑的，同時給出單個有效成分和有效成分之和的濃度等。31270-2014基本一致。發(fā)布年限較早，準則中要求的限量指標相對較少，參照2019年新發(fā)布的OECD203（魚類急性毒性試驗）進行了修改，與OECD203基本一致。15.由于我國目前對農藥的環(huán)境管理是基于對鳥類、水生生態(tài)系統(tǒng)、蜜蜂、家蠶、非靶標節(jié)肢動物、土壤生物和地下水的風險評估結果，而不是簡單地依據(jù)對非靶標生物的毒對溞類毒性等級劃分”相關內容。1)更改了標準適用范圍，修訂后的標準適用范圍可涵蓋易揮發(fā)、難溶解化學農藥（見第1章,2014年版的第1部2)增加了規(guī)范性引用文件款項（見第2章）。3)更改了術語和定義，刪除了供試物、化學農藥、原藥、制劑、有效成分、參比物質的定義，增加了靜態(tài)試驗法、2.3、2.4、2.5、2.6、2.104)更改了試驗條件，包括允許的pH值變化范圍、曝氣處理、承載量等有關要求（見第5章,2014年版的4.1.65)增加了試劑要求，包括用于pH調節(jié)、助溶、參比物試驗等的相關試劑的基本信息和級別要求（見6.12014年版的4.1.1）7)增加了試驗容器基本要求（見6.38)更改了試驗用水要求，增加了試驗用水類別，修改了水質要求及其檢測頻率（見6.4,2014年版的4.1.59)更改了儀器設備相關要求，新增流水式試驗裝置、化學分析設備、前處理設備、移液器等（見第7章,2014年版的4.1.48.1,2014年版的4.1.211)增加了試驗方法的選擇要求（見第9.112)增加了試驗藥液制備相關要求（見9.3.213)更改了染毒和培養(yǎng)方法，要求將供試溞隨機加入到部分,2014年版的4.2.214)更改了觀察與測定方法，新增了水質參數(shù)測定頻率與方法（見9.3.5,2014年版的4.2.215)增加了濃度檢測方法（見9.3.616)增加了數(shù)據(jù)整理要求（見10.117)更改了數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法（見10.2,2014年版的4.318)更改了質量控制條件，新增了描述和評估試驗偏離的要求（見第11章,2014年版的4.419)更改了試驗報告相關要求，新增了對試驗方法特別是濃度設置依據(jù)、試驗藥液配制、外觀、化學分析及其前處理方法、中毒癥狀觀察、化學分析典型譜圖等的報告要求，以及對分析方法驗證結果、試驗藥液濃度檢測結果報告的要求，細化了被試物信息、供試生物信息、試驗條件、試驗結果（水質參數(shù)、觀測與統(tǒng)計）等的要求（見第12章，2014年版的第5部分20)更改了試驗用水理化參數(shù)指標與要求（見附錄B）21)刪除了農藥對溞類毒性等級劃分相關內容（2014年三、試驗驗證的分析、綜述報告，技術經濟論證，預期的經濟效益、社會效益和生態(tài)效益；為驗證該方法在國內實驗室的可行性和各實驗室間結果的可重復性，標準制定工作組組織開展了驗證試驗。由北京綠城堡農業(yè)科技有限公司、浙江省農業(yè)科學院農產品質量安全與營養(yǎng)研究所、沈陽沈化院測試技術有限公司安全評價中心等三家實驗室采用95%高效氯氟氰菊酯原藥開展了溞類急性活動抑制試驗。溞類急性活動抑制試驗結果匯總見表2。驗證試驗結果顯示，三家實驗室的試驗結果基本一致，表明本標準規(guī)定的試驗方法在國內實驗室具有較好的可操作性、可重復性。表2溞類急性活動抑制試驗驗證試驗結果匯總表目前國際通用的研究農藥溞類急性活動抑制試驗的試驗準則是經濟合作與發(fā)展組織（OECD）于2004年發(fā)布了化學品溞類急性活動抑制試驗準則（202:Daphniasp.,AcuteImmobilisationTest.OECDGuidelinesfortheTestingofChemicals大多數(shù)國家農藥管理機構接受按該準則開展的農藥溞類急性活動抑制試驗資料。本標準在OECD202基礎上制定，除文字性修改外，本標準與OECD202的技術內容基本一致，但為適應我國實際情況做了部分修改（見主要內容確定依據(jù)部分）。與OECD等試驗方法標準相比，本標準主要技術內容與其基本相同，具有國際先進水平。據(jù)估計，我國農藥的有效利用率約為40%，其余少數(shù)部分通過飄移、徑流、淋溶等方式進入水環(huán)境，可能對水生生物造成危害，其中溞類是主要的無脊椎水生生物之一。農藥對溞類的毒性是評估農藥環(huán)境安全性的基礎，我國《農藥登記資料要求》也規(guī)定化學農藥申請農藥登記時需要提交溞類急性活動抑制試驗報告。本標準的制定實施有利于規(guī)范農藥的溞類急性活動抑制試驗，明確農藥對溞類的急性毒性，試驗結果可用于農藥對水生生態(tài)系統(tǒng)的環(huán)境風險評估，減少高風險農藥的登記使用，促進農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展、保障生態(tài)環(huán)境安全。四、與國際、國外同類標準技術內容的對比情況，或者與測試的國外樣品、樣機的有關數(shù)據(jù)對比情況；本標準制定和起草過程中參考了國際通行的OECD試驗準則，結合我國實際情況，與歐美發(fā)達國家和國際組織現(xiàn)行的試驗準則水平相當。本標準沒有專用儀器設備和專用標準樣品，不存在國內外樣機與樣品對比問題。五、以國際標準為基礎的起草情況，以及是否合規(guī)引用或者采用國際國外標準，并說明未采用國際標準的原本標準技術內