SNT 4419.13-2016 出口食品常見過敏原LAMP系統(tǒng)檢測方法 第13部分：葵花籽

中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)第13部分：葵花籽I本部分為SN/T4419的第13部分。1出口食品常見過敏原LAMP系列檢測方法第13部分：葵花籽SN/T4419的本部分規(guī)定了出口食2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，GB/T27403-2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測dNTP:脫氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleosidLAMP:環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediatedisothermalamplifiTritonX-100:聚乙二醇辛基苯基醚4防污染措施環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測過程的防污染措施應(yīng)符合GB/T27403—2008中附錄D的規(guī)定。2增，通過顏色變化觀察判定是否存在過敏原葵花籽成分。6LAMP檢測方法根據(jù)葵花籽HaG5基因序列設(shè)計(jì)特異性內(nèi)引物、外引物和環(huán)引物各一對，特異性識別靶序列上的6個獨(dú)立區(qū)域，在鏈置換型BstDNA聚合酶的作用下啟動循環(huán)鏈置換反應(yīng)，在特異靶序列啟動互補(bǔ)鏈合成，在同一鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成有很多環(huán)的花椰菜結(jié)構(gòu)的莖-環(huán)DNA混合物；從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物(焦磷酸鎂)形成乳白色沉淀，加入顯色液，即可通過顏色變化觀察判定結(jié)果。顯色液顯色原理：SYBRGreenI是一種高靈敏的DNA熒光染料，可以嵌入方式結(jié)合到dsDNA的小溝內(nèi)。當(dāng)它與dsDNA結(jié)合時(shí)，熒光信號是游離狀態(tài)的800-1000倍。在不發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，SYBRGreenI染料分子的熒光信號不發(fā)生改變，顏色顯現(xiàn)為橙色；當(dāng)發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，隨著dsDNA的增加，SYBR染料的熒光信號也隨之大幅度增強(qiáng)，其信號強(qiáng)度可代表dsDNA分子的數(shù)量，同時(shí)顏色由橙色變?yōu)榫G色。6.2儀器和設(shè)備6.2.1水浴鍋或加熱模板：63℃±1℃和80℃±1℃。6.2.3計(jì)時(shí)器。6.3試劑和材料除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純或生化試劑。6.3.1實(shí)驗(yàn)用水：應(yīng)符合GB/T6682中一級水的規(guī)格。6.3.2CTAB提取緩沖液(20g/LCTAB,1.4mol/LNaCl,0.1mol/LTris-HCl,0.02mol/L6.3.3CTAB沉淀液(5g/LCTAB,406.3.5蛋白酶K(20mg/mL)。6.3.7BstDNA聚合酶：酶濃度6.3.11顯色液：SYBRGreenI熒光染料，1000×。6.3.12引物：根據(jù)葵花籽HaG5基因設(shè)計(jì)一套特異性引物，包括外引物F3/B3,內(nèi)引物FIP/BIP,環(huán)引物FLP/BLP,見表1。3名稱編號序列LAMP引物序列外側(cè)上游引物(F3)外側(cè)下游引物(B3)5’-GGATATCGATATTGCTCTCGG-3’5'-GTTGCTGTTGTACTTGCTGCTGAAACATCGAAGGGCAGTG-3’5'-GGTTCGCAGCAGACCCAATGAAGGTTGCATACGTTAGG-3’上游環(huán)引物(FLP)5'-TCGGAACACCTGCTTCAC-3’下游環(huán)引物(BLP)5'-TTGAAGCAGAAGGCTCAGATT-3’——LAMP反應(yīng)的空白對照(以DNA溶解液代替DNA模板)。4外側(cè)上游引物(F3)外側(cè)下游引物(B3)內(nèi)側(cè)上游引物(FIP)內(nèi)側(cè)下游引物(BIP)上游環(huán)引物(FLP)下游環(huán)引物(BLP)41(包括緩沖液中所含硫酸鎂)12水現(xiàn)非下述正常結(jié)果，應(yīng)重做實(shí)驗(yàn)：7結(jié)果判斷和確證7.1待檢樣品2個平行樣反應(yīng)管中液體均呈橙色，同時(shí)各種實(shí)驗(yàn)對照結(jié)果正常，可判斷該樣品檢測結(jié)7.2待檢樣品2個平行樣反應(yīng)管中液體至少1管呈綠色，同時(shí)各種實(shí)驗(yàn)對照結(jié)果正常，可判斷該樣品56(資料性附錄)擴(kuò)增產(chǎn)物參考序列CTCCAGCAGTGTTGTCAAGAGCTCCAAAACATCGAAGGGCAGTGCCAAAAGCAGGTGTTCCGAGAAGCCCAGCAGCAAGTACAACAGCAACAGGGACGGCACCCTTCCGCGGT