NYT 2695-2015 牛遺傳缺陷基因檢測技術規(guī)程

牛遺傳缺陷基因檢測技術規(guī)程I本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。1SN/T2497.15進出口危險化學品安全試驗方法第15部分：2顯子第73位堿基突變(G→T)引起的一種牛隱性遺傳缺陷。其典型臨床癥狀表現(xiàn)為胚胎或胎兒死亡，由尿苷酸合酶基因UMPS(uridinemonophophatesynthase)的C-末端405處的密碼子存在一個點突變導致密碼子CGA轉變?yōu)榻K止子TGA引起的一種牛隱性遺傳缺陷。其典型臨床癥狀為胚胎或胎兒期死亡，死亡率達100%。由凝血因子XI基因FXI(factorXI)外顯子12上插入了一個大小為76bp的DNA片段引起的一種牛騾蹄癥mulefoot,MF由低密度脂蛋白受體結合蛋白基因LPR4(lowdensitylipoproteinreceptorrelatedprotein4)第33外顯子發(fā)生了兩個堿基的突變(C4863A,G4864T)引起一種牛遺傳缺陷。其典型臨床癥狀為在不同品種中雜合個體表現(xiàn)不同的外顯率，缺陷個體一般一只或多只蹄子均可表現(xiàn)騾蹄牛蜘蛛腿綜合征spiderlegofarachnomeliaandthrogryposis,SAA;arachnomeliasyndrome,AS在瑞士褐牛中由SOUX(sulfiteoxidase)基因第4外顯子第363位插入一個堿基(c.363-364insG)而引起，在西門塔爾牛中由MOCS1(molybdenumcofactorsynthesisstep1)基因位于第11外顯子第1224～1225位CA兩個堿基的缺失而引起的一種牛隱性遺傳缺陷。其典型臨床癥狀為在瑞士褐牛和在調查某種遺傳病畜禽各個個體的發(fā)病情況后，采用特定的符號和格式繪制345.2.171%～3%瓊脂糖凝膠：稱取1g～3g瓊脂糖，加100mLTAE煮沸，等降至50℃~60℃時，加入5.2.182%～5%瓊脂糖凝膠：稱取2g～5g瓊脂糖，加100mLTAE煮沸，等降至50℃~60℃時，加入劑處理，并4℃短期保存，-20℃及以下低溫保存?zhèn)溆?；組織、帶毛囊的毛發(fā)浸入75%的酒精、精液，按GB/T27642—2011中附錄B規(guī)定的方法執(zhí)行。DNA樣品操作注意事項按SN/T1119中規(guī)定引物配制按NY/T1670—2008中6.2.1條款的規(guī)定執(zhí)行，引物信息參見附錄A中A.1。按附錄A中A.2的要求配制PCR反應體系，并按A.3的程序進行擴增。PCR操作中防止污染等取5μL～10μLPCR產(chǎn)物，上樣于1%～3%瓊脂糖凝膠中進行電泳，結果與標準確定是否為預期擴增片段。如果不是預期擴增片段，重復6.3和6.4步驟，直到6.5.1錯配PCR突變分析利用牛基因組的特異性引物1-3作為內標引物擴增，重復6.4步驟檢測PCR反應產(chǎn)物；利用致病基因的特異性擴增引物1-4篩查致病突變，重復6.4步驟檢測擴增產(chǎn)物，若存在該條帶說明被測個體6.5.2SSCP分析6.5.3RFLP分析按B.1和B.2的要求配制RFLP反應體系，在37℃水浴中溫浴4h,然后酶切產(chǎn)物用2.0%～5.0%孟德爾定律對各個體的表現(xiàn)型和基因型進行分析，通過分析可以判斷某種遺傳51)引物1-1(參見附錄A中表A.1)的PCR擴增產(chǎn)物長度為177bp,出現(xiàn)2條帶(AA)的判2)引物1-2(參見附錄A中表A.1)的PCR擴增產(chǎn)物長度為249bp,出現(xiàn)2條帶(AA)的判c)錯配PCR突變分析(PCR-MAMA)a)PCR-SSCP:引物2-1(參見附錄A中表A.1)的PCR擴增產(chǎn)物長度為187bp,出現(xiàn)2條帶1)引物2-2(參見附錄A中表A.1)擴增產(chǎn)物為136bp條帶，出現(xiàn)108bp和28bp2條帶的2)引物2-3(參見附錄A中表A.1)擴增產(chǎn)物為324bp條帶，出現(xiàn)193bp和131bp2條帶a)PCR-SSCP:引物3-1(參見附錄A中表A.1)的PCR擴增產(chǎn)物長度為177bp,出現(xiàn)2條帶2)引物3-3(參見附錄A中表A.1)擴增產(chǎn)物為282bp條帶，出現(xiàn)194bp和88bp2條帶的6C中圖C.11。b)引物6-2和引物6-3(參見附錄A中表A.1)在同一體系擴增MOSC1基因產(chǎn)物為208bp條外顯子上)堿基缺失為C或A,則判定為隱性基因攜帶個體；擴增產(chǎn)物經(jīng)DNA測序，AS1224～1225位置上(第11外顯子上)堿基缺失為CA,則判定為患病個體。檢測結果判定DNA測序，LRP4基因第33外顯子LPR44863～4864位置上為CG,判定為正常個體；擴增產(chǎn)物為表A.1遺傳缺陷基因引物引物序列長度退火溫度℃牛脊椎畸形SLC35A3基因F1-1:5'-TCAGTGGCCCTCAGATTR1-1:5'-CCAAGTTGAATGTTTCTTF1-2:5'-AGCTCTCCTCTGTAAR1-2:5'-TCTCAAAGTAAACF1-3:5'-TGGAAGCAAAGAACCCR1-3:5'-TCGTCAGAAACCGCAF1-4:5'-CACAA'TTTGTAGGTCTCR1-4:5'-TCCACACTGATGGTTTGG牛白細胞黏附缺陷癥，BLADCD18基因F2-1:5-AGTTGCGTTCAACGTGACR2-1:5'-AACAGGTGCTTCCTGGGCTF2-2:5'-AGTTGCGTTCAACGTGACR2-2:5'-AACAGGTGCTTCCTGGGCTF2-3:5'-CCTGCATCATATCCAR2-3:5'-GTTTCAGGGGAAGA遺傳缺陷基因引物引物序列℃F3-1:5'-GGCCAGGGACCGTGTTCATTGAGGR3-1:5'TTCCIGGGACCCCGTGAGACACAF3-2:5'-GGCCAGGGACCGTGTTCATTGAGGAR3-2:5'-TTCCTGGGACCCCGTGAGACACAF3-3:5′-TTTTCAAGACCACCCR3-3:5'-CATACTTGGCTCCUMPS基因4F4:5'-GAACATTCTGAATTIGTGATR4:5'-GCTTCTAACTGAACTC牛凝血因子XI缺乏癥，F(xiàn)actorXIFXI基因5F5:5'-CCCACTGGCTAGGAAR5:5'-CAAGGCAATGTCAT牛蜘蛛腿綜合征，SOUX基因(瑞士褐牛)F6-1:5'-CGCAGATATACCAGGGR6-1:5'-CGATAGGTGTCTGG(德系西門塔爾牛)F6-2:5'-CCTGACATGAACAGGR6-2:5'-CCAGGTGGGAACTGF6-3:5'-TGGAGAAACTCACTCTGTGR6-3:5'-GTGTTCAGGTTCTGAGALRP4基因7F7:5'-AGCGTGTGGACAAGTACR7:5'-ACCTCAAGCTCAAA9表A.2PCR反應體系單倍反應體系，Taq酶(5U/μL)模板DNA(50ng/μL～100ng/pL)總體積注：PCR反應體系可以根據(jù)實際情況而調整。PCR反應程序見表A.3。表A.3PCR反應程序最后延伸延伸51℃~66℃注：具體退火溫度參照表A.1。酶切反應體系見表B.1。表B.1酶切反應體系10×緩沖液限制性酶內切酶總體積引物對應內切酶見表B.2。引物內切酶引物2-2引物2-3引物3-2引物3-3引物4(資料性附錄)電泳結果及系譜分析模式圖C.1CVM結果模式圖C.1.1CVMPCR-SSCP結果(引物1~2)參見圖C.1。C.1.2CVMPCR-MAMA結果模式圖(引物1-3)參見圖C.2。圖C.2SLC35A3基因的PCR-MAMA結果模式圖C.2BLAD結果判定圖C.2.1BLADPCR-SSCP結果模式圖(引物2-1)參見圖C.3。圖C.3CD18基因的SSCP模式圖C.2.2BLADTaqI酶切后RFLP結果模式圖(引物2-2)參見圖C.4。 4,5——AB型；7——DL2000圖C.4CD18基因的RFLP結果模式圖C.2.3BLADTaqI酶切后RFLP結果模式圖(引物2-3)參見圖C.5。圖C.5CD18基因的RFLP結果模式圖C.3.1CNPCR-SSCP結果(引物3-1)參見圖C.6。圖C.6ASS基因的PCR-SSCP結果分析C.3.2CNAvaⅡ酶切結果模式圖(引物3-2)參見圖C.7。 C.3.3CNEco47I酶切結果模式圖(引物3-3)參見圖C.8。11圖C.8ASS基因的RFLP結果模式圖DUMPSAvaI酶切結果模式圖參見圖C.9。6三三三三 NY/T2695—2015C.5FXPCR檢測結果模式圖FXIPCR檢測結果模式圖參見圖C.10。圖C.10FXI基因PCR結C.6.1ASP