熒光分光光度計的原理及應(yīng)用

關(guān)于熒光分光光度計的原理及應(yīng)用2024/7/292024/7/29一、分子熒光的產(chǎn)生1.電子激發(fā)態(tài)的多重度單重激發(fā)態(tài)S：電子自旋方向和處于基態(tài)軌道的電子配對。第一節(jié)熒光分光光度法原理三重激發(fā)態(tài)T：電子自旋方向和處于基態(tài)軌道的電子平行。第2頁,共15頁，星期六，2024年，5月2024/7/292.分子能級與躍遷基態(tài)(S0)→激發(fā)態(tài)(S1、S2激發(fā)態(tài)振動能級)：吸收特定頻率的輻射。激發(fā)態(tài)→基態(tài)：多種途徑和方式(見能級圖)；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢；磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越延遲熒光傳遞途徑輻射躍遷熒光振動弛預(yù)無輻射躍遷第3頁,共15頁，星期六，2024年，5月2024/7/29S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫第4頁,共15頁，星期六，2024年，5月2024/7/29二、激發(fā)光譜與熒光光譜1.熒光的激發(fā)光譜曲線

固定測量波長(選最大發(fā)射波長),化合物發(fā)射的熒光(磷光)強(qiáng)度與激發(fā)光波長的關(guān)系曲線（圖中曲線I

）。激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強(qiáng)度最大；第5頁,共15頁，星期六，2024年，5月2024/7/292.熒光光譜

固定激發(fā)光波長,化合物發(fā)射的熒光強(qiáng)度與發(fā)射光波長關(guān)系曲線(圖中曲線II)。問題：熒光(磷光)的激發(fā)光波長如何選擇？Stokes位移：激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值。發(fā)射光譜的波長比激發(fā)光譜的長。第6頁,共15頁，星期六，2024年，5月2024/7/29三、熒光強(qiáng)度和溶液濃度的關(guān)系1定量依據(jù)

熒光強(qiáng)度

If正比于吸收的光量Ia和熒光量子效率

：

If=

Ia由朗-比耳定律：Ia=I0(1-10-lc)

If=

I0(1-10-lc)=

I0(1-e-2.3lc)

濃度很低時，將括號項(xiàng)近似處理后：

If

=2.3

I0lc

=Kc

（濃度高時如何？）第7頁,共15頁，星期六，2024年，5月2024/7/29標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量：配制一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度試樣測定熒光強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再在相同條件下測量未知試樣的熒光強(qiáng)度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出濃度；比較法定量：在線性范圍內(nèi)，測定標(biāo)樣和試樣的熒光強(qiáng)度，比較。2定量方法三、熒光強(qiáng)度和溶液濃度的關(guān)系第8頁,共15頁，星期六，2024年，5月2024/7/29四、熒光、磷光分析方法的特點(diǎn)（1）靈敏度高比紫外-可見分光光度法高2～4個數(shù)量級；為什么？分光光度法所檢測的是兩個較大的信號的微小差別，熒光光度法檢測的是很小背景值上的熒光強(qiáng)度。（2）選擇性強(qiáng)既可依據(jù)特征發(fā)射光譜，又可根據(jù)特征吸收光譜；（3）試樣量少（4）可提供比較多的物理參數(shù)缺點(diǎn)：應(yīng)用范圍小。第9頁,共15頁，星期六，2024年，5月2024/7/29第二節(jié)熒光分光光度計的組成

測量熒光的儀器主要由四個部分組成：激發(fā)光源、樣品池、雙單色器系統(tǒng)、檢測器。特殊點(diǎn)：有兩個單色器，光源與檢測器成直角。

基本流程如圖：單色器：選擇激發(fā)光波長的第一單色器和選擇發(fā)射光(測量)波長的第二單色器；光源：氙燈?和高壓汞燈，染料激光器檢測器：光電倍增管。第10頁,共15頁，星期六，2024年，5月2024/7/29儀

器

光

路

圖問題：參考光電管作用？第11頁,共15頁，星期六，2024年，5月2024/7/29第三節(jié)熒光分析法的應(yīng)用(1)無機(jī)化合物的分析與有機(jī)試劑配合物后測量；可測量約60多種元素。鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土常采用熒光分析法；氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳采用熒光熄滅法測定；銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過氧化氫采用催化熒光法測定；鉻、鈮、鈾、碲采用低溫?zé)晒夥y定；鈰、銪、銻、釩、鈾采用固體熒光法測定(2)生物與有機(jī)化合物的分析見表第12頁,共15頁，星期六，2024年，5月2024/7/29第13頁,共15頁