熒光光譜的原理及應用

關于熒光光譜的原理及應用2熒光是指一種光致發(fā)光的冷發(fā)光現(xiàn)象。當某種常溫物質(zhì)經(jīng)某種波長的入射光（通常是紫外線）照射，吸收光能后進入激發(fā)態(tài)，并且立即退激發(fā)并發(fā)出比入射光的的波長長的出射光（通常波長在可見光波段）；而且一旦停止入射光，發(fā)光現(xiàn)象也隨之立即消失。具有這種性質(zhì)的出射光就被稱之為熒光。

第2頁,共61頁，星期六，2024年，5月3磷光是一種緩慢發(fā)光的光致冷發(fā)光現(xiàn)象。當某種常溫物質(zhì)經(jīng)某種波長的入射光（通常是紫外線）照射，吸收光能后進入激發(fā)態(tài)（具有和基態(tài)不同的自旋多重度），然后緩慢地退激發(fā)并發(fā)出比入射光的的波長長的出射光，而且與熒光過程不同，當入射光停止后，發(fā)光現(xiàn)象持續(xù)存在。發(fā)出磷光的退激發(fā)過程是被量子力學的躍遷選擇規(guī)則禁戒的，因此這個過程很緩慢。第3頁,共61頁，星期六，2024年，5月4第4頁,共61頁，星期六，2024年，5月5第5頁,共61頁，星期六，2024年，5月6主要內(nèi)容熒光光譜的基本原理1熒光光譜儀的原理、操作及數(shù)據(jù)處理2熒光光譜的應用3參考資料4第6頁,共61頁，星期六，2024年，5月7熒光光譜的基本原理第7頁,共61頁，星期六，2024年，5月8分子能級比原子能級復雜；在每個電子能級上，都存在振動、轉(zhuǎn)動能級；一、分子能級與躍遷激發(fā)：

基態(tài)(S0)→激發(fā)態(tài)(S1、S2激發(fā)態(tài)振動能級)：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位；失活：

激發(fā)態(tài)→基態(tài)：多種途徑和方式(見能級圖)；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢；第一、第二、…電子激發(fā)單重態(tài)

S1、S2…

；第一、第二、…電子激發(fā)三重態(tài)

T1、T2…

；第8頁,共61頁，星期六，2024年，5月9

電子激發(fā)態(tài)的多重度：

M=2S+1

S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)；電子激發(fā)態(tài)的多重度單重態(tài)：一個分子中所有電子自旋都配對的電子狀態(tài)。三重態(tài)：有兩個電子的自旋不配對而平行的狀態(tài)。激發(fā)三重態(tài)能量較激發(fā)單重態(tài)低。第9頁,共61頁，星期六，2024年，5月10第10頁,共61頁，星期六，2024年，5月11躍遷規(guī)則躍遷前后原子核的構型沒有發(fā)生改變、躍遷過程中電子自旋沒有改變、躍遷前后電子的軌道在空間有較大的重疊和軌道的對映性發(fā)生了改變的躍遷是允許的；（S0→S1允許躍遷）躍遷過程中電子自旋發(fā)生了改變、躍遷前后電子的軌道在空間不重疊或軌道的對映性未發(fā)生改變的躍遷是禁阻的。（S0→T1禁阻躍遷）Franck-Condon原理：在電子躍遷完成的瞬間，分子中原子核的構型是來不及改變的。第11頁,共61頁，星期六，2024年，5月12單重態(tài)能級間的躍遷符合光譜選律，躍遷概率大。分子通過吸收輻射而直接被激發(fā)到三重態(tài)的躍遷是禁阻的，概率很小。第12頁,共61頁，星期六，2024年，5月13雅布隆斯基分子能級圖S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間竄越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫S

2第13頁,共61頁，星期六，2024年，5月14電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，容易返回基態(tài)，在這個過程中通過輻射躍遷(發(fā)光)和無輻射躍遷等方式失去能量，這個過程就稱為失活。失活途徑輻射躍遷熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換系間竄越振動弛豫無輻射躍遷

激發(fā)態(tài)停留時間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大。失活的途徑第14頁,共61頁，星期六，2024年，5月15振動弛豫：同一電子能級內(nèi)以熱量交換形式由高振動能級至低相鄰振動能級間的躍遷。發(fā)生振動弛豫的時間一般為10-12s。激發(fā)態(tài)分子常常首先發(fā)生振動馳豫。

無輻射躍遷失活的途徑通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級。

內(nèi)轉(zhuǎn)換：多重度相同的電子能級中等能級間的無輻射能級躍遷。第15頁,共61頁，星期六，2024年，5月16無輻射躍遷失活的途徑系間竄越：不同多重態(tài)，有重疊的轉(zhuǎn)動能級間的非輻射躍遷。

改變電子自旋，禁阻躍遷，通過自旋—軌道耦合進行。含有重原子的分子中（如I、Br等），系間竄躍最常見。

外轉(zhuǎn)換：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷；

外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅”。第16頁,共61頁，星期六，2024年，5月17熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)（多為S1→S0躍遷），發(fā)射波長為’2的熒光；10-7～10-9s。輻射躍遷失活的途徑磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)（多為T1→S0躍遷）；發(fā)射波長為

3的磷光；

10-4～100s。電子由S0進入T1的可能過程：（S0→T1禁阻躍遷）

S0→激發(fā)→振動弛豫→內(nèi)轉(zhuǎn)換→系間竄越→振動弛豫→T1

發(fā)光速度很慢，光照停止后，可持續(xù)一段時間。

磷光僅在很低的溫度或黏性介質(zhì)中才能觀測到，因此磷光很少應用于分析由圖可見，發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長長；’2>

2>

1；第17頁,共61頁，星期六，2024年，5月18熒光產(chǎn)生的過程：（1）處于基態(tài)最低振動能級的熒光物質(zhì)分子受到紫外線的照射，吸收了和它所具有的特征頻率相一致的光線，躍遷到第一電子激發(fā)態(tài)的各個振動能級；（2）被激發(fā)到第一電子激發(fā)態(tài)的各個振動能級的分子通過無輻射躍遷降落到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級；（3）降落到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級的分子繼續(xù)降落到基態(tài)的各個不同振動能級，同時發(fā)射出相應的光量子，這就是熒光：（4）到達基態(tài)的各個不同振動能級的分子再通過無輻射躍遷最后回到基態(tài)的最低振動能級．第18頁,共61頁，星期六，2024年，5月19熒光光譜固定激發(fā)光波長物質(zhì)發(fā)射的熒光強度與發(fā)射光波長關系曲線，如右圖中曲線II。熒光本身則是由電子在兩能級間不發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)的輻射躍遷過程中所產(chǎn)生的光。磷光光譜固定激發(fā)光波長物質(zhì)發(fā)射的磷光強度與發(fā)射光波長關系曲線，如右圖中曲線III。磷光本身則是由電子在兩能級間發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)的輻射躍遷過程中所產(chǎn)生的光。熒光光譜與磷光光譜第19頁,共61頁，星期六，2024年，5月20光譜圖第20頁,共61頁，星期六，2024年，5月21激發(fā)光譜

固定發(fā)射波長(一般將其固定于發(fā)射波段中感興趣的峰位)，掃描出的化合物的發(fā)射光強度(熒光/磷光)與入射光波長的關系曲線。

二、主要光譜參量發(fā)射光譜

固定激發(fā)波長(一般將其固定于激發(fā)波段中感興趣的峰位)，掃描出的化合物的發(fā)射光強度(熒光/磷光)與入射光波長的關系曲線。吸收光譜

化合物的吸收光強度與入射光波長的關系曲線。第21頁,共61頁，星期六，2024年，5月22主要光譜參量

吸收光譜反映出的是物質(zhì)的基態(tài)能級與激發(fā)態(tài)能級之間所有的允許躍遷。通常狀態(tài)下的物質(zhì)的表觀顏色大部分時候取決于其吸收特性。

激發(fā)光譜則反映的是基態(tài)與所有與該熒光發(fā)射有關的能級之間的躍遷。其所呈現(xiàn)的關系比吸收光譜要有選擇性，但有時候又不如吸收光譜來的直接。第22頁,共61頁，星期六，2024年，5月23激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關系

a.Stokes位移激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值。熒光的波長總是大于激發(fā)光的波長。這是由于發(fā)射熒光之前的振動馳豫和內(nèi)轉(zhuǎn)換過程損失了一定的能量。

b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量(如能級圖

2,

1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長一定的熒光(如

‘2)。

c.

鏡像規(guī)則通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對稱關系。第23頁,共61頁，星期六，2024年，5月24產(chǎn)生斯托克位移的主要原因：1.躍遷到激發(fā)態(tài)高振動能級的激發(fā)態(tài)分子，首先以更快的速率發(fā)生振動弛豫（其速率在1013/s數(shù)量級），散失部分能量，達到零振動能級，一般從零振動能級發(fā)射熒光；2.激發(fā)態(tài)形成后，其分子的構型將很快進一步調(diào)整，以達到激發(fā)態(tài)的穩(wěn)定構型，這又損失了部分能量；3.發(fā)射熒光的激發(fā)態(tài)多為（π，π*）態(tài)，這種激發(fā)態(tài)較基態(tài)時有更大的極性，因此將在更大程度上為極性溶劑所穩(wěn)定，使激發(fā)態(tài)的能量進一步降低。斯托克位移第24頁,共61頁，星期六，2024年，5月25關于激發(fā)光的波長λ1：①決定熒光物質(zhì)是否能夠產(chǎn)生吸收并發(fā)射出熒光；②能夠使熒光物質(zhì)產(chǎn)生吸收并發(fā)射出熒光的激發(fā)光的波長并不具有唯一性；③在保證激發(fā)的前提下，不同激發(fā)波長處的熒光發(fā)射光譜相同，但熒光強度不同。④在進行熒光測定時，須選擇激發(fā)光波長以保證熒光強度最大。第25頁,共61頁，星期六，2024年，5月26熒光發(fā)射是光吸收的逆過程。熒光發(fā)射光譜與吸收光譜有類似鏡影的關系。但當激發(fā)態(tài)的構型與基態(tài)的構型相差很大時，熒光發(fā)射光譜將明顯不同于該化合物的吸收光譜。鏡像規(guī)則第26頁,共61頁，星期六，2024年，5月27鏡像規(guī)則的解釋

基態(tài)上的各振動能級分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動能級分布類似；

基態(tài)上的零振動能級與第一激發(fā)態(tài)的零振動能級之間的躍遷幾率最大，相反躍遷也然。

第27頁,共61頁，星期六，2024年，5月28三、熒光的產(chǎn)生與分子結構的關系1.分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件（1）具有合適的結構；（2）具有一定的熒光量子產(chǎn)率。

第28頁,共61頁，星期六，2024年，5月291.化合物的結構與熒光（1）躍遷類型：*→的熒光效率高，系間跨越過程的速率常數(shù)小，有利于熒光的產(chǎn)生；（2）共軛效應：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移（3）剛性平面結構：可降低分子振動，減少與溶劑的相互作用，故具有很強的熒光。（4）取代基效應：芳環(huán)上有供電基，使熒光增強。第29頁,共61頁，星期六，2024年，5月30化合物相對熒光強度熒光波長/nm

C6H6（苯）10270~310

C6H5COOHC6H5NO230310~390

C6H5CH3C6H5OHC6H5OCH3C6H5NH2C6H5CN1718202020270~320285~365285~345310~405280~360

C6H5ClC6H5BrC6H5I750275~345290~380第30頁,共61頁，星期六，2024年，5月31

物質(zhì)分子發(fā)射熒光的能力用熒光量子產(chǎn)率（Φ）表示：Φ與失活過程的速率常數(shù)k有關：

凡是使熒光速率常數(shù)kf增大而使其他失活過程（系間竄越、外轉(zhuǎn)換、內(nèi)轉(zhuǎn)換）的速率常數(shù)減小的因素（環(huán)境因素和結構因素）都可使熒光增強。2熒光量子產(chǎn)率Φ第31頁,共61頁，星期六，2024年，5月32四、影響熒光強度的外部因素

1.溶劑的影響

溶劑極性增加，有時會使熒光強度增加，熒光波長紅移。若溶劑和熒光物質(zhì)形成氫鍵或使熒光物質(zhì)電離狀態(tài)改變，會使熒光強度、熒光波長改變。含重原子的溶劑（碘乙烷、四溴化碳）使熒光減弱，磷光增強。

溶劑粘度減小時，可以增加分子間碰撞機會，使無輻射躍遷增加而熒光減弱。故熒光強度隨溶劑粘度的減小而減弱。由于溫度對溶劑的粘度有影響，一般是溫度上升，溶劑粘度變小，因此溫度上升，熒光強度下降。第32頁,共61頁，星期六，2024年，5月332.溫度的影響

熒光強度對溫度變化敏感，溫度增加，分子運動速度加快，分子間碰撞的幾率增加，外轉(zhuǎn)換去活的幾率增加，熒光效率降低。例如熒光素鈉的乙醇溶液，在0℃以下，溫度每降低10℃，

f增加3％，在

80℃時，

f為1。第33頁,共61頁，星期六，2024年，5月343pH值的影響

含有酸性或堿性取代基的芳香化合物的熒光與pH有關。pH的變化影響了熒光基團的電荷狀態(tài)，從而使其熒光發(fā)生變化?；衔锵鄬晒鈴姸菴6H5OH18C6H5O—

0C6H5NH2

20C6H5NH3

+0第34頁,共61頁，星期六，2024年，5月354.內(nèi)濾光作用和自吸現(xiàn)象自吸現(xiàn)象：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長端與其吸收光譜的長波長端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蒽化合物。內(nèi)濾光作用：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光，如色胺酸中的重鉻酸鉀；第35頁,共61頁，星期六，2024年，5月365.熒光熄滅劑熒光熄滅是指熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強度降低的現(xiàn)象。引起熒光熄滅的物質(zhì)稱為熒光熄滅劑(quenchingmedium)。如鹵素離子、重金屬離子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物均為常見的熒光熄滅劑。第36頁,共61頁，星期六，2024年，5月376、散射光小部分光子和物質(zhì)分子相碰撞，使光子的運動方向發(fā)生改變而向不同角度散射。瑞利光：光子和物質(zhì)發(fā)生彈性碰撞，不發(fā)生能量交換，只是光子運動方向發(fā)生改變。其波長與入射光波長相同。拉曼光：光子和物質(zhì)發(fā)生彈性碰撞，發(fā)生能量交換，光子把部分能量轉(zhuǎn)移給物質(zhì)分子或從物質(zhì)分子獲得部分能量。從而發(fā)射出比入射光稍長或稍短的光。散射光對熒光測定有干擾，尤其是波長比入射光波長更長的拉曼光，與熒光波長接近，對測定的干擾大，必須采取措施消除。拉曼光的干擾主要來自溶劑，當溶劑的拉曼光與被測物質(zhì)的熒光光譜相重疊時，應更換溶劑或改變激發(fā)光波長第37頁,共61頁，星期六，2024年，5月38a:320nm或350nm為激發(fā)光，熒光峰總是在448nm。

b:將空白溶劑分別在320nm及350nm激發(fā)光照射下測定熒光，激發(fā)光波長為320nm時，拉曼光波長是360nm，360nm的拉曼光對熒光無影響；當激發(fā)光波長為350nm時，拉曼光波長是400nm，400nm的拉曼光對熒光有干擾，因而影響測定結果。

硫酸奎寧在不同波長激發(fā)下的熒光與散射光譜

第38頁,共61頁，星期六，2024年，5月39熒光光譜儀的原理、操作及數(shù)據(jù)處理第39頁,共61頁，星期六，2024年，5月40熒光光譜儀的基本原理特殊點：有兩個單色器，光源與檢測器通常成直角。第40頁,共61頁，星期六，2024年，5月41光源：

高壓氙燈發(fā)出的光線強度大，而且是連續(xù)光譜，通用性較好，但氙弧燈熱效應大，穩(wěn)定性較差，對電壓穩(wěn)定性要求較高。高功率連續(xù)可調(diào)激光光源是一種新型熒光激發(fā)光源。激光的單色性好、強度大。激光光源近年來應用日益普遍。

第41頁,共61頁，星期六，2024年，5月42單色器：第一單色器——選擇激發(fā)光波長λ1

（＞250nm的紫外光），稱為激發(fā)單色器。第二單色器——選擇(測量)發(fā)射光（熒光）波長λ2，與激發(fā)光入射方向垂直，稱為熒光單色器。樣品池：

采用低熒光材料，通常為四面透光的石英池。檢測器：

光電倍增管。第42頁,共61頁，星期六，2024年，5月43液體樣品準備1.溶液樣品盡量使用透明的玻璃化溶液，避免在這種匯聚式光路中由于比色皿中溶液的前后吸收不均導致的光譜失真問題。2.為安全起見，對于使用揮發(fā)性劇毒溶劑的測試，一定要有合適的防護。3.易揮發(fā)、易變質(zhì)的溶液最好現(xiàn)配現(xiàn)測。4.液體樣品一般放在帶蓋石英比色皿（與紫外測試所用比色皿不同，為側(cè)面全透明型）中進行測試。第43頁,共61頁，星期六，2024年，5月44測試準備由于物質(zhì)的發(fā)射特性和吸收特性是緊密相關的，所以提前做好吸收譜可以有效縮短熒光測試的摸索時間。對于不知道相關特性的樣品，吸收譜的測試比熒光光譜的測試要容易很多。所以，建議大家先測一下樣品的吸收譜，并從中找出感興趣的吸收峰和特性，在熒光測試時以便參考。第44頁,共61頁，星期六，2024年，5月45光譜測試開機

電源——燈源2.熒光光譜

固定激發(fā)光的波長，選擇合適的熒光光譜波長范圍、濾光片、光路狹縫、掃描速度等測量不同熒光波長處熒光的強度，得到熒光光譜，即熒光強度—熒光波長圖。

3.激發(fā)光譜

在熒光最強的波長處固定熒光波長，選擇合適的激發(fā)光譜波長范圍、濾光片、光路狹縫、掃描速度等測量隨激發(fā)光波長的改變而變化的熒光強度，得到熒光激發(fā)光譜。即熒光強度-激發(fā)光波長圖。第45頁,共61頁，星期六，2024年，5月464.熒光光譜

在熒光最強的波長處固定激發(fā)波長，選擇合適的熒光光譜波長范圍、濾光片、光路狹縫、掃描速度等進行發(fā)射譜的掃描。5.重復3、4步循環(huán)掃描得到理想的光譜圖。7.關機光源——電源6.保存數(shù)據(jù)光譜測試激發(fā)波長一定要小于發(fā)射波長。第46頁,共61頁，星期六，2024年，5月47光路狹縫和掃描速度的選擇如果光路狹縫太大，熒光信號太強，容易超出儀器檢測范圍，損傷儀器；如果狹縫開的太小，熒光信號又太弱，檢測比較困難，所以要選擇大小合適的狹縫。如果掃描太快，容易跳峰，忽略特征性的峰信號；掃描太慢則浪費時間。所以只要能掃描得到平滑的光譜曲線就可以了。第47頁,共61頁，星期六，2024年，5月48熒光光譜的應用第48頁,共61頁，星期六，2024年，5月491.定量依據(jù)與方法(1)定量依據(jù)

熒光強度

If正比于吸收的光量Ia和熒光量子效率

：

If=

Ia由朗伯-比耳定律：Ia=I0(1-10-

lc)If=

I0(1-10-

lc)=

I0(1-e-2.3

lc)濃度很低時，將括號項近似處理后：

If

=2.3

I0

lc

=Kc第49頁,共61頁，星期六，2024年，5月50（2）定量方法標準曲線法：

配制一系列標準濃度試樣測定熒光強度，繪制標準曲線，再在相同條件下測量未知試樣的熒光強度，在標準曲線上求出濃度；比較法：在線性范圍內(nèi)，測定標樣和試樣的熒光強度，比較；第50頁,共61頁，星期六，2024年，5月512、熒光光譜的應用熒光探針金屬-有機配合物（MOF）發(fā)光材料分子傳感器物質(zhì)的檢測稀土摻雜發(fā)光材料發(fā)光器件光譜第51頁,共61頁，星期六，2024年，5月52(1)無機化合物的分析

與有機試劑配合物后測量；可測量約60多種元素。鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土常采用熒光分析法；氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳采用熒光熄滅法測定；銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過氧化氫采用催化熒光法測定；鉻、鈮、鈾、碲采用低溫熒光法測定；鈰、銪、銻、釩、鈾采用固體熒光法測定(2)生物與有機化合物的分析見表第52頁,共61頁，星期六，2024年，5月53第53頁,共61頁，星期六，2024年，5月54第54頁,共61頁，星期六，2024年，5月55與蛋白質(zhì)或其他大分子結構非共價相互作用而使一種或幾種熒光性質(zhì)發(fā)生改變的小分子物質(zhì)?？捎糜谘芯看蠓肿游镔|(zhì)的性質(zhì)和行為。熒光探針目前常用的熒光探針有熒光素類探針、無機離子熒光探針、熒光量子點、分子信標等。熒光探針除應用于核酸和蛋白質(zhì)的定量分析外，在核酸染色、DNA電泳、核酸分子雜交、定量PCR技術以及DNA測序上都有著廣泛的應用。熒光探針：第55頁,共61頁，星期六，2024年，5月56熒光探針過渡金屬配合物很多能實現(xiàn)較強的紅外波段寬帶發(fā)射，可以有效避開組織體的吸收，可以穿透組織體實現(xiàn)紅外成像，克服同位素原子示蹤對人體的傷害；壽命處于μs量級，可以用于較大分子的形變和轉(zhuǎn)動擴散研究，當然，結合其特有的發(fā)射波段也能對活體環(huán)境中的許多擴散和轉(zhuǎn)變過程進行研究。第56頁,共61頁，星期六，2024年，5月57稀土離子是一類核酸探針的檢測試劑。