基因工程實(shí)驗(yàn)教學(xué)教案

《基因工程》實(shí)驗(yàn)教學(xué)教案實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)室儀器使用及安全教育一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)室相關(guān)儀器的使用，了解本實(shí)驗(yàn)室藥品特性及實(shí)驗(yàn)藥品分區(qū)管理。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1、移液器的使用：一個(gè)完整的移液循環(huán)，包括吸頭安裝——容量設(shè)定——預(yù)洗吸頭——吸液——放液——卸去吸頭等六個(gè)步驟。每一步驟都有需要遵循的操作規(guī)范。（1）吸頭安裝：采用旋轉(zhuǎn)安裝法，將白色套筒頂端插入吸頭，在輕輕用力下壓的同時(shí)，把手中的移液器按逆時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)180度。（2）容量設(shè)定：選取適當(dāng)量程的移液器（選0.1-10μL），調(diào)節(jié)分兩步進(jìn)行，一是粗調(diào)，通過排放按鈕將容量值迅速調(diào)整至接近預(yù)想值，二是細(xì)調(diào)，將移液器橫置，水平放置自己眼前，通過調(diào)節(jié)輪慢慢將容量值調(diào)至預(yù)想值。（3）預(yù)洗吸頭：把需要轉(zhuǎn)移的液體吸收排放至2、3次，讓吸頭內(nèi)壁形成一道同質(zhì)液膜，確保移液工作的精度和準(zhǔn)度。（4）吸液：將移液器排放按鈕按至第一停點(diǎn)，再將吸頭垂直浸入液面，平穩(wěn)松開按鈕吸液。（5）放液：吸頭緊貼容器壁，先將排放按鈕按至第一停點(diǎn)，略作停頓后，再按至第二停點(diǎn)。（6）卸去吸頭：卸掉的吸頭不能和新吸頭混放，以免交叉污染。2、離心機(jī)的使用：（1）離心機(jī)放在水平堅(jiān)固的地板或平臺(tái)上，力求使儀器處于水平位置。（2）打開電源開關(guān)，將預(yù)洗平衡好的樣品對(duì)稱放置于轉(zhuǎn)頭的樣品架上，關(guān)閉機(jī)蓋。（3）旋轉(zhuǎn)定時(shí)按鈕設(shè)定離心時(shí)間，緩慢旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)按鈕，使儀器轉(zhuǎn)速達(dá)到要求。（4）待離心機(jī)完全停止轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)打開機(jī)蓋，取出離心樣品，再次關(guān)閉機(jī)蓋結(jié)束離心。（5）離心完畢后，將轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)回零位，關(guān)閉電源開關(guān)。注意：對(duì)于超速冷凍離心機(jī)，應(yīng)先設(shè)定離心溫度、速度和時(shí)間，待機(jī)腔溫度達(dá)到預(yù)定要求，再放入樣品。取出樣品后，待離心機(jī)機(jī)腔溫度與室溫相同時(shí)再關(guān)閉機(jī)蓋。3、電泳儀的使用：電泳儀一般分為自由界面電泳和區(qū)帶電泳兩類。區(qū)帶電泳需用各種類型的物質(zhì)作為支持物，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的是瓊脂糖凝膠電泳。所謂電泳，是指帶電粒子在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)，不同物質(zhì)由于所帶電荷及分子量的不同，因此在電場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)速度不同，根據(jù)這一特征，應(yīng)用電泳法便可以對(duì)不同物質(zhì)進(jìn)行定性或定量分析，或?qū)⒁欢ɑ旌衔镞M(jìn)行組分分析或單個(gè)組分提取制備。電泳儀正是基于上述原理設(shè)計(jì)制造的。使用方法：（1）按電源開關(guān)，同時(shí)系統(tǒng)初始化，蜂鳴4聲，設(shè)置常設(shè)置，屏幕轉(zhuǎn)成參數(shù)設(shè)置狀態(tài)。（2）設(shè)置工作程序，用鍵盤輸入新的工作程序。（3）設(shè)置各參數(shù)無誤后，按“啟動(dòng)”，啟動(dòng)電泳儀輸出程序，在顯示屏狀態(tài)欄中顯示start，并蜂鳴4聲，提醒操作者電泳儀將輸出高電壓，注意安全，之后逐漸加壓至設(shè)置值，同時(shí)在狀態(tài)欄中顯示“run”，并不斷閃爍兩個(gè)高壓符號(hào)，在狀態(tài)下方，顯示實(shí)驗(yàn)的工作時(shí)間。（4）電泳結(jié)束，儀器顯示“end”，并連續(xù)蜂鳴提醒，此時(shí)可按一鍵止鳴。4、PCR儀的使用：（1）開機(jī)：打開開關(guān)，視窗上顯示“selftest”，顯示10秒后，run-enter菜單，準(zhǔn)備執(zhí)行程序。（2）放入樣本管，蓋緊蓋子。（3）如要執(zhí)行已經(jīng)編好的程序，直接按“proceed”，用箭頭鍵選擇已儲(chǔ)存的程序，按“proceed”，則屏幕顯示：按“proceed”選擇enable,則開始執(zhí)行程序。（4）其它：用“pause”可以暫停一個(gè)運(yùn)行的程序，再按一次繼續(xù)程序。用“Stop”或“Cancel”可停止運(yùn)行的程序。如何設(shè)置一個(gè)PCR體系：一般分為8步：（1）預(yù)變性：可用94～95℃，2～10min，一般用5min。（2）變性：一般用94℃，30s~2min，一般45s~1min。（3）退火：溫度自定，30s~2min。（4）延伸：70～75℃，一般72℃，對(duì)于<2kb,<1min;>2kb,每增加1kb加1min。（5）循環(huán)數(shù)：一般25～35（6）最終延伸：72℃，5～15min。（7）保存：10℃，時(shí)間設(shè)為0。（8）END。實(shí)驗(yàn)二聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的原理與技術(shù)，了解聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的具體操作過程。二、實(shí)驗(yàn)原理聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction)，簡(jiǎn)稱PCR，是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段?？煽醋魃矬w外的特殊DNA復(fù)制。PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性—退火—延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTPs為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性—退火—延伸三過程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～三、儀器、材料與試劑1、儀器熱循環(huán)儀（PCR儀）、2-8℃冰箱、-20℃或-80℃冰箱、臺(tái)式離心機(jī)、移液器（覆蓋1-1000μ消耗品：一次性手套、PCR管等2、試劑1、引物：設(shè)計(jì)原則見附注。2、酶：PCR所用的酶主要有兩種來源：Taq和Pfu。分別來自兩種不同的噬熱菌。其中Taq擴(kuò)增效率高但易發(fā)生錯(cuò)配。Pfu擴(kuò)增效率低但有糾錯(cuò)功能。所以實(shí)際使用時(shí)根據(jù)需要必須做不同的選擇3、dNTPs4、模板：模板即擴(kuò)增用的DNA，可以是任何來源，但有兩個(gè)原則，第一純度必須較高，第二濃度不能太高以免抑制。5、緩沖液（其中需要Mg2+)：緩沖液的成分最為復(fù)雜，除水外一般包括四個(gè)有效成分：緩沖體系，一般使用HEPES或MOPS緩沖體系；一價(jià)陽離子，一般采用鉀離子，但在特殊情況下也可使用銨根離子；二價(jià)陽離子，即鎂離子，根據(jù)反應(yīng)體系確定，除特殊情況外不需調(diào)整；輔助成分，常見的有DMSO、甘油等，主要用來保持酶的活性和幫助DNA接觸纏繞結(jié)構(gòu)。四、實(shí)驗(yàn)操作1、標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系10×擴(kuò)增緩沖液2.0μL

dNTPs（10mM）0.4μL引物1（10μm）1.0μL

引物2（10μm）1.0μL

模板DNA0.1～2μg

TaqDNA聚合酶（5U/μl）0.2μL

Mg2+(25mM)1.2μLddH2OXμL總體積20μL將上述試劑在PCR管中仔細(xì)混勻，盡量避免產(chǎn)生氣泡，置于離心機(jī)上迅速離心片刻。2、PCR反應(yīng)條件：在PCR儀上設(shè)定以下程序：95℃變性5min194℃變性1min50℃退火30-60s30個(gè)循環(huán)72℃延伸2min72℃延伸10min將樣品置于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增3、反應(yīng)完成后，取5-10μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。剩余樣品置于-20℃【圖例】實(shí)驗(yàn)三水平式瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)DNA的純度與分子一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

學(xué)習(xí)水平式瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度、構(gòu)型、含量和分子量大小。二、實(shí)驗(yàn)原理

瓊脂糖凝膠電泳是重組DNA研究中常用的技術(shù)，是一種非常簡(jiǎn)便、快速、最常用的分離純化和鑒定核酸的方法。帶電荷的物質(zhì)在電場(chǎng)中的定向運(yùn)動(dòng)稱為電泳，核酸分子是兩性解離分子，在pH8.0時(shí)，DNA分子帶負(fù)電荷在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。采用瓊脂糖凝膠介質(zhì)作為電泳支持物，不同大小、不同形狀和不同構(gòu)象的DNA分子在相同的電泳條件下（如凝膠濃度、電流、電壓、緩沖液等），有不同的遷移率，所以可通過電泳使其分離。凝膠中的DNA可與熒光染料溴化乙錠（EB）結(jié)合，在紫外燈下可看到熒光條帶，籍此可分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

三、儀器、材料、試劑

1、儀器（1）電泳裝置：電泳儀、水平電泳槽、梳子、制膠槽（2）紫外觀察：凝膠成像系統(tǒng)（3）小型離心機(jī)2、材料瓊脂糖（Agarose）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、硼酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、溴酚藍(lán)、蔗糖、DNAMarker、溴化乙錠（EB▲有劇毒）稱量紙、容量瓶、瓷盤、一次性手套、取液器、三角瓶、量筒（100mL）、滅菌槍頭（10uL）、膠帶

3、試劑配制（1）50×TAE（pH8.0）（電泳緩沖液）1000ml242gTRIS57.1ml冰醋酸100ml

0.5mol/LEDTA加水至1000ml，貯存?zhèn)溆茫?）凝膠上樣緩沖液（6×Loadingbuffer）（指示劑）100ml

0.25%溴酚藍(lán)0.25%二甲苯青FF40%（w/v）蔗糖水溶液（3）10mg/mlEB1.0g溴乙錠100ml三蒸水

四、實(shí)驗(yàn)步驟1、準(zhǔn)備膠床將合適大小的膠床用醫(yī)用膠帶封嚴(yán)兩端，或?qū)⒛z床放置于制膠器中，卡緊。在膠槽一端放置好合適大小及厚度的梳子，放置于一平整的平面上，待用。2、制膠（0.8%瓊脂糖凝膠）（1）稱取0.16g瓊脂糖置于三角瓶中，加入20ml1×TAE緩沖液。（2）微波爐加熱，煮沸、振搖，反復(fù)加熱、振搖2-3次，使瓊脂糖充分融化（注意觀察不要把凝膠煮干）。（3）待膠冷卻至60℃左右時(shí)，將融化的瓊脂糖凝膠小心地倒入制備好的膠床中（注意不要產(chǎn)生氣泡），讓凝膠自然冷卻至完全凝固（約需要20-30分鐘）。（4）小心向上方拔出梳子，避免前后左右搖晃，以防破壞膠面及加樣孔去掉制膠槽兩邊的膠帶，小心將膠和膠床放入電泳槽中，樣品孔在陰極端。（5）向電泳槽中加入1×TAE電泳緩沖液，液面高于膠面約1-2mm。3、上樣電泳（1）取2μl上樣緩沖液（Loadingbuffer）于Parafilm上，加2μl電泳緩沖液與2μl樣品DNA反復(fù)吹吸，混勻。（2）槍頭垂直伸入液面下膠孔中，小心上樣于孔中（注意不要捅破膠孔）。（3）打開電泳儀電源，調(diào)整電壓、電流，開始電泳；電泳開始以正、負(fù)極鉑金絲有氣泡出現(xiàn)為準(zhǔn)。（4）根據(jù)指示劑遷移的位置，判斷是否中止電泳。切斷電源后，取出凝膠。（5）凝膠取出后于含EB的溶液中染色20分鐘（注：可在制膠步驟的第4步中倒膠前少量滴入一滴EB溶液，那么本步驟可省略）。

4、凝膠紫外觀察：

染色后的凝膠取出于紫外監(jiān)測(cè)儀或凝膠成像系統(tǒng)中觀察，照相，保存，記錄結(jié)果。▲附注影響DNA片段瓊脂糖電泳的幾個(gè)因素：1、DNA分子的大?。壕€性DNA分子的遷移率與其分子量的對(duì)數(shù)值成反比。2、瓊脂糖濃度：一定大小的DNA片段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中的遷移率是不相同的。相反，在一定濃度的瓊脂糖凝膠中，不同大小的DNA片段的遷移率也是不同的。若要有效地分離不同大小的DNA，應(yīng)采用適當(dāng)濃度的瓊脂糖凝膠。瓊脂糖凝膠濃度（%）1.51.752.0可分辨的線性DNA片段大?。╧b）5-600.8-100.4-60.2-40.2-30.1-33、DNA分子的形態(tài)：在同一濃度的瓊脂糖凝膠中，超螺旋DNA分子遷移率比線性DNA分子快，線性DNA分子比開環(huán)DNA分子快。4、電流強(qiáng)度：每厘米凝膠電壓不超過5V，若電壓過高分辨率會(huì)降低，只有在低電壓時(shí)，線性DNA分子的電泳遷移率與所用電壓成正比。考核與評(píng)分（一）實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)(20分)1.能正確地了解實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、要求、?shí)驗(yàn)原理/4分2.對(duì)儀器操作要領(lǐng)、使用注意事項(xiàng)熟悉/5分3.合理地?cái)M定實(shí)驗(yàn)方案及步驟/5分4.記錄表格正確/3分5.正確地回答考查題/3分（二）實(shí)驗(yàn)操作（40分）1.駕馭實(shí)驗(yàn)的能力，思路清晰，有條理/5分2.正確使用儀器及排除故障/4分3.恰當(dāng)?shù)臅r(shí)機(jī)進(jìn)行測(cè)量/3分4.獨(dú)立操作能力/8分5.用所學(xué)知識(shí)解決實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的實(shí)際問題/4分6.觀察現(xiàn)象的能力，尤其是異?，F(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)/3分7.創(chuàng)新意識(shí)：與教師積極探討實(shí)驗(yàn)，能對(duì)實(shí)驗(yàn)提出新見解、改進(jìn)建議/4分8.協(xié)作能力：能分工合作，在需要的時(shí)候能與同學(xué)進(jìn)行相互討論、密切配合/3分9.實(shí)驗(yàn)素養(yǎng)：尊重師長(zhǎng)，遵守實(shí)驗(yàn)規(guī)則，按照實(shí)驗(yàn)儀器規(guī)定條件整理儀器/3分1