GBT 28630.2-2012 白斑綜合征(WSD)診斷規(guī)程 第2部分套式PCR檢測法

第2部分：套式PCR檢測法I 第1部分：核酸探針斑點雜交檢測法 第3部分：原位雜交檢測法 本部分為GB/T28630的第2部分。GB/T28630.4—2012白斑綜合征(WSD)診斷規(guī)程第4部分：組織病理學診斷法24.1210μmol/L引物F1:5'-ACTACTAACTTCAGCCTATCTAG-3',外側正向引物wSSVDNA的1447bp產物，-20℃保存。類動物DNA中8481p的片段，-20℃保存類動物DNA中84sbp的片毀4.27陽性對照為已知受WSSV感染且PCR結果顯示明顯陽性結果的wssyDNA模板，-20℃4.28陰性對照為已知未受wSSV感染且PCR結果顯示陰性結果的對蝦組織DNA模板，-20℃5.6手掌型離心機：用于PCR后區(qū)對0.2mLPCR管的離心，塑料轉頭，轉速2000r/min~350μL體系10×PCR緩沖液(無Mg2+)1×PCR緩沖液(無Mg2+)氯化鎂溶液(25mmol/L)TaqDNA聚合酶(5U/μL)100份反應預混物總體積表2100份第二步PCR的反應預混物所需試劑組成25pL體系10×PCR緩沖液(無Mg2+)1×PCR緩沖液(無Mg2+)氯化鎂溶液(25mmol/L)10pmol/L引物F24表2(續(xù))50μL體系TagDNA聚合酶(5U/μL)100份反應預混物總體積注：25pL體系模板量2.56.2.4將上述待檢樣品放入滅菌1,m微離食重應避免各樣品回的交叉房染，所有非一次性6.3.2在樣品剪碎后加入抽提緩沖液500pL,用研磨棒充分研磨37℃溫浴1h。6.3.8用70%乙醇洗滌沉淀2次，每次10000r/min離心5min,小心傾去上清，最后沉淀于室溫56.5.1第一步PCR6.6.1.2將凝膠液緩緩倒入設置好樣孔梳和防漏條/套的水平放置的凝膠船，膠液厚度0.6cm~6際測量的結果允許有1%～3%的誤差。問題排除十足類動物樣品848bp處有條帶。被檢生物樣品照無任何條帶；帶，陰性對照和空白對照無任何條帶。陽性樣品第一步PCR后在1447bp處有條帶或第二步PCR后在941bp處有條帶。陰性樣品第一步PCR后在1477bp處無條帶且第二步PCR后在941bp處無條帶7表3(續(xù))結果判讀及原因分析問題排除陽性對照有條帶，但Marker沒有影像以及PCR程序是否正確陰性對照組在1447bp或941bp處有條區(qū)的微量移液器跑電泳更換試劑禁止從PCR后區(qū)到PCR前區(qū)的交流，禁止從電泳區(qū)到PCR操作區(qū)物樣品中無任何條帶(包括無848bp條帶)DNA不純致使PCR抑制物用OD?so/OD?so比值來確定。其可見1447bp條帶，則記錄該樣品品出現(xiàn)較多雜帶或明顯的彌散區(qū)出現(xiàn)非特異性擴增做好熱啟動操作。樣品先要加或Mg2+濃度差異佳Mg2+離子濃度8表3(續(xù))問題排除中30min后再觀察結果重新制作瓊脂糖凝膠片電極顛倒或電泳時間過長重新配置溴化乙錠(EB)溴化乙錠(EB)有毒，試劑的操作和廢棄物的處理按附錄B的規(guī)9試劑配方溶解后加入約42m袁鹽酸調口時接近3.0,冷卻至室溫，再用5mol/L鹽酸調整pH至8.0。99加熱至68℃助溶，加入幾滴濃鹽酸調節(jié)溶液的pH至7.2,加水定容至100mL。SDS微細晶粒易于擴散，稱量時要戴面罩，稱量完畢后要清除殘留在稱量工作臺區(qū)和天平上蛋白酶KA.9酚-三氯甲烷-異戊醇(25:24:1)在500/mL永中加入室溫亡存置于聚丙烯塑料瓶酸電泳區(qū)。潔凈區(qū)和樣品區(qū)屬于PCR前區(qū)，擴增區(qū)和電泳區(qū)屬于PCR后區(qū)。其中潔凈區(qū)專用于配制和觸任何PCR產物；擴增區(qū)專用于進行PCR循環(huán)和第二步PCR于PCR產物的檢測。只允許從潔凈區(qū)→樣品區(qū)→擴增區(qū)→電泳區(qū)的單向物流，同時PCR后區(qū)應盡可B.2含PCR反應產物的材料膠和手套等應用3.0×10-3濃度的含氯消毒劑溶液處理后，再以塑料袋密封包裝后丟棄，含有PCR反應產物的溶液應加入含氯消毒劑達3.0×10-3的濃度，經處理10min以上后方可直接倒入下水道口。只能密封保存在PCR后區(qū)。加入足量的水使溴化乙錠的濃度降低至0.5mg/mL以下。加入1倍體積的0.5mol/L高錳酸鉀，小心混勻后再加1倍體積的2.5mol/L鹽酸。小心混勻，于室溫放置數(shù)小時。加入1倍體積的每100mL溶液中加入100mg粉狀活性炭。于室溫放置1h,不時搖動。用Whatmanl號濾紙過有強腐蝕性，操作時要穿戴實驗服及手套。應避免吸入或食入。直接的皮膚接觸應立即用大量清B.5電泳電泳時會產生100V～600V的直流電壓，同時電極處會產生大量的微小氣泡。應蓋好電泳槽上蓋以避免氣泡炸裂導致PCR產物的污染和有毒試劑的揮發(fā)。避免接觸電極及液面以防觸電。B.6紫外線(資料性附錄)白斑綜合征(WSD)套式PCR檢測產物序列121TCCCATACAAAGTCATCTTTCATGGACAACAT241ATGTCCCACAAGCAAAATTGTAACTGCCCC301GATAACGAGCATCTGGTATCCTCTTT421ATGTCCAAGATCGATTCTAGAGTAAC481ACTGA