《飼料原料中伏馬毒素的快速篩查 膠體金快速定量法-江西省地方標(biāo)準(zhǔn)編制說明》

一、標(biāo)準(zhǔn)制定意義

（一）介紹

伏馬毒素（Fumonisin，F(xiàn)B）是由鐮刀菌屬在一定的溫度和濕度下產(chǎn)生的水溶性代謝產(chǎn)

物，是一類由不同的多氫醇和丙三羧酸組成的結(jié)構(gòu)類似的雙酯化合物。到目前為止，發(fā)現(xiàn)的

伏馬毒素有FA1、FA2、FB1、FB2、FB3、FB4、FC1、FC2、FC3、FC4和FP1共11種，其中

60%以上是FB1，其毒性也最強。伏馬毒素可以引起人畜急性中毒和慢性毒性，并具有種屬

特異性和器官特異性，不同的動物產(chǎn)生的疾病不同，相應(yīng)的耐受限量也有很大差別。研究發(fā)

現(xiàn)高濃度的FB1可導(dǎo)致各種家畜和試驗動物出現(xiàn)種屬特異性的急毒癥狀，如馬腦白質(zhì)軟化綜

合征、豬肺水腫和羊肝腎病變等，現(xiàn)在還發(fā)現(xiàn)FB1可能與人的食管癌和肝癌發(fā)生有關(guān)。伏馬

毒素尤其是FB1飼料污染的情況在世界范圍內(nèi)普遍存在，且對糧食作物的污染情況較嚴(yán)重，

其污染的飼料主要為以玉米為原料的飼料。

考慮到伏馬毒素對人體健康的危害性，部分發(fā)達(dá)國家和地區(qū)已經(jīng)對玉米制品中的伏馬毒

素限量指標(biāo)建立了標(biāo)準(zhǔn)。歐盟規(guī)定了玉米和玉米制品中伏馬毒素的限量（以FB1+FB2計）；

2001年美國食品與藥物管理局（FDA）發(fā)布了供人類食用的玉米和玉米產(chǎn)品伏馬毒素的最高

限量指導(dǎo)性公告，規(guī)定人類食用玉米中伏馬毒素最高限量為2mg/kg；同時，F(xiàn)DA的畜牧醫(yī)學(xué)

中心（CVM）也發(fā)布了動物飼料中伏馬毒素的最高限量指導(dǎo)性公告，規(guī)定其限量范圍為1～

50mg/kg。我國對伏馬毒素在糧谷類食品中的分布情況和檢測方法也做了大量研究，但食品

中伏馬毒素限量標(biāo)準(zhǔn)尚未出臺；但即將頒布的新的《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》增加了伏馬毒素的限量。

伏馬毒素的檢測方法主要有高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法、膠體金免疫層析法等。以往

利用膠體金免疫快速檢測法可對伏馬毒素樣品進(jìn)行定性分析，適用于陽性樣品的初篩，不能

準(zhǔn)確定量。本標(biāo)準(zhǔn)項目是通過化學(xué)合成法制備伏馬毒素人工抗原，利用此抗原免疫實驗動物

制備伏馬毒素B1、B2、B3單克隆抗體，基于此原料基礎(chǔ)上開發(fā)伏馬毒素快速檢測試紙條，

再通過膠體金讀數(shù)儀進(jìn)行飼料樣品中伏馬毒素（B1、B2、B3）總量的定量分析。本標(biāo)準(zhǔn)有助

于提高飼料樣品檢測、監(jiān)測效率，降低成本，保護(hù)環(huán)境，保障從業(yè)人員健康安全。

（二）背景

據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）統(tǒng)計，全世界每年谷物產(chǎn)量的25%受到真菌毒素不同程度的

污染。隨著飼料工業(yè)的快速發(fā)展，近年來，中國的飼料也受到霉菌污染的嚴(yán)重挑戰(zhàn)。自2006

年以來，玉米等飼料原料價格普遍上漲，致使很多飼料企業(yè)及養(yǎng)殖戶使用低質(zhì)飼料原料，加

上近年來氣候的變化，降雨量增加，進(jìn)一步加重了飼料原料中真菌毒素的污染。而由于飼料

原料和配合飼料中多種真菌毒素同時存在，在食用油等產(chǎn)品及牛奶中真菌毒素污染也比較嚴(yán)

重。在世界許多地方，目前真菌毒素已構(gòu)成重要的食品安全問題。

真菌毒素對人類和動物健康可產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，這一認(rèn)識導(dǎo)致了許多國家在近幾十年來

制定了諸多有關(guān)食品和飼料中真菌毒素的法規(guī)，以保護(hù)人類的健康，并保障生產(chǎn)者和貿(mào)易商

的經(jīng)濟利益。隨著全球經(jīng)濟一體化的進(jìn)程，類似真菌毒素等涉及安全衛(wèi)生項目的限量標(biāo)準(zhǔn)，

越來越多地被利用為貿(mào)易保護(hù)主義中非關(guān)稅壁壘的重要手段。因此，為了保證食品安全，保

障消費者的健康，為了打破國外的技術(shù)壁壘，同時在合理有利的前提下，更多地樹立我國的

技術(shù)性壁壘，開展飼料中真菌毒素的檢測并建立標(biāo)準(zhǔn)方法是有效的方法之一。目前國內(nèi)應(yīng)用

標(biāo)準(zhǔn)檢測方法大多為儀器方法，所需儀器設(shè)備昂貴，不利于進(jìn)行廣泛推廣，并且限制了很多

檢測單位高效、廣泛地開展檢測工作。建立符合中國國情的快速檢測方法標(biāo)準(zhǔn)，具有檢測快

速、簡便、靈敏、成本低等優(yōu)點，為打開市場并占領(lǐng)市場提供了先決條件。

（三）限量標(biāo)準(zhǔn)、檢測方法及研究現(xiàn)狀

1、限量標(biāo)準(zhǔn)

由于付馬毒素B1能夠引起馬腦白質(zhì)軟化癥、豬肺水腫綜合征以及大鼠肝癌等疾病，還

可能與人類食管癌有關(guān)，而且目前我國玉米種付馬毒素的污染狀況具有普遍性，因此對于付

馬毒素的監(jiān)控是很有必要的。

表1我國飼料中付馬毒素限量標(biāo)準(zhǔn)

產(chǎn)品名稱限量/(μg/kg)

玉米及其加工產(chǎn)品、玉米酒糟類產(chǎn)品、玉米青貯飼料和玉米秸稈≤60

犢牛、羔羊精料補充料，家禽濃縮飼料和家禽配合飼料≤20

馬、兔精補料，豬濃縮料，豬、兔、馬配合飼料≤5

其它反芻動物精補料≤50

魚配合飼料≤10

其它配合飼料≤3

2、檢測方法及研究現(xiàn)狀

真菌毒素的檢測方法主要有兩種，一是將色譜技術(shù)作為基礎(chǔ)的物理化學(xué)檢測方法，包括

高效液相色譜法（HPLC）和氣相色譜法（GC）等，而薄層層析法（TLC）由于操作過程太復(fù)

雜，國際上近些年使用這種方法檢測真菌毒素的情況越來越少；二是免疫化學(xué)檢測法，主要

指免疫親和柱法（IAC）以及酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）等。

GC可同時檢測多種真菌毒素且檢測限較低，但仍存在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不理想、測定

時需要進(jìn)行衍生化、上一次進(jìn)樣待測物品滯留、重復(fù)進(jìn)樣變異系數(shù)大使得重現(xiàn)性較差等一系

列問題。HPLC法雖可精確進(jìn)行定性定量測定，但是樣品前處理較為繁瑣、儀器昂貴而成本

高，同時需要專門的技術(shù)操作人員，因而一般用于大型企業(yè)、科研院校和專業(yè)檢測機構(gòu)的定

量分析。ELISA檢測黃曲霉毒素，樣品前處理步驟簡單且可實現(xiàn)定量化，但這種生物學(xué)方法，

受環(huán)境因素影響大，所用抗體和酶特別容易發(fā)生變質(zhì)，如今市場上的同一物質(zhì)試劑盒檢測結(jié)

果差異性較大，穩(wěn)定性還有待提高。

相比較而言，膠體金免疫層析法無需大型儀器、所需輔助試劑少、交叉反應(yīng)率低、試紙

條易于保存且可單份測定，避免了分析步驟繁瑣、成本高等缺點，而且因其檢測更快速、操

作更簡單，測試人員無需進(jìn)行專業(yè)培訓(xùn)，所以更適合食品安全快速檢測行業(yè)的快速檢驗和基

層檢測，尤其是野外和偏遠(yuǎn)地區(qū)人員現(xiàn)場應(yīng)用此項技術(shù)十分方便。

（四）制定標(biāo)準(zhǔn)的必要性和意義

飼料是畜牧生產(chǎn)的物質(zhì)基礎(chǔ)，但其中廣泛存在的真菌及真菌毒素，可引起畜禽生產(chǎn)力下

降、繁殖機能障礙，嚴(yán)重者可引起死亡；同時，真菌毒素還可在畜禽產(chǎn)品中殘留，給人類健

康安全帶來極大隱患，也會給畜牧業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失，因此，檢測飼料原料的真菌毒素

是糧食收購、飼料生產(chǎn)中必不可少的環(huán)節(jié)。

鑒于傳統(tǒng)檢測方法的專業(yè)性要求高和成本昂貴的缺點，膠體金免疫層析技術(shù)定量檢測條

已經(jīng)可以準(zhǔn)確定量，作為一種快速篩查手段，可以有效地篩除真菌毒素污染的農(nóng)產(chǎn)品，防止

毒素中毒事件的發(fā)生，保護(hù)人民的身體健康。同時，定量分析便于將檢測結(jié)果與國家限量對

比，有助于監(jiān)管部門快速有效地進(jìn)行監(jiān)管，同時有助于企業(yè)內(nèi)部更好地進(jìn)行質(zhì)量控制，進(jìn)而

減少食物源T-2毒素污染對廣大群眾生命健康的威脅。

我國已經(jīng)加入WTO，我國農(nóng)產(chǎn)品已面臨國際和國內(nèi)兩個市場，為我國農(nóng)產(chǎn)品（勞動密集

型）進(jìn)入國際市場提供了很好的機遇，但國際上十分重視農(nóng)產(chǎn)品的安全問題，而農(nóng)產(chǎn)品易于

被真菌污染，可能存在T-2毒素等真菌毒素殘留問題，這已成為影響出口創(chuàng)匯的最大制約因

素。由于毒素殘留超標(biāo)，引起外國拒收，退貨、扣留、索賠、撤消合同等事件經(jīng)常發(fā)生，給

我國農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)者造成很大損失，并影響了我國農(nóng)產(chǎn)品的形象。為了從源頭保證農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量，

提高我國農(nóng)產(chǎn)品的競爭力，研究T-2毒素快速檢測技術(shù)并制訂相應(yīng)的檢測方法標(biāo)準(zhǔn)是非常必

要的。

二、標(biāo)準(zhǔn)制定過程

《飼料原料中伏馬毒素的快速篩查膠體金免疫層析法》標(biāo)準(zhǔn)由江西省獸藥飼料監(jiān)察所、

中檢環(huán)貿(mào)生物技術(shù)（北京）有限公司、雙胞胎（集團）股份有限公司、江西正邦科技股份有

限公司負(fù)責(zé)起草編寫。根據(jù)國家有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制定和修訂工作的要求，標(biāo)準(zhǔn)起草單位在《飼料原

料中伏馬毒素的快速篩查膠體金免疫層析法》的起草編制過程中，主要工作包括以下幾個

方面：

（1）詳細(xì)查閱了國內(nèi)、國外有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)專業(yè)期刊上發(fā)表過的參考文獻(xiàn)等技術(shù)資料，

并對這些資料進(jìn)行了詳細(xì)的對比，從方法的先進(jìn)性、可靠性和實用性等幾個方面考慮，選取

了幾個代表性的參考資料作為標(biāo)準(zhǔn)起草中的主要技術(shù)參考文本。

（2）及時購置相關(guān)的實驗試劑、標(biāo)準(zhǔn)品和其他材料；摸索不同條件對方法進(jìn)行最優(yōu)化，

最終確定了最佳的檢測方法。

（3）開展飼料原料膠體金快速檢測方法的試驗，選取相關(guān)飼料原材料，用膠體金免疫

層析法進(jìn)行試驗和驗證，確保本檢測方法能夠靈敏、特異、準(zhǔn)確地檢測出飼料原料中伏馬毒

素的含量。如：方法的靈敏度，選取多份陰性樣品平行測定，以均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差的方法確

認(rèn)檢測限符合要求；方法的準(zhǔn)確率，通過對經(jīng)驗證的陽性樣品進(jìn)行檢測，得到本檢測方法的

標(biāo)準(zhǔn)偏差及變異系數(shù)，確保本方法的檢測結(jié)果可靠；原料中伏馬毒素殘留。方法的批間穩(wěn)定

性，選取多份確證濃度的陽性樣品進(jìn)行不同批次的平行測定，計算批間變異系數(shù)，確保伏馬

毒素測定的批間穩(wěn)定性。

（4）在技術(shù)指標(biāo)完成試驗工作之后，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)的格式，起草編寫標(biāo)準(zhǔn)文本內(nèi)容和

編制說明內(nèi)容。

三、標(biāo)準(zhǔn)制定依據(jù)

本標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則》

和GB/T20001.4-2009《標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則第4部分：試驗方法分析》的規(guī)定進(jìn)行編制的。

四、標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)內(nèi)容和技術(shù)指標(biāo)的論證

（一）技術(shù)原理

本方法應(yīng)用了競爭疫層析原理。使用一個能夠特異性識別某一分子或某分子家族的抗體

和配對的抗原，將抗體標(biāo)記膠體金顆粒，將配對的抗體噴涂到反應(yīng)膜上做檢測線。檢測過程

中，如果樣品中含有待檢測物質(zhì)，則待檢測物質(zhì)首先與膠體金顆粒標(biāo)記的抗體結(jié)合形成復(fù)合

物，之后沿反應(yīng)膜向吸水紙方向流動，到達(dá)檢測線時，因為待檢測分子表面的表面決定簇大

部分已經(jīng)被抗體占據(jù)，少量與檢測線處的抗原結(jié)合，形成比較淺的色帶，待檢測物質(zhì)-膠體

金顆粒標(biāo)記的抗體結(jié)合形成復(fù)合物繼續(xù)沿反應(yīng)膜流動，到達(dá)質(zhì)控線后被質(zhì)控線處的膠體金顆

?？贵w所捕獲，形成清晰可見的色帶。反應(yīng)完成后，使用讀數(shù)儀讀取檢測區(qū)域和質(zhì)控區(qū)域的

顏色強度信號，根據(jù)內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中付馬毒素的含量。

（二）適用范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了膠體金法測定谷物及其制品中伏馬毒素的條件和詳細(xì)分析步驟。

本方法適用于玉米及其他谷物中伏馬毒素快速定量篩查的測定，檢測限為250μg/kg。

（三）關(guān)于樣品制備的要求

理論上講樣品顆粒的大小與樣品的均勻性以及毒素的提取效率有關(guān)，當(dāng)樣品細(xì)度不足

20目時，真菌毒素的提取效率較低，因此國家標(biāo)準(zhǔn)方法中真菌毒素檢測的制樣一般都要求

制備至少500g，全部通過20目篩，本行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)直接采用，從測試數(shù)據(jù)看，能夠滿足方法需

求。

（四）方法精密度及準(zhǔn)確度

采用800μg/kg、2000μg/kg和3000μg/kg三個濃度水平的陽性樣品，每個濃度水平測

定10次，重復(fù)測定的變異系數(shù)在3.20%～4.76%，平均變異系數(shù)為4.22%，結(jié)果見表2。

表2飼料樣品中伏馬毒素檢測數(shù)據(jù)分析表（濃度：μg/kg）

編號測定結(jié)果

參考濃度

80020003000

（μg/kg）

185021003100

290020003000

380021003100

480022003200

590020003000

685023003200

785020003300

880021003100

985021003100

1080020003000

平均結(jié)果

84020903110

（μg/kg）

標(biāo)準(zhǔn)偏差39.4499.4499.44

變異系數(shù)（%）4.704.763.20

（五）檢測限

取20份陰性樣品平行測定，結(jié)果均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差為89.12，因此本方法的檢測限為

89μg/kg，陰性樣品結(jié)果見表3。

表3陰性飼料樣品伏馬毒素測定結(jié)果分析表（濃度：μg/kg）

樣品編號測定結(jié)果

10

20

30

450

50

60

750

80

90

100

1150

1250

130

140

150

160

1750

180

190

200

平均結(jié)果（μg/kg）12.5

標(biāo)準(zhǔn)偏差22.21

檢測限（μg/kg）89.12

（六）批間穩(wěn)定性

采用800μg/kg左右濃度水平的陽性樣品，不得低于6個批次，每個批次測定不低于2

次，批內(nèi)測定取平均值，通過批間變異系數(shù)來表達(dá)，變異系數(shù)應(yīng)≤25%。經(jīng)多批次平行測定，

次方法符合變異系數(shù)要求，批間穩(wěn)定性良好，結(jié)果見表4。

表4飼料樣品伏馬毒素批間穩(wěn)定性測定數(shù)據(jù)分析表（濃度：μg/kg）

測定結(jié)果批次內(nèi)平均參考濃度批次間平均變異系數(shù)

批次號標(biāo)準(zhǔn)偏差

（μg/kg）值（μg/kg）（μg/kg）值（μg/kg）（%）

850

1850

850

800

2800

800

850

3825

800

80082515.811.92

800

4825

850

800

5825

850

850

6825

800

（七）HPLC和膠體金定量檢測條結(jié)果比對

隨機抽取小麥、大米、黃豆、玉米、豆粕、花生粕、DDGS樣品，用本方法和儀器方法

分別進(jìn)行檢測。儀器方法參考GB/T30955-2014《飼料中赭曲霉毒素A、B2、G1、G2的測定

免疫親和柱凈化-高效液相色譜》，對伏馬毒素的檢測限為10μg/kg，定量限為50μg/kg。

本方法的檢測限為250μg/kg。結(jié)果見表5。

表5儀器比對測定結(jié)果

樣品編號樣品類型HPLC結(jié)果（μg/kg）膠體金檢測條結(jié)果（μg/kg）

1245.48250

2小麥180.88200

3633.56650