藥物分析講稿：第十章 抗菌藥物的分析

第十章抗菌藥物的分析-PAGE1-第十章抗菌藥物的分析抗菌藥物是指對細菌具有抑制和殺滅作用的藥物，包括抗生素和合成抗菌藥(磺胺類、喹諾酮類等)。抗生素是指在低微濃度下即可對某些生物的生命活動有特異抑制作用的化學物質(zhì)的總稱。主要由微生物發(fā)酵、經(jīng)化學純化、精制和化學修飾等過程，最后制成適當制劑。根據(jù)化學結(jié)構(gòu)分類，通常習慣將抗生素分為β-內(nèi)酰胺類(青霉素類、頭孢菌素類)、氨基糖苷類(鏈霉素、慶大霉素、阿米卡星等)、四環(huán)素類(四環(huán)素、美他環(huán)素等)、大環(huán)內(nèi)酯類(紅霉素、螺旋霉素、羅紅霉素等)、多烯大環(huán)類(制霉菌素、兩性霉素B)、多肽類(多黏菌素、放線霉素等)、苯烴胺類(氯霉素等)、蒽環(huán)類(多柔比星、柔紅霉素等)和其他抗生素?？股嘏c化學合成藥物相比，有以下特點：(1)化學純度較低：有三多。即同系物多，如慶大霉素含有四個主要組分；異構(gòu)體多，如半合成β-內(nèi)酰胺抗生素均存在光學異構(gòu)體；降解物多，如四環(huán)素類存在脫水、差向異構(gòu)體；(2)活性組分發(fā)生變異：微生物的株菌的變化、發(fā)酵條件均可導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量發(fā)生變化，如組分的組成或比例的改變；(3)穩(wěn)定性差：抗生素分子結(jié)構(gòu)中通常含有活潑基團，而這些基團往往是抗生素的活性中心，如青霉素類、頭孢菌素類結(jié)構(gòu)中的β-內(nèi)酰胺環(huán)，鏈霉素結(jié)構(gòu)中的醛基等均具有穩(wěn)定性差的特點?？股氐馁|(zhì)量控制方法主要通過鑒別、檢查、含量(效價)測定三個方面來判斷其質(zhì)量的優(yōu)劣。由于抗生素類藥物的特點，其分析方法可分為微生物檢定法和化學及物理化學法。微生物檢定法：是以抗生素對微生物的殺傷或抑制程度為指標來衡量抗生素效價的一種方法。測定方法可分為稀釋法、比濁法和管碟瓊脂擴散法，后兩種為抗生素微生物檢定的國際通用方法。《中國藥典》采用管碟瓊脂擴散法，USP采用后兩種方法。微生物檢定法的優(yōu)點是靈敏度高、需用量小，測定結(jié)果直觀；測定原理與臨床應(yīng)用的要求一致，更能確定抗生素的醫(yī)療價值；而且適用范圍廣，既適用于較純的精制品，亦適用于純度較差的制品，對已知分子結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)不明確的抗生素均能適用。但該法有操作步驟繁多，測定時間長，誤差大等缺點?；瘜W及物理化學法：對于提純的、化學結(jié)構(gòu)已確定的抗生素可用此法測定。本類方法是根據(jù)抗生素的分子結(jié)構(gòu)的特點，利用其特有的化學或物理化學性質(zhì)而進行的。如果是利用某一類型抗生素的共同結(jié)構(gòu)的反應(yīng)，其測定結(jié)果往往只能代表藥物的總含量，并不一定能代表抗生素的效價。只有當本法的測定結(jié)果與生物效價吻合時，才能用于效價測定。該法操作簡便、省時、方法準確，并具有較高的專屬性?？股鼗钚员硎痉椒ǎ嚎股氐幕钚砸孕r表示，即指每毫升或每毫克中含有某種抗生素的有效成分的多少。用單位(U)或微克(ug)表示。各種抗生素的效價基準是人們?yōu)榱松a(chǎn)科研方便而規(guī)定的，如lmg青霉素鈉定為1670單位；lmg慶大霉素定為590單位；lmg硫酸卡那霉素定為670單位。一種抗生素有一個效價基準，同一種抗生素的各種鹽類的效價可根據(jù)其分子量與標準鹽類進行換算。例如，lmg青霉素鉀的單位(u)=1670×356.4／372.5=1598U。以上為抗生素的理論效價，實際樣品往往低于該理論效價。早期很多抗生素的質(zhì)量控制主要采用生物學方法。近年來，隨著對抗生素分子結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)了解的不斷深入，以及分離、分析方法的快速發(fā)展，化學、物理化學方法用于特定抗生素類分析的專屬性已很大程度上得到保證?；瘜W、物理化學方法正逐步取代生物學方法，成為抗生素類藥物測定方法的主流?！吨袊幍洹芳坝ⅰ⒚赖劝l(fā)達國家藥典對所收載抗生素類藥物的原料和制劑的含量測定方法很好地體現(xiàn)了這一變化趨勢。但對分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜、多組分的抗生素，生物學法仍然是首選的效價測定方法。本章主要討論β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、喹諾酮類藥物的物理、化學性質(zhì)，鑒別反應(yīng)、雜質(zhì)檢查以及含量測定的原理與方法。第一節(jié)β-內(nèi)酰胺類抗生素這類抗生素包括青霉素類和頭孢菌素類。它們的分子結(jié)構(gòu)中均含有β-內(nèi)酰胺環(huán)，因此該類抗生素統(tǒng)稱為β-內(nèi)酰胺類抗生素。一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)(一)結(jié)構(gòu)青霉素類和頭孢菌素類分子中都含有一個游離羧基和酰胺側(cè)鏈。青霉素類分子的母核為6-氨基青霉烷酸(6-APA)，頭孢菌素類的母核為7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)，它們分別由氫化噻唑環(huán)或氫化噻嗪環(huán)與β-內(nèi)酰胺環(huán)并合而成。R和R1的不同，構(gòu)成了不同的青霉素和頭孢菌素。代表性藥物有青霉素鈉、氨芐西林、阿莫西林、頭孢氨芐，頭孢唑啉等。(二)性質(zhì)1、酸性與溶解度青霉素類和頭孢菌素類分子中的游離羧基具有相當強的酸性(大多數(shù)青霉素的pKa在2.5～2.8之間)，能與無機堿或某些有機堿形成鹽。它們的堿金屬鹽易溶于水，而有機堿鹽卻易溶于甲醇等有機溶劑，難溶于水。青霉素類的堿金屬鹽水溶液遇酸則析出游離酸的白色沉淀。2、旋光性青霉素類分子中含有三個手性碳原子，頭孢菌素類分子中含有兩個手性原子，故都具有旋光性。利用這一性質(zhì)，可對這兩類藥物進行定性和定量分析。3、紫外吸收特性青霉素類分子的母核無共軛系統(tǒng)，但其側(cè)鏈酰胺基團上R基如具有苯環(huán)或共軛系統(tǒng)，則可產(chǎn)生紫外吸收。如青霉素G在257nm、264nm波長處具有最大吸收。頭孢菌素類由于母核部分具有O=C?N?C=C結(jié)構(gòu)，R取代基具有苯環(huán)等共軛系統(tǒng)，故在260nm處有強紫外吸收。如頭孢呋辛鈉水溶液在274nm處有最大吸收。4、β-內(nèi)酰胺環(huán)的不穩(wěn)定性β-內(nèi)酰胺環(huán)是該類抗生素的結(jié)構(gòu)活性中心，其性質(zhì)活潑，是分子結(jié)構(gòu)中最不穩(wěn)定的部分，其穩(wěn)定性與含水量和純度有很大關(guān)系。干燥條件下青霉素類和頭孢菌素類藥物均穩(wěn)定，室溫下密封保存可貯存3年以上，但它們的水溶液很不穩(wěn)定，隨pH和溫度而有很大變化。青霉素水溶液在pH6～6.8時較穩(wěn)定。本類藥物可與酸、堿、青霉素酶、羥胺及某些金屬離子(銅、鉛、汞和銀)等作用，發(fā)生水解和分子重排，導(dǎo)致β-內(nèi)酰胺環(huán)的破壞而失去抗菌活性。青霉素的β-內(nèi)酰胺環(huán)被破壞或發(fā)生分子重排后。產(chǎn)生青霉噻唑酸、青霉酸、青霉醛、青霉胺、α-青霉噻唑?；u胺酸和青霉烯酸等一系列的降解產(chǎn)物。降解反應(yīng)如圖l0-l所示。二、鑒別試驗(一)色譜法(二)光譜法(三)鉀、鈉鹽的焰色反應(yīng)(四)呈色和沉淀反應(yīng)1、在稀鹽酸中生成白色沉淀青霉素鉀和青霉素鈉加水溶解后，加稀鹽酸2滴，即析出難溶于水的游離酸白色沉淀。這些沉淀能在乙醇、醋酸戊酯、三氯甲烷、乙醇或過量的鹽酸中溶解?！吨袊幍洹窊?jù)此對這兩種藥物進行鑒別。2、羥肟酸鐵反應(yīng)3、硫酸-硝酸呈色反應(yīng)4、與斐林試劑反應(yīng)本類藥物含有類似肽鍵結(jié)構(gòu)，可產(chǎn)生雙縮脲反應(yīng)，開環(huán)分解，使堿性酒石酸銅鹽還原顯紫色。5、特殊反應(yīng)利用R或R1基團的官能團反應(yīng)，可以對一些特定的抗生素進行鑒別。三、抗生素類藥物中高分子雜質(zhì)檢查四、含量測定青霉素類和頭孢菌素類的含量測定可采用微生物法和理化測定法。《中國藥典》多采用高效液相色譜法進行含量測定。第二節(jié)氨基糖苷類抗生素的分析本類抗生素都是以堿性環(huán)己多元醇為苷元與氨基縮合而成的苷，故稱為氨基糖苷類抗生素，其結(jié)構(gòu)具有許多共性。這類抗生素主要有鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、新霉素、阿米卡星、奈替米星、西索米星、依替米星。本章以鏈霉素和慶大霉素為例，討論它們的鑒別和檢查方法。一、鏈霉素(一)化學結(jié)構(gòu)與性質(zhì)1、化學結(jié)構(gòu)鏈霉素的結(jié)構(gòu)為一分子鏈霉胍和一分子鏈霉雙糖胺結(jié)合而成的堿性苷。其中鏈霉雙糖胺是由鏈霉糖與N-甲基-L-葡萄糖胺所組成。鏈霉胍與鏈霉雙糖胺間的苷鍵結(jié)合較弱，鏈霉糖與N-甲基-L-葡萄糖胺間的苷鍵結(jié)合較牢。2、性質(zhì)(1)溶解度：鏈霉素的硫酸鹽易溶于水，不溶于乙醇、三氯甲烷。(2)堿性：鏈霉素分子中有3個堿性中心(式中有*號處)，其中兩個鏈霉胍上的強堿性胍基(pKa=11.5)，第3個是葡萄糖胺上的甲氨基(pKa=7.7)。因此，可與無機酸或有機酸形成可溶于水的鹽，臨床上多用其硫酸鹽。(3)水解性：鏈霉素的水溶液以pH5～7.5最為穩(wěn)定，過酸或過堿條件下均易水解失效。由于鏈霉胍與鏈霉胺間的苷鍵要比鏈霉糖與甲基葡萄糖胺間的苷鍵弱得多，在酸性條件下，鏈霉素先水解為鏈霉胍和鏈霉雙糖胺，進一步得N-甲基-L-葡萄糖胺。弱堿性也能使鏈霉素水解為鏈霉胍及鏈霉雙糖胺，但隨后鏈霉糖部分分子重排為麥芽酚。生成麥芽酚是鏈霉素特有反應(yīng)。(4)紫外吸收：特性鏈霉素在230nm處有紫外吸收。(二)鑒別試驗1、麥芽酚反應(yīng)麥芽酚為α-甲基-β-羥基-γ-吡喃酮，是鏈霉素在堿性溶液中，鏈霉糖經(jīng)分子重排、環(huán)擴大形成六元環(huán)、然后消除N-甲基葡萄糖胺，再消除鏈霉胍所生成。麥芽酚可與鐵離子在微酸性溶液中形成紫紅色配位化合物。此反應(yīng)為鏈霉素的特有反應(yīng)。因此被中、日、美、英等國家藥典采用?！吨袊幍洹穼λ蛰d的硫酸鏈霉素的鑒別方法是：取本供試品約20mg，加水5ml溶解后，加氫氧化鈉試液0.3ml，置水浴上加熱5min，加硫酸鐵銨溶液(取硫酸鐵銨0.1g加0.5mol／L硫酸溶液5ml使溶解)0.5ml，即顯紫紅色。2、坂口反應(yīng)硫酸鏈霉素水溶液加氫氧化鈉試液水解生成鏈霉胍，鏈霉胍和8-羥基喹啉(或α-萘酚)作用，冷卻后加次溴酸鈉試液，生成橙紅色化合物。此為鏈霉素水解產(chǎn)物鏈霉胍的特有反應(yīng)?！吨袊幍洹凡捎迷摲椒▽α蛩徭溍顾丶白⑸溆昧蛩徭溍顾剡M行鑒別：取供試品約0.5mg，加水4ml溶解后，加氫氧化鈉試液2.5ml與0.1％8-羥基喹啉的乙醇溶液lrnl，放冷至約15℃，加次溴酸鈉試液3滴，即顯橙紅色。3、硫酸鹽反應(yīng)本類藥物多為硫酸鹽，利用硫酸鹽能與氯化鋇試液生成白色硫酸鋇沉淀，各國藥典對硫酸鏈霉素進行鑒別。4、茚三酮反應(yīng)鏈霉素具有氨基糖苷結(jié)構(gòu)，具有羥基胺類和α-氨基酸的性質(zhì)，可與茚三酮縮合成藍紫色縮合物：鑒別：取供試品水溶液(1→100)5ml，加茚三酮試液lml及吡啶0.5ml，加熱10min時，溶液呈紫色。5、N-甲基葡萄糖胺反應(yīng)鏈霉素經(jīng)水解，產(chǎn)生N-甲基葡萄糖胺，在堿性溶液中與乙酰丙酮縮合成吡咯衍生物，在對二甲氨基苯甲醛的酸性醇溶液(Ehrlich試劑)作用下，多羥基斷開，生成紅色縮合物：(三)有關(guān)物質(zhì)的檢查(四)含量測定《中國藥典》采用微生物檢定法測定鏈霉素原料及制劑的含量?！吨袊幍洹分袡z查方法如下：精密稱取本品適量，加滅菌水定量制成每1rnl中約含1000單位的溶液，照抗生素生物檢定法(附錄ⅨA)測定。二、慶大霉素第三節(jié)四環(huán)素類抗生素的分析四環(huán)素類抗生素在化學結(jié)構(gòu)上都具有氫化并四苯環(huán)，因此被稱為四環(huán)素類或四環(huán)素族。一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)(一)結(jié)構(gòu)四環(huán)素類抗生素是氫化并四苯的衍生物，由A、B、C、D四個環(huán)組成。母核上共有下列官能團：C-4位上的二甲胺基[-N(CH3)2]、C-2位上的酰氨基(-CONH2)、C-10位的酚羥基(-OH)；有兩個含有酚基和烯醇基的共軛雙鍵系統(tǒng)(結(jié)構(gòu)式中虛線內(nèi)所示部分)。分子中的取代基R、R1、R2及R3不同，構(gòu)成不同的四環(huán)素。常見四環(huán)素類抗生素的結(jié)構(gòu)見表10-1。(二)性質(zhì)1、酸堿性與溶解度四環(huán)素類分子中的酚羥基和烯醇型羥基顯弱酸性；二甲胺基顯弱堿性；因此，四環(huán)素類抗生素是兩性化合物。遇酸及堿，均能生成相應(yīng)的鹽。這類抗生素是結(jié)晶性物質(zhì)，具引濕性。其鹽酸鹽溶于水，并溶于堿或酸性溶液中，而不溶于三氯甲烷、乙醚等有機溶劑。四環(huán)素類抗生素的游離堿在水中的溶解度很小，其溶解度與溶液的pH有關(guān)，在pH4.5～7.2之間時難溶于水；當pH高于8或低于4時，水中溶解度增加。其鹽類在水中會水解，當溶液濃度較大時，會析出游離堿。2、不穩(wěn)定性四環(huán)素類抗生素對各種氧化劑(包括空氣中的氧)、酸、堿都是不穩(wěn)定的。干燥的四環(huán)素類游離堿和它們的鹽類在避光條件下保存均穩(wěn)定，但其水溶液隨pH的不同會發(fā)生差向異構(gòu)化、降解等反應(yīng)，尤其是堿性水溶液，特別容易氧化，顏色很快變深，形成色素。(1)差向異構(gòu)化性質(zhì)：四環(huán)素類抗生素在弱酸性(pH2.0～6.0)溶液中，其A環(huán)手性C-4原子構(gòu)型改變，發(fā)生差向異構(gòu)化，形成差向四環(huán)素類(ETC)。反應(yīng)是可逆的，達到平衡時溶液中的差向化合物的含量可達40％～60％。某些陰離子如磷酸根、枸櫞酸根、醋酸根離子的存在，可加速這種異構(gòu)化反應(yīng)。四環(huán)素、金霉素很容易差向異構(gòu)化，產(chǎn)生差向四環(huán)素和差向金霉素(具有藍色熒光)，其抗菌性能極弱或完全消失；而土霉素、多西環(huán)素、美他環(huán)素，由于C-5上的羥基和C-4上的二甲胺基形成氫鍵而較穩(wěn)定，C-4上不易發(fā)生差向異構(gòu)化。(2)降解性質(zhì)：①酸性降解：在酸性條件下特別是在加熱情況下，四環(huán)素類抗生素C-6上的醇羥基和C-5口上的氫發(fā)生反式消去反應(yīng)，生成脫水四環(huán)素(ATC)。和四環(huán)素一樣，金霉素在酸性溶液中也能生成脫水金霉素。脫水四環(huán)素分子中，共軛雙鍵的數(shù)目增加，色澤加深，對光的吸收程度也增大。橙黃色的脫水金霉素或脫水四環(huán)素，分別在435nm及445nm處有最大吸收。利用這一性質(zhì)，可對金霉素或四環(huán)素進行比色測定。脫水四環(huán)素也可形成差向異構(gòu)體，稱差向脫水四環(huán)素(EATC)。②堿性降解：堿性溶液中，C-6上的羥基形成的氧負離子，向C-11發(fā)生分子內(nèi)親核進攻，經(jīng)電子轉(zhuǎn)移，C環(huán)破裂，生成無活性的具有內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的異構(gòu)體，四環(huán)素變成異四環(huán)素。3、旋光性四環(huán)素類抗生素分子中具有不對稱碳原子，因此有旋光性，可用于定性、定量分析。各國藥典測定該類抗生素的比旋度，如《中國藥典》規(guī)定鹽酸土霉素在鹽酸(9→1000)溶液的比旋度為-1880~-2000，鹽酸四環(huán)素的比旋度為-2400~-2580(0.01mol／L鹽酸溶液)。4、與金屬離子形成配位化合物本類抗生素分子中含酚羥基和烯醇基，能與金屬離子形成不溶性的鹽類或配位化合物。如與鈣離子、鎂離子形成不溶性的鈣鹽或鎂鹽，與鐵離子形成紅色配位化合物，與鋁離子形成黃色配位化合物。形成的有色配位化合物可用于鑒別或用紫外-可見分光光度法測定含量。二、鑒別試驗(一)濃硫酸反應(yīng)四環(huán)素類抗生素遇硫酸立即產(chǎn)生顏色，以此可區(qū)別各種四環(huán)類抗生素。如鹽酸多西環(huán)素遇硫酸顯黃色；鹽酸四環(huán)素遇硫酸顯深紫色，再加三氯化鐵溶液變紅棕色；鹽酸金霉素遇硫酸顯藍色，漸變?yōu)殚蠙炀G色，加水lml后顯金黃色或棕色。本類抗生素分子結(jié)構(gòu)中具有酚羥基，在酸性溶液中遇三氯化鐵試液即顯色。上述的鹽酸四環(huán)素遇硫酸顯深紫色，再與三氯化鐵試液反應(yīng)呈棕紅色的原理即如此。(二)氯化物反應(yīng)四環(huán)素類藥物均為鹽酸鹽，可以與硝酸銀試液反應(yīng)，從而鑒別。(三)紫外-可見分光光度法本類抗生素分子內(nèi)含有共軛雙鍵體系，在紫外光區(qū)有吸收。《中國藥典》因此將紫外吸收的特征作為鹽酸土霉素、鹽酸美他環(huán)素的鑒別項目。(四)高效液相色譜法(五)薄層色譜法三、特殊雜質(zhì)的檢查四、含量測定四環(huán)素類抗生素的含量測定，各國藥典多采用高效液相色譜法。第四節(jié)喹諾酮類抗菌藥的分析喹諾酮類藥物具有抗菌譜廣、抗菌作用強、使用安全、細菌對其不易產(chǎn)生耐藥性、易于制造等優(yōu)點，自1962年發(fā)現(xiàn)第一個喹諾酮類抗菌藥萘啶酸以來，許多學者致力于這類藥物的開發(fā)研究，特別是近十余年得到了迅速的發(fā)展。20世紀70年代中期，上市了第二代喹諾酮類藥物，如吡哌酸等。20世紀80年代初開始了第三代氟喹諾酮類的研究，至今已開發(fā)和正在開發(fā)的有五十多種，目前臨床應(yīng)用的有諾氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、依諾沙星、氧氟沙星、司帕沙星與氟羅沙星等。這些藥物的抗菌作用與療