植物組織培養(yǎng)筆記(完整)

PAGEPAGE1緒論植物繁殖方式：分株、播種、壓條、扦插、嫁接、組培繁殖一、組培的概念：狹義：在無(wú)菌條件下，將離體的植物組織小塊，在適宜的人工培養(yǎng)和環(huán)境條件下進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)，使培養(yǎng)體逐步分化出器官，一個(gè)組織或單個(gè)細(xì)胞（甚至用原生質(zhì)）接種到培養(yǎng)基，在人工控制的條件下（包括營(yíng)養(yǎng)、激素、溫度、光照等人進(jìn)行培養(yǎng)，使其形成完整植株的過(guò)年。）廣義：通過(guò)無(wú)菌操作，把植物體的一個(gè)器官、一種組織或單個(gè)細(xì)胞（甚至原生質(zhì)）接種到培養(yǎng)基，在人工控制的條件下（營(yíng)養(yǎng)、激素、溫度、光照等）進(jìn)行培養(yǎng)，使其成為完整植株的過(guò)程。狹義與廣義：組織范圍不同。二、組培發(fā)展史誕生1、植物組織培養(yǎng)技術(shù)的誕生可以追溯到19世紀(jì)末20世紀(jì)初。2、1839—1840年，施萊登和施旺創(chuàng)立了“細(xì)胞學(xué)說(shuō)”。3、1902年，德國(guó)生理學(xué)家Haberlandt提出了高等植物細(xì)胞全能性理論。4、1934年，美國(guó)White利用番茄根建立了第一個(gè)活躍生長(zhǎng)的無(wú)性繁殖系，離體根的培養(yǎng)獲得成功。5、1943年White發(fā)表了《植物組織培養(yǎng)手冊(cè)》6、1962年Marshing和Shong發(fā)明了MS培養(yǎng)基。GauthererWhiteNobecount一起被譽(yù)為組織培養(yǎng)學(xué)科的奠基人。組培發(fā)展1、1948年Skoog和崔徵通過(guò)對(duì)煙草莖切斷和髓培養(yǎng)組織研究確定了腺嘌呤，生長(zhǎng)素是控制芽和根的生長(zhǎng)。2、1956年Miller等發(fā)明了激動(dòng)素?？刂破鞴俜只募に啬Ｊ阶?yōu)榧?dòng)素。3、50年代至今，組培迅速發(fā)展1971年，Takebe在煙草上首次使用原生質(zhì)體獲得自身植株。1962年，印度Guha毛葉曼陀羅花藥培養(yǎng)1973年，Carlson兩個(gè)煙草物種原生質(zhì)體融合1983年，Zambryski用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草轉(zhuǎn)基因植物1978年，Murashige提出“人工種子”的概念。三、組培術(shù)語(yǔ)1、外植體（explant）:從植物體分離下來(lái)用于離體培養(yǎng)的材料；2、愈傷組織（callus）:在離體培養(yǎng)過(guò)程中形成的具有分生能力的一團(tuán)不規(guī)則細(xì)胞，躲在植物體切面產(chǎn)生。3、分化（differentiation）:細(xì)胞在分裂過(guò)程中發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能上的改變，從而在個(gè)體發(fā)育中形成各類(lèi)組織和器官完成整個(gè)生活周期。4、脫分化(differentiation)：原已分化的細(xì)胞，失去原有的形態(tài)功能，又恢復(fù)到?jīng)]有分化的霧組織的細(xì)胞團(tuán)和愈傷組織，（即轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚鸂顟B(tài)）這個(gè)過(guò)程稱為脫分化。5、再分化（redifferentiation）:在一定的培養(yǎng)條件下，經(jīng)過(guò)脫分化的組織和細(xì)胞，經(jīng)重新分化而產(chǎn)生新的組織和器官（如由愈傷組織形成芽、根或胚狀體），稱為再分化。6、胚狀體（embroid）：在組織培養(yǎng)中，從一個(gè)非合子細(xì)胞，通過(guò)合子胚相似的胚胎發(fā)生過(guò)程所形成的胚狀結(jié)構(gòu)。7、初代培養(yǎng)(firstculture)：外植體的第一次培養(yǎng)。8、繼代培養(yǎng)：更換新鮮培養(yǎng)基來(lái)繁殖同種類(lèi)型的材料。9、植物細(xì)胞全能性（totipotent）:植物體的每一個(gè)細(xì)胞都攜帶著一套完整的基因組，并具有發(fā)育為完整植株的潛能。因?yàn)槊總€(gè)細(xì)胞都是來(lái)自于受精卵，所以有與受精卵具有相同的遺傳物質(zhì)。10、生根培養(yǎng)：11、馴化移栽：組培苗經(jīng)人工煉苗后移栽到馴化苗床上使之適應(yīng)露地或保護(hù)地條件的過(guò)程。組培的一般過(guò)程：初代培養(yǎng)—繼代培養(yǎng)—生根培養(yǎng)—馴化培養(yǎng)四、組培的分類(lèi)1、按培養(yǎng)基分類(lèi)培養(yǎng)體：固體液體（靜止、旋轉(zhuǎn)、紙橋、震蕩）2、根據(jù)外植體分類(lèi)：植株培養(yǎng)器官培養(yǎng)：根系培養(yǎng)、莖段培養(yǎng)、葉片培養(yǎng)、花器培養(yǎng)、果實(shí)培養(yǎng)、種子培養(yǎng)組織培養(yǎng)：分生組織培養(yǎng)、薄壁組織培養(yǎng)、疏導(dǎo)組織培養(yǎng)胚胎培養(yǎng)：看護(hù)培養(yǎng)、平板培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)、微室培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)：非融合培養(yǎng)、融合培養(yǎng)五、組培的特點(diǎn)：1、培養(yǎng)條件可以人為加以控制；2、繁殖系數(shù)大，培養(yǎng)周期短；3、管理方便，有利于實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)和自動(dòng)化控制。六、組培的應(yīng)用（一）快繁突出優(yōu)點(diǎn)“快”應(yīng)用：工廠化育苗（industrializingpropagation）：蘭花、桉樹(shù)、非洲紫羅蘭、大花蕙蘭體胚發(fā)生：枸杞、核桃、蘋(píng)果、青扦（二）植物脫病毒（virusfree）：馬鈴薯、甘薯、草莓、蘋(píng)果、香石竹等。通過(guò)托病毒可以保持園藝植物的優(yōu)良性狀。（三）種質(zhì)保存：加入冷凍保護(hù)劑，有利于細(xì)胞，胚狀體，試管苗，愈傷組織等的長(zhǎng)期保存。（四）植物育種：1.單倍體育種：通過(guò)花藥培養(yǎng)，從小孢子獲得單倍體植株，染色體加倍后獲得正常二倍體植株。2.胚培養(yǎng)，子房培養(yǎng)，胚珠培養(yǎng)3.突變體的選擇和應(yīng)用4.體細(xì)胞雜交和遺傳工程5.遺傳轉(zhuǎn)化與基因工程（五）有用化合物的工程化生產(chǎn)生產(chǎn)化合物：強(qiáng)心苷、吲哚生物堿、喜樹(shù)堿、銀杏黃酮和內(nèi)酯七、組培的生理依據(jù)1、植物細(xì)胞的全能性2、激素在分化過(guò)程中的作用在分化過(guò)程中植物激素的作用是明顯的，合適的激素配比在器官分化有重要作用。實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備和操作一、實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)洗滌室—準(zhǔn)備室—無(wú)菌操作室—培養(yǎng)室—觀察室洗滌室（cleaningroom）大型水槽，最好是白瓷水槽、鋪墊橡膠、上下水道要暢通、塑料筐準(zhǔn)備室洗滌室+配置室=準(zhǔn)備室（化學(xué)實(shí)驗(yàn)室）1.設(shè)備及器具：大型工作臺(tái)：用于配置培養(yǎng)基母液和培養(yǎng)基等，其高度應(yīng)方便配制工作；藥品柜：用于放置常用藥品。普通冰箱電子分析天平和托盤(pán)天平用于稱取大量元素、微量元素、維生素、激素等微量藥品準(zhǔn)確為0.0001g。電蒸餾器電爐或微波爐：用于瓊脂的溶解酸度計(jì)培養(yǎng)基分裝設(shè)備高壓滅菌鍋：必備的恒溫培養(yǎng)箱：生化培養(yǎng)箱、光照培養(yǎng)箱、人工氣候室、植物生長(zhǎng)箱烘箱：用于干燥需要保持80—100℃；干熱滅菌需要保持150℃，達(dá)1—3h。2.滅菌室（三）接種室（無(wú)菌操作室tranaferingroom）宜小不宜大，一般8平方米，吊裝1—2盞紫外線滅菌燈。超凈臺(tái)（cleaningtable）：有水平式，垂直式、單人操作和雙人操作。解剖鏡：通常放大5—80倍；帶有照相裝置。無(wú)菌操作的器具：酒精燈、鑷子、解剖刀、解剖刀片、醫(yī)用剪、廣口瓶（四）培養(yǎng)室（culturingroom）:作用：用于培養(yǎng)接種的植物材料，培養(yǎng)室要求具有一定的照明及控溫、控濕設(shè)備（全自動(dòng)）。具有以下條件1、溫度：15℃或23—282、濕度：70%—80%之間，可安裝加濕器；3、光照：1500—3000lx;4、時(shí)間：10—16h，控制日照時(shí)間，可安裝定時(shí)開(kāi)關(guān)；注意長(zhǎng)日照植物與短日照植物對(duì)光的需求。5、培養(yǎng)架6、搖床及轉(zhuǎn)床二、玻璃器皿及用具：試管、三角瓶、培養(yǎng)皿等。（一）對(duì)玻璃器皿的要求：1、耐腐蝕，耐高溫，高壓；2、透明3、易于放外植體（口徑大）（二）規(guī)格要求：1、長(zhǎng)試管：2.0x15cm;2.5x15;3.0x15。2、三角瓶：一般用于液體培養(yǎng)，50—250ml口徑在2.5—3.0cm3、培養(yǎng)皿：用于固體培養(yǎng)基，特別用于轉(zhuǎn)基因植物葉片培養(yǎng)4、T型試管和L型試管5、培養(yǎng)瓶6、封口瓶塞：要求具有一定的通氣性和密閉性，以防止培養(yǎng)基干燥和雜菌污染7、選瓶機(jī)（三）其它工具細(xì)菌過(guò)濾器：用于一些被高溫破壞，不能進(jìn)行高壓滅菌的物質(zhì)，如：吲哚乙酸、玉米素等孔徑在45um左右細(xì)胞計(jì)數(shù)器：血板計(jì)數(shù)板燒杯、量筒、移液管、移液器（四）接種工具消毒器具、長(zhǎng)短鑷子（25cm）、解剖刀、剪刀、接種針、酒精燈、接種鏟、過(guò)濾網(wǎng)第二節(jié)培養(yǎng)基一、培養(yǎng)基的成分培養(yǎng)基（culturemedium）是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)。只有篩選出合適的培養(yǎng)基，培養(yǎng)才有可能成功。培養(yǎng)基的成分主要有：水、無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)化合物、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物、天然附加物、支持物水分：蒸餾水或重蒸水無(wú)機(jī)鹽：是植物生長(zhǎng)所必須的化學(xué)元素，主要包括大量元素和微量元素。大量元素：N、P、K、Ca、Mg、S等微量元素：小于10-5-10配制鐵時(shí)需要用Fe2（SO4）3和FeCl3在pH5.2以上有機(jī)化合物（organiccompound）：有機(jī)營(yíng)養(yǎng)包括糖、維生素、肌醇及氨基酸（1）糖類(lèi)：植物組培時(shí)，光合作用很弱，需在培養(yǎng)基添加糖類(lèi)。作用：1）作為生長(zhǎng)發(fā)育所需的碳源和能量；2）維持一定的滲透壓（1.5-4.1大氣壓之間）。最常用的碳源是蔗糖、葡萄糖和果糖也是較好的碳源，麥芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在組培中也有應(yīng)用。糖濃度：1）蔗糖使用濃度在2%—3%，常用3%，即配制1L培養(yǎng)基稱取30g蔗糖，有時(shí)可用2.5%。（2）維生素：常使用濃度1—1.0mg/l之間，以B族維生素為主。如：維生素B1、B6、B9、VB5、VH、VM、VC（抗壞血酸）等。（3）肌醇（環(huán)己六醇）：用量一般為50—100mg/l。適當(dāng)使用肌醇，能促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng)以及胚狀體和芽的形成。對(duì)組織和細(xì)胞的繁殖、分化有促進(jìn)作用，對(duì)細(xì)胞壁形成有作用。（4）氨基酸：是蛋白質(zhì)的組成成分。常用的氨基酸有甘氨酸。其它精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、丙氨酸等也常用，另外多種谷氨酸混合如水解絡(luò)氨酸（可促進(jìn)胚胎發(fā)生）。（四）生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物：生長(zhǎng)素細(xì)胞分裂素1）生長(zhǎng)素類(lèi)：在組培中，生長(zhǎng)素主要被用于誘導(dǎo)愈傷組織形成，誘導(dǎo)根的分化和促進(jìn)細(xì)胞分裂，伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。吲哚乙酸（IAA）：可人工合成，其活力較低，高溫高壓易分解。萘乙酸（NAA）：在組培中的啟動(dòng)能力要比IAA高出一倍，可以人工合成耐高溫高壓，不易被分解破壞。NAA和IBA廣泛用于生根，并與細(xì)胞分裂素互作促進(jìn)芽的增殖和生長(zhǎng)。IBA吲哚丁酸：促進(jìn)發(fā)根能力較強(qiáng)的生長(zhǎng)物質(zhì)。2，4—D：促進(jìn)愈傷組織的形成上活力最高，但它強(qiáng)烈抑制芽的形成，影響器官的發(fā)育。GA：用于促進(jìn)幼苗莖的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，促進(jìn)不定胚發(fā)育成小植株。2）細(xì)胞分裂素(cytokinin)：腺嘌呤的衍生物，6—BA、KT（激動(dòng)素）、ZT（玉米素）、TDZZT的活性最強(qiáng)，單非常貴，常用G-BA。作用：（1）誘導(dǎo)芽的分化，促進(jìn)側(cè)芽的萌發(fā)生長(zhǎng)，細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素相互作用；（2）促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大；（3）抑制根的分化。多用于誘導(dǎo)不定芽的分化……濃度甚微，0.05~5mg/L。（五）培養(yǎng)材料的支持物（1）瓊脂：在固體培養(yǎng)時(shí)瓊脂是最好的固化劑。瓊脂的用量在6—10g之間（0.6—1.0%）；影響瓊脂的凝固能力的因素：與原料、廠家的加工方式有關(guān)；與高壓滅菌時(shí)的溫度、時(shí)間、PH值等因素有關(guān)。長(zhǎng)時(shí)間的高溫會(huì)使凝固能力下降，過(guò)酸過(guò)堿使瓊脂發(fā)生水解，時(shí)間過(guò)久，瓊脂變褐，會(huì)逐漸喪失凝固能力。PH在5.8左右。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，通氣問(wèn)題易解決，便于經(jīng)常觀察研究等。缺點(diǎn)：培養(yǎng)物接觸面積小，各種養(yǎng)分在瓊脂中擴(kuò)散較慢，影響?zhàn)B分的充分利用；同時(shí)培養(yǎng)物排出的代謝物，聚集在吸收表面，對(duì)組織產(chǎn)生毒害作用。（2）其他支持物：玻璃纖維、濾紙橋、海綿等，總的要求是排出有害物質(zhì)。（六）附加物：天然復(fù)合物，其成分比較復(fù)雜，大多含氨基酸，激素，酶等一些復(fù)雜化合物。1）椰乳：使用最多，效果最大。10%~20%。2）水解酪蛋白：100-500mg/L。3）酵母提取物：0.01%-0.05%。YE：主要用于細(xì)菌培養(yǎng)。4）麥芽提取物：0.01%-0.5%。5）蘋(píng)果和番茄的果汁等。二、培養(yǎng)基的種類(lèi)基本培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基按照培養(yǎng)基對(duì)植物的作用可分為：空白培養(yǎng)基（不加人激素的培養(yǎng)基）、誘導(dǎo)培養(yǎng)基（使植物細(xì)胞脫分化）、分化培養(yǎng)基（使脫分化的細(xì)胞再分化出根莖等器官）、生根培養(yǎng)基常用的培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基、White培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基、KM—8P培養(yǎng)基等按培養(yǎng)基物理性狀分：固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基（精致培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)）1）MS培養(yǎng)基：高鹽培養(yǎng)基。1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。特別是無(wú)機(jī)鹽和離子濃度較高，為較穩(wěn)定的平衡溶液。其養(yǎng)分的數(shù)量和比例較為合適。2）B5培養(yǎng)基：低鹽培養(yǎng)基。1968年由Gamborg等為培養(yǎng)大豆根細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。其主要特點(diǎn)是含有較低的銨，因?yàn)殇@可能對(duì)不少培養(yǎng)物的生長(zhǎng)有抑制作用。3）White培養(yǎng)基：1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計(jì)的。1963年又做了改良，稱White改良培養(yǎng)基，提高了MgSO4的濃度并增加了硼素。其特點(diǎn)是無(wú)機(jī)鹽數(shù)量較低，適于生根培養(yǎng)。4）N6培養(yǎng)基：1974年由中科院植物所朱至清等為水稻等禾谷類(lèi)植物而設(shè)計(jì)的。其特點(diǎn)是成分較簡(jiǎn)單，KNO3和（NH4）2SO4含量高。在國(guó)內(nèi)已廣泛應(yīng)用于小麥、水稻及其他禾谷類(lèi)植物的花藥培養(yǎng)、細(xì)胞及原生質(zhì)體培養(yǎng)。5）KM-8P培養(yǎng)基：1974年為原生質(zhì)體培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的。其特點(diǎn)是有機(jī)成分較復(fù)雜，包括了所有的單糖和維生素，廣泛用于原生質(zhì)的融合培養(yǎng)。三、培養(yǎng)基的配制：（一）母液的配制和保存為簡(jiǎn)便起見(jiàn)，通常先配制一系列母液，即貯備液。所謂母液是欲配制液的濃縮液。易于低溫保存。一般為10~200倍。MS培養(yǎng)基母液的配制：母液1：為大量元素，包括硝酸銨：33000mg、硝酸鉀：38000mg、氯化鉀-2H2O：8800mg、硫酸鎂-7H2O：7400mg。配成20倍的母液，各化合物分別溶解后在順次混合并加水至1000ml。母液2：為微量元素，包括KI166mg、硼酸240mg、MnSO4-4H2O4460mg、ZnSO4-7H2O1720mg、鉬酸鈉-2H2O50mg、CuSO4-5H2O5mg、CoCl-6H2O5mg。配成200倍的母液，化合物分別溶解后混合，加水至1000ml。母液3：為鐵鹽，配成200倍母液，F(xiàn)eSO4-2H2O5560mg、Na-EDTA-2H2O7460mg。這兩種化合物各用450ml蒸餾水溶解，然后混合并調(diào)節(jié)PH值為5.5，再加水至1000ml。母液4：為維生素類(lèi)，氨基酸母液包括肌醇20000mg，煙酸100mg、鹽酸吡哆醇100mg、鹽酸硫胺素20mg、甘氨酸400mg形成200倍母液，各種化合物分別溶解再混合并加水至100ml。注意事項(xiàng)：①配制好的母液分別貼上標(biāo)簽，注明母液號(hào)，日期及配制1L所得的能量；②放在冰箱內(nèi)可保存幾個(gè)月；③維生素和氨基酸類(lèi)即母液4易發(fā)生霉菌，一次不易多配。④液體培養(yǎng)基的配制方法與固體相同。（二）激素母液的配制每種激素必須單獨(dú)配制成母液，濃度單位mg/L（ppm），用時(shí)根據(jù)需要取用。因?yàn)榧に赜昧可?，一次可配?0ml或100ml。各種激素配法：1）①將IAA、IBA、GA等先溶于少量的95%的酒精中，再加水定容一定濃度。②NAA先溶于熱水或少量95%酒精中，再加水定容到一定濃度。③2，4—D可用少量1molNaOH,溶解后，再加水定容到一定溶度。④將KT和BA先溶于少量1mol的HCl中再加水定容。⑤將玉米素（ZT）先溶于少量95%酒精，再加熱水到一定濃度。2）配制的激素濃度一般為200mg/L(ppm);3）配制好的母液瓶上應(yīng)分別貼上標(biāo)簽，注明母液名稱，配制倍數(shù)、日期及配1L培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)取的量。（三）工作培養(yǎng)基的配制1、基本培養(yǎng)基配制：1LMS培養(yǎng)基：母液1—50ml；母液2—5ml;母液3—5ml;母液4—5ml;2、激素配制：一般生長(zhǎng)素濃度的使用為0.05—5mg/L，細(xì)胞分裂素0.05—10mg/L；3、母液一般配制100—200mg/L；培養(yǎng)基中添加的量：如要求NAA2.0，母液為200mg/L，配制1L培養(yǎng)基所取的量為100×2/200=10（ml）4、定容至1000ml;5、添加蔗糖溶液30g、瓊脂6—7g;6、調(diào)節(jié)PH值（較為關(guān)鍵）一般在5.8左右，因培養(yǎng)材料來(lái)源而異，大多數(shù)為5.6—6.0，用1N氫氧化鈉和1N鹽酸調(diào)整，高壓滅菌后，PH值會(huì)向偏酸的側(cè)移動(dòng)0.1—0.3。PH影響培養(yǎng)基的硬度PH>6.5培養(yǎng)基會(huì)變硬，PH<5.0培養(yǎng)基不易凝固；7、加熱溶解；8、分裝；9、滅菌。配制培養(yǎng)基的注意點(diǎn)：1）在使用提前配制好的母液時(shí)，應(yīng)在量取各種母液之前，輕輕搖動(dòng)盛放母液的瓶子，如果瓶中有沉淀、懸浮物或被微生物污染，應(yīng)立即淘汰這種母液，重新進(jìn)行配制；2）用量筒或移液管取培養(yǎng)基母液之前，必須用所取的母液將量筒或移液管潤(rùn)洗2次；3）量取的順序?qū)懺诩埳希咳∫环N，劃掉一種，以免出錯(cuò)。第四節(jié)滅菌及無(wú)菌操作植物組織培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵：保證無(wú)菌，避免污染。器皿和用具的洗滌（P28）：玻璃器皿洗滌方法：先用堿洗，即用肥皂粉刷洗，用清水清洗，晾干。難洗的器具：需用鉻酸-硫酸混合洗滌液浸泡，浸泡后用自來(lái)水沖洗，最后用蒸餾水沖洗。培養(yǎng)基滅菌及培養(yǎng)基、植物材料的消毒（一）培養(yǎng)基的滅菌（高壓滅菌）一般程序：1.按實(shí)驗(yàn)需求配制……2.……加水，防止干燒。3.將培養(yǎng)基瓶，所用的培養(yǎng)皿，接種用的器具，蒸餾水等需要滅菌的東西放入鍋內(nèi)。4.關(guān)上鍋蓋，擰緊。5.打開(kāi)電源，開(kāi)始加熱，至100℃6.滅菌鍋?zhàn)詣?dòng)關(guān)上排氣閥，開(kāi)始加壓，溫度繼續(xù)上升，溫度到達(dá)121℃7.維持此溫度，壓力維持0.1~0.2MPa下，保持10-20分鐘。8.時(shí)間到后自動(dòng)降壓降溫至100℃9.在94℃滅菌最少時(shí)間：mLmin20~501575~15020250~50025100030注意事項(xiàng)：①在滅菌之前一定要檢查鍋中的水位，嚴(yán)禁干燒，以免造成事故。②滅菌前還需檢查排氣閥是否關(guān)上。③只有當(dāng)鍋中壓力為零時(shí)才能打開(kāi)鍋蓋，否則會(huì)有危險(xiǎn)。④鍋內(nèi)應(yīng)留有空隙，不能太滿。⑤滅菌時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，也不可以超過(guò)滅菌鍋規(guī)定的壓力范圍。（二）物體表面滅菌滅菌方式：噴霧、涂抹殺菌。范圍：桌面、墻面、雙手、材料表面。消毒劑：70%酒精；1-2%來(lái)蘇水；0.25-1%新潔爾滅，洗衣粉；吐溫-80。（三）接種工具滅菌用前干熱滅菌160-180℃，1.5-2.0h用前濕熱滅菌121℃，20-30min接種前用酒精棉球檫試，侵入95%酒精液中，并在酒精燈上滅菌。（四）實(shí)驗(yàn)服、口罩、濾紙滅菌濕熱滅菌121℃，20-30min……（五）接種室滅菌紫外燈照射（接種室、超凈臺(tái)、接種箱）：波長(zhǎng)260nm，距離小于1.2m，2.-30min。臭氧滅菌機(jī)：1~2h。熏蒸滅菌：5-8mL/m3甲醛+5g/m3高錳酸鉀；冰醋酸。接種臺(tái)噴霧消毒：75%酒精。（六）培養(yǎng)室滅菌新建培養(yǎng)……隔2-5天用洗衣粉水或來(lái)蘇水拖地一次，用高錳酸鉀擦。三、無(wú)菌操作滅菌：用物理或化學(xué)方法，殺死物體表面積和孔隙內(nèi)一切微生物或生物體，即所有有生命的物質(zhì)全部殺死。消毒：殺死、消除或抑制部分微生物，使之不發(fā)生作用。滅菌劑名稱使用濃度%清洗難易滅菌時(shí)間滅菌效果酒精70-75易0.1-3好Ca(ClO)29—10易5—30好氯化汞0.1-0.2較難2-10最好常用化學(xué)消毒劑：酒精滅菌的原理：酒精具有較強(qiáng)的穿透能力和殺菌力，它使細(xì)菌蛋白質(zhì)變性。使用的濃度一般為70—75%。處理時(shí)間15—30s，不宜太久，因此細(xì)胞容易收縮脫水。它具有浸潤(rùn)和滅菌雙重作用，適用于表面消毒；在乙醇溶液中加入0.1%的酸或堿，可提高殺菌效果。植物材料消毒程序：1）清洗（流動(dòng)自來(lái)水沖洗數(shù)小時(shí)，洗衣粉毛刷等清洗）；2）滅菌劑浸泡滅菌；3）無(wú)菌水清洗4、5次擦干；4）加表面活性劑（吐溫-20或吐溫-80，加強(qiáng)表面活性劑，磁力攪拌，超聲振蕩）。常規(guī)二次消毒法：材料先放入70%的乙醇中，約30s后再在0.1%的氯化銀中浸泡，2—0min，或在2%次氯酸鈉中浸泡20min,然后用無(wú)菌水沖洗3、4次。四、廣譜實(shí)驗(yàn)法在廣譜試驗(yàn)中，把培養(yǎng)基中所有組分分為4大類(lèi)：無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)物質(zhì)、生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素4類(lèi)物質(zhì)各3種濃度的自由組合即構(gòu)成了3項(xiàng)包括81個(gè)處理的實(shí)驗(yàn)。第五節(jié)培養(yǎng)條件1.光照：組織培養(yǎng)中有的材料需要在按條件下培養(yǎng)，有的需要在光條件下。2.溫度：低溫：使培養(yǎng)物生長(zhǎng)停頓。高溫：不利于培養(yǎng)物生長(zhǎng)，……變溫：……3.濕度：70%~80%思考題：1.一個(gè)正規(guī)的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備哪些房間？2.組織培養(yǎng)常用的設(shè)備有那些？各有何用途？3.組織培養(yǎng)的條件有那些？第三章第一節(jié)植物外植體選擇及其消毒1、外植體的特點(diǎn)：植物生長(zhǎng)都要經(jīng)過(guò)幼年期和成年期兩個(gè)大的階段。幼年期是植物早期生長(zhǎng)階段。成熟過(guò)程發(fā)生在幼態(tài)組織中。植物組織一旦進(jìn)行細(xì)胞“決定”，并就如成熟態(tài)，則一般不可以逆轉(zhuǎn)，而且具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性。這種穩(wěn)定性可以通過(guò)許多代細(xì)胞分裂而傳遞，類(lèi)似一種“記憶”功能。成熟度分布：對(duì)于同株植物從幼年到成年轉(zhuǎn)變是由莖基部向頂部轉(zhuǎn)變的，即木本植物基部通常是幼年期，頂部是成熟期，中部則是中間類(lèi)型。植物的微體快繁，一般稱為微繁殖，分為四個(gè)階段：1）選擇、2）增殖、3）壯苗和生根、4）試管苗的移植復(fù)壯：P54完全復(fù)壯：由成熟組織或細(xì)胞經(jīng)胚胎發(fā)生形成正常的幼態(tài)植株。有性生殖產(chǎn)生的合子是自然的完全復(fù)壯。部分復(fù)壯：樹(shù)木器官、組織細(xì)胞中僅僅有某些成熟特性消失和某些幼態(tài)特性重現(xiàn)，發(fā)生變化的特征和發(fā)生變化的過(guò)程可能各不相同，但組織或細(xì)胞在一定程度上恢復(fù)了形態(tài)發(fā)生能力。復(fù)壯措施：1）栽培技術(shù)措施：將成熟枝條的接穗嫁接到幼嫩砧木上。反復(fù)修剪和強(qiáng)修剪以矮化母株可能提高復(fù)壯程度。2）物理化學(xué)措施：NaOH、H2SO4、萜烯、抗菌素等化學(xué)處理。3)組織培養(yǎng)措施：幼年部位的外植體要比成年部位外植體容易組織培養(yǎng)成功。對(duì)于取自成熟植株的外植體組織培養(yǎng)時(shí)可采取以下方法：外植體小型化、離體培養(yǎng)物的連續(xù)培養(yǎng)、組織培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基添加劑（激素等）。2、外植體的種類(lèi)：1）帶芽外植體：頂芽、腋芽、根莖連接處的萌蘗等。2）胚：指天然狀態(tài)和試管中精卵融合受精后形成的各個(gè)時(shí)期的胚。3、外植體選擇的特點(diǎn)：①選用實(shí)生苗組織②植物的種質(zhì)：成年優(yōu)樹(shù)作為供體母樹(shù)（如抗逆性、產(chǎn)量高、品質(zhì)好等）③各器官的生理、發(fā)育年齡、幼態(tài)區(qū)的分布（分布部位）④外植體的增殖能力⑤注意取材時(shí)的季節(jié)和時(shí)間。春季較好，秋季較差，雨季不易成功⑥選取材料的大小：莖段0.5-1cm，脫毒苗外植體0.2-0.5cm。4、外植體的消毒：植物材料的預(yù)處理：1）修剪樹(shù)木組織。2）先培養(yǎng)在無(wú)糖的培養(yǎng)基中。3）避免在雨天取樣。5、莖、葉的消毒：①用流水沖洗②洗后先用70%乙醇浸20-30秒鐘③再置于第二種消毒藥劑浸泡消毒④無(wú)菌水洗4~5次。6、果實(shí)種子的消毒（基本同上）7花藥的消毒：將幼穗或花蕾進(jìn)行體表滅菌即可。第二節(jié)外植體的增殖芽增殖的2種途徑：器官發(fā)生的途徑：不定芽：直接再生不定芽和愈傷組織不定芽（間接再生）定芽：一、帶芽外植體的增殖（定芽）外植體的來(lái)源：包括頂芽、腋芽、根莖連接處的萌壁。嫩梢扦插繁殖：芽生芽、枝生枝一個(gè)月內(nèi)增殖3~4代。關(guān)鍵是芽位的選擇，以上部3-4節(jié)的莖段或頂芽較好。叢生芽增殖：莖尖、帶腋芽的莖段或初代培養(yǎng)的芽，可使腋芽不斷萌發(fā)，生長(zhǎng)，形成叢芽，將叢生芽分離分割，再增殖為叢生芽。定芽快繁的優(yōu)點(diǎn)：能保持遺傳的穩(wěn)定性，不易受培養(yǎng)條件的影響而發(fā)生變異。激素的濃度：細(xì)胞分裂素：6-BA、PBA、KT、ZT、TDZ等0.1~10mg/L、生長(zhǎng)素：NAA、IAA、IBA等。影響定芽增殖的因素與基本培養(yǎng)基配方有關(guān)；2）與激素配比有關(guān)；3）與外植體的生理發(fā)育年齡有關(guān)。不定芽：1不定芽：除葉腋或莖尖以外，任何部位（非正常部位）產(chǎn)生出來(lái)的芽叫做不定芽。形成不定芽的類(lèi)型：不定芽的形成常隨植株種類(lèi)不同有極大差異。直接再生：不定芽在外植體的表面直接產(chǎn)生；間接再生：先誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，然后愈傷組織上分化出不定芽。2、不定芽的歷程1）外植體經(jīng)脫分化過(guò)程；2）由已脫分化的細(xì)胞或新形成的愈傷組織細(xì)胞。3、遺傳的穩(wěn)定性不通過(guò)愈傷組織而直接形成不定芽的途徑可保持原品種特性遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)。而進(jìn)過(guò)愈傷組織階段，特別是多次繼代的愈傷組織。體胚的發(fā)生合子胚：精子與卵子結(jié)合形成合子，合子發(fā)育成胚，即由受精卵形成的胚。體細(xì)胞胚（體胚）：不定胚或胚狀體。植物的體細(xì)胞胚發(fā)生：是指雙倍體或單倍體的體細(xì)胞胚（非合子細(xì)胞）在特定條件下，未經(jīng)性細(xì)胞融合而通過(guò)與合子胚胎發(fā)生類(lèi)似的途徑發(fā)育出新個(gè)體的形態(tài)發(fā)生過(guò)程，即利用各種體細(xì)胞組織，通過(guò)立體培養(yǎng)方式，誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞配的過(guò)程和技術(shù)。體細(xì)胞胚含義：1）體細(xì)胞是組織培養(yǎng)的產(chǎn)物；2）體細(xì)胞胚起源于非合子細(xì)胞（體細(xì)胞）；3）體細(xì)胞胚的形成經(jīng)歷胚胎發(fā)育過(guò)程。胚發(fā)生過(guò)程：球形胚、心性胚、魚(yú)雷形胚和子葉形胚直至成熟胚。經(jīng)體細(xì)胞胚發(fā)生形成類(lèi)似合子胚的結(jié)構(gòu)稱為胚狀體。體胚發(fā)生的起源部位：1）由外植體表皮細(xì)胞直接產(chǎn)生胚狀體；2）由外植體組織內(nèi)部細(xì)胞產(chǎn)生胚狀體。3）由愈傷組織的表面產(chǎn)生胚狀體；4）由胚性細(xì)胞復(fù)合體的表面細(xì)胞產(chǎn)生胚狀體；5）單個(gè)游離細(xì)胞產(chǎn)生胚狀體。體胚發(fā)生的主要形式：（1）直接產(chǎn)生：是指體細(xì)胞胚不經(jīng)過(guò)愈傷組織階段而從外植體上發(fā)育而成。（2）間接產(chǎn)生：對(duì)外植體中已分化，誘導(dǎo)處理主要是促進(jìn)脫分化，進(jìn)行發(fā)育命運(yùn)的重決定，誘導(dǎo)出胚性細(xì)胞。兩者的區(qū)別：后者要經(jīng)歷一個(gè)愈傷組織階段（單細(xì)胞或原生質(zhì)體）培養(yǎng)的中間階段。影響胚狀體發(fā)生的內(nèi)外因子：（1）基因型：雜種的外植體要誘導(dǎo)頻率高；不同基因型：雜種的外植體要誘導(dǎo)頻率高，一般都?xì)w因于基因型的影響，單倍體、二倍體、三倍體。（2）外植體及生理狀態(tài)：生理狀態(tài)和發(fā)育程度、幼胚、下胚軸、子葉最佳。34種針葉樹(shù)體胚發(fā)生中由18種以未成熟胚，15種以成熟胚。（3）培養(yǎng)基成分：氮素：如以硝酸氮為唯一氮源的White培養(yǎng)基，則幾乎不能誘導(dǎo)出胚狀體；NH4/硝態(tài)氮：適當(dāng)?shù)谋戎禐?5：34氨基酸：谷氨酰胺K：K濃度增加，促進(jìn)體胚發(fā)生。鐵鹽：胡蘿卜球形胚，缺鐵不能發(fā)育到心形胚階段；其它無(wú)機(jī)鹽：Mg、Zn蔗糖：提高糖濃度增加，可增加體胚的發(fā)生。激素：（1）不加任何激素柑橘、枸骨葉冬青；（2）需加入2，4-D，對(duì)禾本科植物的體胚誘導(dǎo)特別重要；（3）只需加入細(xì)胞分裂素就可以誘導(dǎo)體胚發(fā)生；（4）分裂素與生長(zhǎng)素混合；脫落酸和赤霉素抑制胚狀體的發(fā)育，但在培養(yǎng)的后期可添加。①可抑制不正常胚狀體的形成，防止胚狀體的畸形胚形成。②特別是在胚狀體發(fā)育的后期使用脫落酸較有利。（5）滲透壓影響植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生的效果，通過(guò)增加糖濃度，提高滲透壓；（6）其它條件：加活性炭、光強(qiáng)、溫度都會(huì)影響體胚的發(fā)生。藍(lán)光新興胚的發(fā)育。低溫處理。5、胚狀體的形態(tài)特征胚狀體發(fā)育早期與發(fā)育的芽在外觀上，1971年Haccius提出一個(gè)對(duì)胚狀體鑒別較為合適的標(biāo)準(zhǔn)。1）均具有兩級(jí)性：有發(fā)育得早期，在方向相反的兩端分化出莖端和根端；2）胚狀體的維管組織與母體植物或外植體的微管組織沒(méi)有結(jié)構(gòu)上的聯(lián)系，所以通過(guò)震蕩或鑷子輕輕撥就可與其他組織分開(kāi)。3）與胚的發(fā)育不同，具有單極性的芽或根往往與母體植株或愈傷組織形成的維管束相連，因而不易分離。6、人工種子：由于胚狀體具有兩性的結(jié)構(gòu)，可以直接形成再生植株，而其他再生途徑必須經(jīng)過(guò)多次續(xù)代，誘導(dǎo)生根，才能形成小植株，胚狀體的再生途徑比較節(jié)省人力物力。分類(lèi)：第一類(lèi)是裸露的或休眠的繁殖體。如適當(dāng)干燥的體細(xì)胞胚。休眠的額微鱗莖和微塊莖等，它們?cè)诓患影坏那闆r下也具有較高的成株率。第二類(lèi)是人工種皮包被的繁殖體。一些體細(xì)胞胚、原球莖等雖不能過(guò)度干燥，但只需人工種皮包被即可維持較好的發(fā)芽狀態(tài)，如胡蘿卜體細(xì)胞胚。第三類(lèi)水凝膠包埋再包被人工種皮的繁殖體大多數(shù)體細(xì)胞胚，不定芽莖尖等，均需要先包埋，在液態(tài)凝膠中，再經(jīng)過(guò)人工種皮包裹才能避免失水，從而維持良好的發(fā)芽率。人工種子的制備：體細(xì)胞胚狀體的誘導(dǎo)和發(fā)生時(shí)制備人工種子的基礎(chǔ)。由種皮、胚、胚乳構(gòu)成。體細(xì)胞胚胎外部包上人工胚乳、人工種皮就可以制備人工種子。人工種子的應(yīng)用：1）可大量繁殖轉(zhuǎn)基因植株；2）快捷高效的繁殖方式，縮短育種時(shí)間；3）人為賦予種子多種優(yōu)良品質(zhì)；4）固定雜種優(yōu)勢(shì)，天然種子是有性繁殖。優(yōu)點(diǎn)：數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整，再生率高等。而且為研究植物細(xì)胞的分化、發(fā)育、全能性表達(dá)……第四節(jié)植物離體快繁的常見(jiàn)問(wèn)題一、污染污染的種類(lèi)：1.、細(xì)菌性污染2、真菌性污染3、內(nèi)生細(xì)菌污染1）概念：植物組織中普遍存在內(nèi)生細(xì)菌；植物內(nèi)生細(xì)菌是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官的細(xì)胞間隙或細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌。普遍性：金線蓮：組培中的污染率達(dá)到50%；仙客來(lái)塊莖80%。2）癥狀：表面細(xì)菌引起的污染通常在2-3天，就能在外植體周?chē)蚺囵B(yǎng)基表面，出現(xiàn)明顯的或不明顯的細(xì)菌菌落；3）危害性：內(nèi)生菌引起的危害主要包括在早期導(dǎo)致培養(yǎng)失敗，增殖效率低。4、細(xì)菌污染及內(nèi)生細(xì)菌污染的防治措施對(duì)母樹(shù)的預(yù)處理：1）改善植株的栽培環(huán)境；2）促發(fā)新枝；3）黃化處理；4）用抗生素進(jìn)行預(yù)處理；5）改進(jìn)滅菌方法；6）添加抗生素多次消毒，使用混合消毒液含PVP（聚乙烯）。二、褐變（一）產(chǎn)生原因：植物體內(nèi)含有多酚氧化酶，當(dāng)切割材料時(shí)，激活了組織中的多酚氧化酶，或破壞了組織中酶底物與酚類(lèi)化合物被氧化，產(chǎn)生帶棕褐色的醌類(lèi)物質(zhì)，這種醌類(lèi)物質(zhì)能毒害整個(gè)組織叫做褐變。（二）影響褐變的因素：P801）基因型木本植物比草本植物易引起褐變；2）外植體的生理狀態(tài)；3）培養(yǎng)基；4）溫度和光照；5）外植體大小；6）外植體組織的受傷程度；7）材料轉(zhuǎn)移；8）用于外植體體表滅菌的化學(xué)藥品。（三）克服外植體產(chǎn)生河邊的措施：1）選擇適宜的外植體和培養(yǎng)條件（選旺盛生長(zhǎng)的外植體）2）還原性物質(zhì)或吸附劑（檸檬酸、硫代硫酸鈉、活性炭）3）對(duì)培養(yǎng)材料進(jìn)行預(yù)處理（基乙烯吡咯烷酮預(yù)處理（PVP），螯合劑螯合Cu2+）4）選擇合適的培養(yǎng)條件：選擇適當(dāng)?shù)臒o(wú)機(jī)鹽成分、蔗糖濃度、激素水平以及pH值、低溫按培養(yǎng)等可以防止褐變的發(fā)生。5）連續(xù)轉(zhuǎn)移。三、玻璃化苗：P182（一）概念：試管玻璃化苗：即玻璃苗，就是試管苗的莖、葉變成透明水浸狀，生長(zhǎng)畸形，增殖系數(shù)明顯下降，難以誘導(dǎo)生根，即使誘導(dǎo)生根，其根系質(zhì)量極差，移植成活率極低。（二）玻璃化苗的特征：1）矮小腫狀，呈半透明玻璃狀；2）有時(shí)發(fā)育出大量短而粗的莖、扁平、節(jié)間很短；3）葉片沒(méi)有功能性氣孔，由于保衛(wèi)細(xì)胞的功能。（三）產(chǎn)生原因：1）低溫；2）水勢(shì)和相對(duì)溫度；3）培養(yǎng)時(shí)的過(guò)高溫度；4）培養(yǎng)基中較低的瓊脂以及銨態(tài)氮，硝態(tài)氮的比例不協(xié)調(diào)。（四）防治玻璃苗的具體措施：1）降低細(xì)胞分裂素激素水平，添加ABA，可減輕玻璃化現(xiàn)象；2）減少培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的濕度，及培養(yǎng)基的含水量；3）純化培養(yǎng)物；4）避免高溫；5）提高培養(yǎng)基中瓊脂含量，可達(dá)到1.1%；6）調(diào)整培養(yǎng)基供氮形勢(shì)，減少銨態(tài)氮，提高硝態(tài)氮濃度；7）降低培養(yǎng)基溫度；8）適當(dāng)提高無(wú)機(jī)鹽的含量，適當(dāng)延長(zhǎng)光照。四、白化苗在禾谷類(lèi)作物培養(yǎng)中普遍存在的大量的白化苗，綠苗較少的現(xiàn)象。26℃增加到35思考題：1.滅菌與消毒的區(qū)別？Why？2.常用的滅菌方法各有哪些優(yōu)缺點(diǎn)？3.采用高壓蒸汽滅菌時(shí)，應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？4.根據(jù)發(fā)育方向，初代培養(yǎng)課分為幾種？5.組配成苗途徑有幾條？6.理解無(wú)菌操作的意義及途徑？7.污染、褐變和玻璃化產(chǎn)生的原因及預(yù)防對(duì)策？第四章植物微繁脫毒技術(shù)一、病毒存在的危害1、大多數(shù)不通過(guò)種子傳播；2、通過(guò)營(yíng)養(yǎng)體進(jìn)行傳遞，在母株內(nèi)逐代積累。例：葡萄扇葉病毒使葡萄產(chǎn)量減少10-18%。二、根除病毒的途徑：1、病毒病害與細(xì)菌和真菌病害不同，不能用藥物處理；2、消除營(yíng)養(yǎng)體的病原菌；3、用組培的辦法消除。三、病毒的分布特點(diǎn)：1、感染病毒植株的體內(nèi)病毒的分布并不均勻，病毒的數(shù)量隨植株部位及年齡而異；2、越靠近莖頂端區(qū)域的病毒感染深度越低，生長(zhǎng)點(diǎn)（約0.1-1.0mm區(qū)域）則幾乎不含或含病毒很少；3、在老組織中較多；病毒數(shù)隨著莖尖的距離的加大而增加。4、在莖尖存在高水平的內(nèi)源生長(zhǎng)素，可以抑制病毒的感受；分生四、分生組織少毒的原因1、在植物體內(nèi)，病毒易于通過(guò)維管系統(tǒng)而移動(dòng)，但分生組織中，不存在維管系統(tǒng)。2.在旺盛的莖尖分生細(xì)胞中，代謝活動(dòng)很高，病毒無(wú)法進(jìn)行復(fù)制。3.存在一種病毒純化系統(tǒng)，分生組織不易受感染。4.高水平的內(nèi)源生長(zhǎng)素，可以抑制細(xì)菌的感染。五、熱處理脫毒：1、溫湯浸漬處理：在50℃2、熱空氣處理：對(duì)活躍生長(zhǎng)的莖尖效果較好。切取莖尖分生組織進(jìn)行離體培養(yǎng)，生長(zhǎng)室溫度35-40℃三、莖尖培養(yǎng)脫毒莖尖概念：莖尖培養(yǎng)按取材大小，可分為莖尖分生組織和普通組織培養(yǎng)兩種類(lèi)型。莖尖培養(yǎng)無(wú)病毒的程序：熱處理從受侵染的植株截取并單個(gè)莖段—?jiǎng)內(nèi)デo尖—莖尖培養(yǎng)—由莖尖培養(yǎng)出再生植株—病毒檢驗(yàn)—癥狀（指示植物、電子顯微鏡、血清檢驗(yàn)等）—獲得無(wú)病毒植株—原種的保存（離體無(wú)性繁殖，在隔離區(qū)內(nèi)大量繁殖）。（一）莖尖分生組織：指莖頂端圓錐區(qū)，其長(zhǎng)度不超過(guò)0.1mm分生組織能逃避病毒侵染的原因：在植物體內(nèi)，病毒易于通過(guò)維管束而移動(dòng)，但在分生組織中，不存在維管系統(tǒng)；在旺盛的莖尖分生細(xì)胞中，代謝活動(dòng)很高，病毒無(wú)法進(jìn)行復(fù)制；存在一種病毒純化系統(tǒng)，分生組織不易受感染；在莖尖存在高水平的內(nèi)源生長(zhǎng)素，可以抑制病毒的感染。（二）普通莖尖培養(yǎng)：指帶有葉原基的較大莖尖，其大小從幾毫米到幾十毫米。特點(diǎn)：操作方便，易成活，成苗時(shí)間短，所得的植株也可能是無(wú)病毒的。目前采用較大一點(diǎn)的生長(zhǎng)錐（0.1-0.2mm，帶1-2個(gè)葉原基）并結(jié)合熱處理，得到很好的效果。四、熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)(一)1）進(jìn)行熱處理熱空氣：(二)莖尖培養(yǎng)的操作：取材和消毒：莖尖生長(zhǎng)期間，預(yù)先噴幾次藥，選用剪去2-3cm的壯芽，消毒過(guò)程同其他；操作：在超凈工作臺(tái)上，把已經(jīng)消毒過(guò)的芽放在解剖鏡下仔細(xì)剝離，直到顯出圓滑生長(zhǎng)點(diǎn)。培養(yǎng)一般用MS培養(yǎng)基。（1）培養(yǎng)的莖尖顏色逐漸變綠，體長(zhǎng)，基部逐漸增大，有時(shí)形成少量愈傷組織；（2）3-4周后，即可看到由葉原基生長(zhǎng)形成小葉和明顯伸長(zhǎng)的莖；（3）將莖尖轉(zhuǎn)入無(wú)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物的基本培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)，最后發(fā)育成完整小植株。培養(yǎng)中可能出現(xiàn)的問(wèn)題及解決方法：若生長(zhǎng)過(guò)自己，應(yīng)降低生長(zhǎng)素濃度或降低溫度；生長(zhǎng)太慢的莖尖，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)激素比例。五、通過(guò)愈傷組織培養(yǎng)再生植株去病毒通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，感染了TMV的煙草，培養(yǎng)的愈傷組織中只有40%的細(xì)胞帶有這種病毒，說(shuō)明愈傷組織中的某些細(xì)胞是不帶病毒的，可通過(guò)愈傷組織培養(yǎng)再生植株的方法，獲得無(wú)病毒植株。（1）病毒在植物體內(nèi)是不均勻的進(jìn)入愈傷組織；（2）有些細(xì)胞通過(guò)突變獲得了抗病毒的特征，抗病毒浸染的細(xì)胞可能與敏感型細(xì)胞一起存在母體組織中。六、植物脫毒的檢測(cè)和保存鑒定病毒的簡(jiǎn)便方法：1、視覺(jué)觀察法：觀察植物的葉子和莖有無(wú)該病毒有的癥狀。缺點(diǎn)：由于寄主植物的病毒癥狀要相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間才能表現(xiàn)出來(lái)，這段時(shí)間內(nèi)無(wú)法鑒定是否病毒已去除。靈敏的測(cè)試方法：1、汁液傳染：在供試植物上取下葉片，置于等體積的(w/v)的磷酸緩沖液(0.1mol/L)研磨后待用；用金剛砂輕輕擦破指示植物（對(duì)待定病毒極易感染的植物）葉表皮，再用供試植物的液汁涂抹，幾分鐘后用水澆去殘留接種物。2、葉片嫁接法：取供試植物葉片為接穗葉柄用刀削成楔形，去掉指示植物頂端一小片葉，迅速將接穗小葉嫁接到指示植物上，并用塑料帶綁縛結(jié)合處，一般4-6月固可鑒定處有無(wú)病毒。3、抗血清反應(yīng)鑒定法：用已知的病毒的抗血清可以鑒定未知的病毒種類(lèi)，抗血清鑒定是一種高度專業(yè)化型的試劑，特異性高，測(cè)定速度快，幾小時(shí)或幾分鐘就可完成鑒定，是最有效的病毒鑒定方法。常用：試管沉淀實(shí)驗(yàn)、點(diǎn)滴沉淀實(shí)驗(yàn)、凝聚沉淀實(shí)驗(yàn)4、電子顯微鏡法：在電鏡下可觀察到病毒顆粒的大小，形成和結(jié)構(gòu)，需要較高的病毒濃度，對(duì)不表現(xiàn)可見(jiàn)癥狀的潛伏病毒，血清和電鏡法唯一可行。5、酶聯(lián)免疫法原理：把抗原與抗體的免疫反應(yīng)和酶的高效催化作用結(jié)合起來(lái)，形成一種酶標(biāo)記的免疫復(fù)合物，非常靈敏，能檢測(cè)出10^5數(shù)量級(jí)的病毒濃度?？赏瑫r(shí)檢測(cè)大量的樣品。七、無(wú)毒原種苗的保存1、隔離種植保存:通常無(wú)毒原種要在隔離區(qū)域或隔離蟲(chóng)網(wǎng)室內(nèi)種植保存。2、離體保存：通過(guò)組織培養(yǎng)，大量繁殖，長(zhǎng)期保存于試管中。思考題：1、莖尖培養(yǎng)的意義；2、莖尖培養(yǎng)的程序；3、怎樣檢測(cè)植株有沒(méi)有病毒？第五章懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)概述植物細(xì)胞培養(yǎng)是植物生物工程的基礎(chǔ)，如植物基因工程要在細(xì)胞或個(gè)體水平上表達(dá)；人工種子，要進(jìn)行同步培養(yǎng);原生質(zhì)體融合，近幾十年發(fā)展起來(lái)利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)次生代謝物的技術(shù)都離不開(kāi)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，此外在植物遺傳、農(nóng)林、園藝等學(xué)科等得到廣泛的應(yīng)用。細(xì)胞培養(yǎng)包括：懸浮細(xì)胞培養(yǎng)（cellsuspensionculture）單細(xì)胞培養(yǎng)（singlecellculture）。懸浮細(xì)胞培養(yǎng)：是將植物細(xì)胞和小細(xì)胞聚集體懸浮在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。其目的是使細(xì)胞能保持較好的分散狀態(tài)。具有以下特征：（1）具有較高的分散程度。（2）細(xì)胞形態(tài)的一致性，大小均一，具有明顯的細(xì)胞核和致密的細(xì)胞質(zhì)。（3）較低的分化程度（4）有規(guī)律性，通常為24~72小時(shí)的細(xì)胞加倍周期，（5）對(duì)外源激素需求一定程度的馴化（6）細(xì)胞全能性暫時(shí)性消失。單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：是將植物的單細(xì)胞置于特殊的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)的細(xì)胞通過(guò)分裂形成細(xì)胞團(tuán)，再經(jīng)細(xì)胞分化形成胚狀體、或根、莖、葉等器官，最后長(zhǎng)成植株。第一節(jié)植物愈傷組織培養(yǎng)一、愈傷組織的概念：愈傷組織（（callus)原是指在植物受傷后傷口表面形成的一團(tuán)薄壁細(xì)胞。在組織培養(yǎng)中則是指在人工培養(yǎng)基上由外植體組織的增生細(xì)胞產(chǎn)生的一團(tuán)不定形的疏松排列的薄壁細(xì)胞。二、愈傷組織的培養(yǎng)的意義：(1)愈傷組織培養(yǎng)是一種最常見(jiàn)的培養(yǎng)形式，除莖尖分生組織和一部分器官培養(yǎng)以外，其他幾種植物組織培養(yǎng)形式最終都要經(jīng)歷愈傷組織才能形成再生植株．(2)愈傷組織還常常是懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞和原生質(zhì)體的來(lái)源．(3)由外植體形成愈傷組織，標(biāo)志著植物組織培養(yǎng)的開(kāi)始．三、愈傷組織形成植物細(xì)胞可以擺脫原來(lái)的遺傳控制和生理制約，在一定條件下，發(fā)生回復(fù)變化，從而失去分化狀態(tài)，變?yōu)榉稚?xì)胞，實(shí)現(xiàn)脫分化過(guò)程，即脫分化過(guò)程．植物細(xì)胞的全能性，可以脫分化之后再次分化為完整的植株（即再分化）。脫分化后的細(xì)胞經(jīng)過(guò)連續(xù)的有絲分裂，形成愈傷組織．幾乎所有高等植物的各種器官離體后都可以脫分化形成愈傷組織。四、愈傷組織的類(lèi)型（由異質(zhì)細(xì)胞集合而成）松脆愈傷組織、致密愈傷組織、有胚性無(wú)胚性、優(yōu)良的愈傷組織特點(diǎn)：高度的胚性或再分化能力、容易散碎，易于建立優(yōu)良的懸浮系、旺盛的自我增殖能力，擴(kuò)大規(guī)模、胚性的保持力強(qiáng)，可以長(zhǎng)期保持易于遺傳操作。五、愈傷組織形成歷程誘導(dǎo)期(inductionstage):通過(guò)一些刺激因素和激素的誘導(dǎo)作用，使接種的外植體的合成代謝加強(qiáng)，迅速積累蛋白質(zhì)和核酸．此期間細(xì)胞體積變化不大。誘導(dǎo)期長(zhǎng)短與種類(lèi)、生理狀態(tài)和外部因素有關(guān)。如菊芋只需要一天誘導(dǎo)時(shí)間分裂期(divisionstage)，顧名思義是指經(jīng)誘導(dǎo)后，外植體開(kāi)始迅速分裂，結(jié)構(gòu)疏松，個(gè)體小，缺少組織結(jié)構(gòu)，生理生化都發(fā)生變化．形成期(formationstage)，是指經(jīng)誘導(dǎo)、分裂后，形成了無(wú)序結(jié)構(gòu)愈傷組織的時(shí)期．即由有序化的過(guò)程，化不同為均一的過(guò)程．這個(gè)時(shí)期愈傷組織特點(diǎn)的有：（1）大而不規(guī)則，高度液泡化，組織較為松散。（2）表面以下約5~10個(gè)細(xì)胞是細(xì)胞生長(zhǎng)中心，這些區(qū)域是愈傷組織的愈傷組織生長(zhǎng)的中心部位分化期(diffrentiationstage)：是指停止分裂的細(xì)胞發(fā)生生理代謝變化，導(dǎo)致形成由不同形態(tài)和功能的細(xì)胞組成的愈傷組織。分化期愈傷組織主要表現(xiàn)在有：（1）細(xì)胞分裂部位和方向發(fā)生改變，表層細(xì)胞分裂減慢，進(jìn)入組織內(nèi)部細(xì)胞的分裂。（2）分化組織瘤狀結(jié)構(gòu)和微管組織形成。（3）細(xì)胞體積不再減小（4）出現(xiàn)各種類(lèi)型的細(xì)胞（5）生長(zhǎng)的愈傷組織一般呈黃色或白色、綠色或淺綠色。六、愈傷組織的繼代培養(yǎng)：一般將愈傷組織長(zhǎng)到2-3cm2時(shí)將其分離，切成4-8塊繼續(xù)培養(yǎng)。生長(zhǎng)迅速的愈傷組織多呈淺色、質(zhì)地松軟。若是愈傷組織分化再生須選擇生長(zhǎng)慢的愈傷組織。繼代周期：一般4~6周，或3~4周。若繼代周期長(zhǎng)，愈傷組織會(huì)出現(xiàn)褐化。如銀杏需在18天內(nèi)繼代一次。發(fā)生部位：愈傷組織生長(zhǎng)只發(fā)生在不與瓊脂接觸的部位，接觸部位上、極少有增殖。因而會(huì)使愈傷組織小塊變成不規(guī)則饅頭狀的組織快。七、愈傷組織培養(yǎng)條件與定向培養(yǎng)愈傷組織培養(yǎng)條件：1外植體（1）基因型對(duì)愈傷組織器官分化有決定性的作用。（2）通常同一種植物的不同器官或組織所形成的愈傷組織差別均不大。但油菜的花器官較葉、根易于分化成苗（3）幼嫩的外植體易于誘導(dǎo)愈傷組織也易于分化成植株。2培養(yǎng)基（1）生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的影響最大。2，4-D是最有效的愈傷組織誘導(dǎo)劑。濃度一般在0.1~10mg/L，生長(zhǎng)素/分裂素型的比例決定愈傷組織器官的分化（２）無(wú)機(jī)鹽（３）有機(jī)物（４）培養(yǎng)基的物理性質(zhì)：固態(tài)、液態(tài)，ＰＨ等3培養(yǎng)條件：光照、溫度２２～２５度不同用途愈傷組織的定向誘導(dǎo)愈傷組織生長(zhǎng)類(lèi)型：（1）生長(zhǎng)素型，愈傷組織較為松脆，生長(zhǎng)在旺盛是進(jìn)行懸浮培養(yǎng)最適合的材料。（2)生長(zhǎng)素/分裂素型（3)細(xì)胞分裂素型，愈傷組織較為堅(jiān)硬。堅(jiān)硬的愈傷組織細(xì)胞間被果膠質(zhì)緊緊粘著，生長(zhǎng)慢，不能形成很好的懸浮系統(tǒng)。，但易分化苗。控制愈傷組織定向轉(zhuǎn)變的因子主要是激素和氮源。還原態(tài)氮促進(jìn)分裂作用。硝態(tài)氮抑制分裂。八、愈傷組織生長(zhǎng)規(guī)律:繼代后在3-7天內(nèi)即可恢復(fù)生長(zhǎng)2~3周內(nèi)愈傷組織處于旺盛時(shí)期生長(zhǎng)達(dá)到頂峰并隨之緩慢下來(lái)（愈傷組織塊達(dá)到最大體積。）即慢快慢繼代培養(yǎng)的最合適時(shí)間：是在愈傷組織生長(zhǎng)快達(dá)到最大體積的時(shí)間.即在愈傷組織生長(zhǎng)即將達(dá)到頂峰之前，九、愈傷組織形態(tài)發(fā)生方式１、器官發(fā)生發(fā)生：（１）愈傷組織形成無(wú)根的芽或無(wú)芽的根（２）先形成芽再在芽基部生根，較為普遍（３）先形成根再分化芽，較為困難。（４）先在愈傷組織臨近不同部位分別形成芽和根，再形成植株。２、體胚發(fā)生:第二節(jié)懸浮培養(yǎng)體系的建立及培養(yǎng)一、懸浮細(xì)胞的特點(diǎn)1、細(xì)胞可以不斷增殖，形成高密度的細(xì)胞群體，適于大規(guī)模培養(yǎng)；2、能夠提供大量較為均勻的細(xì)胞，為研究細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化創(chuàng)造方法和條件。3、懸浮培養(yǎng)中既有單細(xì)胞，也有細(xì)胞團(tuán)。二、起始懸浮液的制備三、懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈S型生長(zhǎng)曲線。（1）延遲期（lagphase）:細(xì)胞分裂少，維持1-2d.（2）對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（exponentialgrowth）:細(xì)胞數(shù)目上迅速增長(zhǎng)；(３)直線生長(zhǎng)期（lineargrowthphase):(4)緩慢期（滯緩期）(decdlerationalphase)：增殖緩慢。(5)靜止期（stationaryphase）:細(xì)胞增長(zhǎng)完全停止.延遲期的特點(diǎn)：其長(zhǎng)短與繼代時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和轉(zhuǎn)入的細(xì)胞數(shù)量有關(guān)。細(xì)胞數(shù)少，延遲期長(zhǎng)，密度低，細(xì)胞很難生長(zhǎng)。繼代的方法和最佳時(shí)期繼代方法：用注射器或移管吸取一定量的含單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)的懸浮培養(yǎng)物，并移到含有新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶里，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。最佳繼代時(shí)期：若縮短繼代時(shí)間的間隔，每個(gè)2-3d繼代一次，則可使懸浮培養(yǎng)細(xì)胞一直保持對(duì)數(shù)生長(zhǎng)。處于靜止期的細(xì)胞進(jìn)行繼代，細(xì)胞會(huì)大量死亡和解體。一般選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和直線生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行繼代。四、影響懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的因素1.起始愈傷組織的接種量：是影響懸浮培養(yǎng)建立質(zhì)量的第二個(gè)主要因素，如煙草中愈傷組織的接種量為100ml2~3g濕重。2.愈傷組織的疏松度（friability）是建立懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵條件（激素調(diào)控）3.培養(yǎng)基的成分一般用MS或B5、ER(無(wú)機(jī)鹽較高），然后稍加改變無(wú)機(jī)及有機(jī)成分。低濃度的氮刺激細(xì)胞分裂形成小細(xì)胞，高氮利于細(xì)胞生長(zhǎng)。其他成分：4.細(xì)胞起始密度：起始密度，一般在0.5~2.5×105細(xì)胞/ml，在培養(yǎng)過(guò)程中可增加到1~4×106，18~25d平均每個(gè)細(xì)胞分裂4~6次，。5.培養(yǎng)基的振蕩頻率：使單細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)分散，有利于氣體交換。轉(zhuǎn)速一般為60-150r/min.起初機(jī)械振蕩至少達(dá)到100~120轉(zhuǎn)/分，懸浮培養(yǎng)建立后速度可以適當(dāng)降低。6.繼代周期：一般20d左右。五、懸浮細(xì)胞的同步培養(yǎng)細(xì)胞同步培養(yǎng)（synchronousdivision）：使細(xì)胞分裂的同步化。有物理方法和化學(xué)法。物理方法（1）體積選擇法：根據(jù)聚集體大小選擇，蘿卜體細(xì)胞胚同步化達(dá)到90%.（2）冷處理法：低溫刺激提高同步化程度?；瘜W(xué)方法（1）饑餓方法：培養(yǎng)基中林和糖類(lèi)物質(zhì)饑餓可阻止G1期和G2期。重新加入成分可獲得同步培養(yǎng)（2）抑制方法：一些DNA合成的抑制劑，如5-氨基尿嘧啶，或胸苷嘧啶核苷酸抑制處理后，使細(xì)胞同時(shí)處于G1期和S期（3）有絲分裂阻抑：加入秋水仙堿組織細(xì)胞停留在中期。六、懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)測(cè)定（1）細(xì)胞計(jì)數(shù):計(jì)數(shù)前需將細(xì)胞團(tuán)中的細(xì)胞游離出來(lái)?？捎?%的三氧化鉻20℃下離析6h。血球計(jì)數(shù)板的用法：深度0.1mm,共有25格，每個(gè)大格有16個(gè)小格，每個(gè)區(qū)域400個(gè)小格，每個(gè)小格的面積為1/400mm2.每次計(jì)25個(gè)大格中的細(xì)胞數(shù)。也可計(jì)算4個(gè)角上的大格數(shù)，加中央大格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)計(jì)算：細(xì)胞數(shù)/ml=5個(gè)大格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)х5х10000х稀釋倍數(shù)（2）細(xì)胞密度體積（packedcellvolume,PCV）:將一定量的細(xì)胞懸浮液放入15ml刻度離心管中，于2000хg離心5min,以每毫升培養(yǎng)液中細(xì)胞總體積的ml數(shù)表示。（3）細(xì)胞鮮重：抽濾去粘著的多余水分，稱重。（4）細(xì)胞干重：烘干重（60℃）（5）活細(xì)胞率的測(cè)定：活細(xì)胞的百分率可作為細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)的起始密度的參考。方法：0.1%酚藏紅花水溶液，丙酮配制二醋酸酯熒光素母液?；罴?xì)胞不染色具熒光，死細(xì)胞染色不具熒光。（6）有絲分裂指數(shù)：處于有絲分裂的細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分?jǐn)?shù)。一般為3~5%熒光素雙醋酸酯法（FDA）法的原理FDA本身不具有極性，不能發(fā)出熒光，可以自由出入細(xì)胞膜。在活細(xì)胞中，F(xiàn)DA被酯酶裂解，釋放出有極性的熒光素。熒光素不能自由穿越質(zhì)膜，在活細(xì)胞中積累。熒光素在死細(xì)胞中不能積累。在UV照射下，活細(xì)胞中的熒光素發(fā)出綠色熒光。第三節(jié)、植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)一、分類(lèi)：分為分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)1.分批培養(yǎng)/成批培養(yǎng)（Batchculture）含義：將愈傷組織培養(yǎng)分散在一定容積的密閉容器中進(jìn)行培養(yǎng)。一般為100~250ml的三角瓶，每瓶咱上能夠右20-75ml培養(yǎng)基。在培養(yǎng)期間,系統(tǒng)內(nèi)的培養(yǎng)物既不能添加也不能放出。它是進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂的生理生化研究常用的培養(yǎng)方法。分批培養(yǎng)的特點(diǎn)：在密閉的容器中，培養(yǎng)基體積固定。培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞生長(zhǎng)，其數(shù)目不斷發(fā)生變化，呈現(xiàn)出明顯的由慢到快，再到慢，最后增長(zhǎng)停止的細(xì)胞周期。細(xì)胞的生長(zhǎng)呈S型曲線。必須適當(dāng)攪拌。當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡時(shí)，細(xì)胞的分裂即停止，需進(jìn)行繼代。分/成批培養(yǎng)容器種類(lèi)：成批培養(yǎng)容器種類(lèi)很多,如單硫酸瓶培養(yǎng)系統(tǒng),雙硫酸瓶培養(yǎng)系統(tǒng),旋轉(zhuǎn)燒瓶培養(yǎng)系統(tǒng)、三角瓶等等.微生物發(fā)酵罐進(jìn)行植物懸浮細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng),發(fā)酵罐的型號(hào)多種多樣,體積有大有小,從幾十升到上萬(wàn)升。2半連續(xù)培養(yǎng)：半連續(xù)培養(yǎng)是一種定時(shí)進(jìn)出裝置的開(kāi)放型的成批培養(yǎng)系統(tǒng).每天或每2d時(shí)間收獲一部分培養(yǎng)物,然后再加入新鮮培養(yǎng)基,并保持培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量的恒定.特點(diǎn)：這種培養(yǎng)系統(tǒng)可在較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)使培養(yǎng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng).連續(xù)培養(yǎng)：連續(xù)培養(yǎng),包括封閉式和開(kāi)放式兩種培養(yǎng)類(lèi)型(1)封閉式連續(xù)培養(yǎng)：是使培養(yǎng)細(xì)胞保持在一個(gè)反應(yīng)器中,在培養(yǎng)過(guò)程中不取出培養(yǎng)細(xì)胞,而是定時(shí)注入定量的培養(yǎng)液和排除等體積的培養(yǎng)物,使培養(yǎng)體積保持不變,單細(xì)胞的數(shù)量不斷增加.二、影響大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的因子（1）植物細(xì)胞的體積大?。阂话阒v，植物細(xì)胞的直徑為20-150u，比細(xì)菌或真菌細(xì)胞大30-100倍左右，所以植物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的密度比微生物更為密集。聚集的細(xì)胞生長(zhǎng)慢（成批培養(yǎng)需2-3周，而微生物發(fā)酵只需幾天時(shí)間），細(xì)胞的異質(zhì)性增加（發(fā)育周期不趨同步）。（2）植物細(xì)胞的重力影響：與微生物相比，植物細(xì)胞顯的大而重，懸浮培養(yǎng)時(shí)很容易沉降，如果反應(yīng)瓶?jī)?nèi)攪拌不能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求，就會(huì)有大量細(xì)胞堆積起來(lái)。氣升式培養(yǎng)容器，適合于大規(guī)模培養(yǎng)植物細(xì)胞，它既有較好的通氣效果，又不會(huì)把植物細(xì)胞撕裂打碎。（3）pH的影響：在植物細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞最適合生長(zhǎng)的pH值在5-6范圍，但在培養(yǎng)過(guò)程中往往會(huì)發(fā)生pH值的改變,變得較小。在反應(yīng)器上裝有pH值探頭，可隨時(shí)檢查培養(yǎng)液中pH的變化而給予調(diào)整。（4）機(jī)械攪拌的剪切力：機(jī)械攪拌會(huì)有較大的剪切力，對(duì)細(xì)胞造成較大損傷第四節(jié)單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)一．單細(xì)胞分離1、由完整的植物器官分離單細(xì)胞（1)無(wú)菌的幼苗和吸脹的胚胎：放在手動(dòng)的玻璃勻漿器中，破碎其軟組織，放入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。(2)葉片是分離單細(xì)胞的最好材料:機(jī)械法(用刀片刮葉片,葉片研碎、離心),酶解法(用果膠酶處理可以分離大量的葉肉細(xì)胞)機(jī)械法和酶解法比較：機(jī)械法：（1）細(xì)胞不受到酶的傷害；（2）不用質(zhì)壁分離；（3）細(xì)胞產(chǎn)量低；（4）細(xì)胞易破。酶解法：（1）細(xì)胞受到酶的傷害；（2）要質(zhì)壁分離；（3）細(xì)胞產(chǎn)量高；（4）細(xì)胞不易破。2、由培養(yǎng)組織中分離單細(xì)胞（1）誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織；（2）愈傷組織反復(fù)繼代，使組織不斷增殖，提高愈傷組織的松散性（3）（Suspensionculture)將愈傷組織在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，建立懸浮培養(yǎng)物.優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞團(tuán)成小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞；在培養(yǎng)基中均勻分布；有空氣交流(4)愈傷組織中分離：放入液體培養(yǎng)基用旋轉(zhuǎn)式搖床（100~110轉(zhuǎn)/分）振蕩振蕩培養(yǎng)；向細(xì)胞懸浮液中通入脈沖壓縮空氣分離細(xì)胞。。二．單細(xì)胞培養(yǎng)1.將植物游離的單細(xì)胞培養(yǎng)獲得單細(xì)胞克隆經(jīng)特殊的培養(yǎng)進(jìn)一步分化出再生植株2.該技術(shù)是植物組織培養(yǎng)研究中的一項(xiàng)重大成就。3.單細(xì)胞培養(yǎng)的植株也為跟蹤和研究離體細(xì)胞的分裂、生長(zhǎng)、分化提供了機(jī)會(huì)。（一）固體培養(yǎng)1平板培養(yǎng)（cellplating）具體方法：將含有0.6%~1.0%的瓊脂培養(yǎng)基冷卻到35℃時(shí)（尚未固化）；將懸浮液（要除去全部組織塊和大的細(xì)胞團(tuán)）接種進(jìn)去，充分混合，倒入培養(yǎng)皿中，約鋪成1mm厚薄層，培養(yǎng)皿用塑料膜封口；在25℃暗處保溫培養(yǎng)，定期用顯微鏡觀察細(xì)胞是否開(kāi)始分裂或生長(zhǎng)成小群體。形成小群體的可繼代在新鮮培養(yǎng)基上。平板培養(yǎng)的植板率高低隨細(xì)胞種類(lèi)、接種密度及培養(yǎng)基的成分不同而不同，細(xì)胞接種密度，一般不能低于103~104個(gè)/ml細(xì)胞。2看護(hù)培養(yǎng)(nurseculture）方法如下：將游離的植物細(xì)胞置于一小塊覆蓋在活躍生長(zhǎng)的愈傷組織之上的濾紙上進(jìn)行培養(yǎng)。原理：生長(zhǎng)中的愈傷組織的某些成分分泌產(chǎn)物可以刺激細(xì)胞的分裂，起到監(jiān)護(hù)培養(yǎng)的作用（nurseeffect）3調(diào)理培養(yǎng)（conditionculture）與監(jiān)護(hù)培養(yǎng)相同的原理，1955年Ropp應(yīng)用此法：在選用的培養(yǎng)基中，加入一定量的已生長(zhǎng)過(guò)組織和細(xì)胞的培養(yǎng)液，離心除去組織或細(xì)胞，稱為調(diào)理培養(yǎng)液；用調(diào)理培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，即使接種的細(xì)胞密度低于最低的有效密度，這些細(xì)胞也能生長(zhǎng)和分裂。這種調(diào)理培養(yǎng)可以大大地降低有限的平板密度。（二）

液體培養(yǎng)1微滴培養(yǎng)：Ropp(1955)最早使用懸滴培養(yǎng)技術(shù)，后不斷改善微滴（microdrop）培養(yǎng)技術(shù)。優(yōu)點(diǎn)：便于在顯微鏡下連續(xù)觀察細(xì)胞地變化，但微環(huán)境易蒸發(fā)和受細(xì)胞代謝的影響而發(fā)生改變。成功率較平板培養(yǎng)低。2液體淺層培養(yǎng)：液滴淺層培養(yǎng)是先在培養(yǎng)皿中注入淺層培養(yǎng)基，再接種上已分散的單細(xì)胞。上述兩種方法主要是將單個(gè)細(xì)胞置于量少的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，使得細(xì)胞產(chǎn)生的活性物質(zhì)被大量的培養(yǎng)液所稀釋，從而達(dá)到自我激活的效果。三、多種方式的綜合培養(yǎng)幾個(gè)設(shè)計(jì)思路：(1)選擇有利于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基（2）利用細(xì)胞之間的相互影響，提高植板率（3）使細(xì)胞處于最有利于細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的狀態(tài)（4）減少培養(yǎng)基體積，使得細(xì)胞和培養(yǎng)基比值相當(dāng)。1固相化培養(yǎng)：固相化培養(yǎng)，使將細(xì)胞（或原生質(zhì)）固著在瓊脂糖、藻酛酸鹽或多聚賴氨酸中；將它們放入液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)。待細(xì)胞克隆出現(xiàn)時(shí)，再取出轉(zhuǎn)入固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn):：這種方法即利用了振蕩培養(yǎng)時(shí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氣體易于交換的特點(diǎn)，又利用了固相化使細(xì)胞內(nèi)免受振蕩時(shí)剪切力的作用。膜室培養(yǎng)：用賽璐玢膜圓筒制成膜室，室內(nèi)放入欲培養(yǎng)的低密度細(xì)胞懸浮液，為雙層培養(yǎng)基，下層為高密度細(xì)胞飼喂。效果比調(diào)理培養(yǎng)及飼喂培養(yǎng)好。三、植物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用：1.植物體細(xì)胞突變體篩選：細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中再生植株或后代中會(huì)出現(xiàn)變異，是由離體培養(yǎng)引起的，稱為體細(xì)胞無(wú)性系變異。用于研究遺傳育種、突變體篩選提供很好的實(shí)驗(yàn)材料。。2植物次生物質(zhì)生產(chǎn)3其他應(yīng)用：代謝生理、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)研究4再生植株：將懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)移到半固體或固體培養(yǎng)基上，使其增值形成愈傷組織，由愈傷組織再生植株或體細(xì)胞胚。第五節(jié)生產(chǎn)次生代謝物一、發(fā)展簡(jiǎn)史：（1）1956年，Routin和Nickell首次提出了利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)天然的產(chǎn)物的專利，經(jīng)不斷努力，多種植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)入中試階段和工廠化生產(chǎn)。（２）1967年Kaul和Staba首次采用多升發(fā)酵罐培養(yǎng)小米細(xì)胞，并獲得了其中的藥用成分--呋喃色酮（Visnagin），這為其后的研究樹(shù)立了成功的典范。（3）進(jìn)入七十年代后，微生物發(fā)酵技術(shù)的進(jìn)步與完善為植物細(xì)胞大量培養(yǎng)提供了寶貴的經(jīng)驗(yàn)。（4）80年代成為該領(lǐng)域發(fā)展的黃金時(shí)期，科學(xué)家們?nèi)〉昧酥卮蟮耐黄啤４笠?guī)模植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)經(jīng)過(guò)幾十年的努力研究已取得很大進(jìn)展。=1\*GB3①植物細(xì)胞大量培養(yǎng)用以生產(chǎn)植物次生代謝物已構(gòu)成了生物工程的重要組成部分，逐漸完善成一門(mén)利用植物細(xì)胞體系（培養(yǎng)細(xì)胞）=2\*GB3②通過(guò)現(xiàn)代的生物工程手段（細(xì)胞大量培養(yǎng)、次生代謝物及其調(diào)控、細(xì)胞突變及其篩選等），進(jìn)行工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)，以獲得各種產(chǎn)品的新興的跨學(xué)科技術(shù)（唐建軍等1998）。迄今為止，全世界已對(duì)近1000種植物進(jìn)行過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)方面的研究，生產(chǎn)的天然產(chǎn)物包括藥品、香料、色素、食品、化妝品等500多種（常鈺等2001有些藥用植物種類(lèi)已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，如通過(guò)希臘毛地黃細(xì)胞培養(yǎng)物生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)地高辛；從日本黃連細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)黃連堿；利用紫松果菊細(xì)胞生產(chǎn)具免疫活性的多糖；利用人參細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)人參皂甙；利用紫草細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)紫草寧等等。二、優(yōu)點(diǎn)：（1）次生物質(zhì)的生產(chǎn)是在可控條件下進(jìn)行的；（2）可通過(guò)條件優(yōu)化和細(xì)胞株篩選得到超越整株植物產(chǎn)量的次生代謝物；（3）培養(yǎng)細(xì)胞是在無(wú)菌條件下生長(zhǎng)，可排除病菌、蟲(chóng)害和重金屬離子等不利因素；（4）可以進(jìn)行特定的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，得到單一的有效成分；（5）可以探索新的合成路線，獲得新的有用物質(zhì)。（6）該技術(shù)不僅節(jié)約能源和時(shí)間，大大減少占地面積，并且不受地域和季節(jié)的影響，保護(hù)了那些天然稀有，生境獨(dú)特，繁殖能力差的藥用植物資源，對(duì)于維持生物多樣性，保持植被具有一定的促進(jìn)作用。三、影響因子：一般選擇葉片，塊莖等；高產(chǎn)細(xì)胞株的篩選（基因型）；Saito等人從短葉紅豆杉和東北紅豆杉的愈傷組織中篩選到的細(xì)胞株，紫杉醇含量達(dá)到了0.05%，是原來(lái)紅豆杉樹(shù)皮中紫杉醇含量的10倍。培養(yǎng)基的選擇：選擇適宜的培養(yǎng)基是關(guān)鍵；碳源：普遍使用的碳源是蔗糖；氮源：通常使用NO3NH4+兩種形式作為細(xì)胞培養(yǎng)的氮源；磷：培養(yǎng)基磷的含量，對(duì)細(xì)胞處理起著重要的作用；微量元素：促進(jìn)合成如加入cu2+可促進(jìn)紫草寧合成高30倍；生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物：2，4-D對(duì)某些培養(yǎng)物中次生代謝的合成有抑制作用；添加物：李弘劍等人（2001）將果膠酶（0.2%）添加到青蒿素合成培養(yǎng)基中，處理黃花蒿培養(yǎng)細(xì)胞2天，青蒿素合成量比未加刺激的細(xì)胞提高了3.08倍；植酸、活性炭稀土，真菌誘導(dǎo)子等。思考題1.懸浮培養(yǎng)的特點(diǎn)是什么？2.愈傷組織生長(zhǎng)的特點(diǎn)有哪些？3.如何得到單離細(xì)胞？4.細(xì)胞培養(yǎng)有哪些方法？5.如何測(cè)定培養(yǎng)細(xì)胞的活力？6.如何計(jì)量培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目？7.FDA測(cè)活力的原理是什么？8.如何獲得同步化的培養(yǎng)細(xì)胞？9.影響單細(xì)胞培養(yǎng)因素？第六章植物花藥和花粉培養(yǎng)第一節(jié)花粉花藥的發(fā)育一、花藥的組成：花藥是植物花的雄性器官，由兩部細(xì)胞組成：其一是體細(xì)胞，包括藥壁和藥壁組織細(xì)胞；其二是雄性性細(xì)胞，即小孢子，一般稱為花粉粒。二、小孢子的正常發(fā)育小孢子母細(xì)胞，即花粉母細(xì)胞，發(fā)育可分為四個(gè)時(shí)期：四分孢子時(shí)期：花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂形成。單核期：特化的細(xì)胞壁形成。雙核期：第一次有絲分裂形成一個(gè)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞核生殖細(xì)胞。三核期：產(chǎn)生兩個(gè)精核?；ǚ鄢墒鞎r(shí)有一個(gè)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和兩個(gè)精細(xì)胞。三、離體培養(yǎng)條件下孢子的發(fā)育1、營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育途徑第一次不均等分裂產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)核與生殖核，生殖核退化，營(yíng)養(yǎng)核經(jīng)過(guò)多次分裂形成細(xì)胞團(tuán)，增殖形成愈傷組織和胚狀體，再生成植株。2、生殖細(xì)胞發(fā)育途徑營(yíng)養(yǎng)核退化，生殖核多次分裂發(fā)育成細(xì)胞團(tuán)。3、營(yíng)養(yǎng)核和生殖核同進(jìn)行發(fā)育途徑4、花粉均等分裂途徑第二節(jié)花粉和花藥培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)單倍體細(xì)胞培養(yǎng)3個(gè)方面：花藥培養(yǎng)、小孢子培養(yǎng)、未受精的子房及細(xì)胞培養(yǎng)?；ㄋ幒托℃咦优囵B(yǎng)是體外誘導(dǎo)單倍體的主要途徑。術(shù)語(yǔ)：花藥培養(yǎng)：將植物的花藥取出，在離體無(wú)菌的條件下，進(jìn)行培養(yǎng)，屬于器官培養(yǎng)?；ǚ蹖儆冢夯ㄋ幍囊徊糠郑詥渭?xì)胞狀態(tài)存在與花藥的藥室中，屬于單細(xì)胞培養(yǎng)。單倍體：指具有配子染色體個(gè)數(shù)的個(gè)體，即細(xì)胞染色體數(shù)為n。分為一倍單倍體、多倍單倍體。單倍體細(xì)胞的歷史Tulecke（1950）：首次成功地培養(yǎng)科數(shù)種裸子植物成熟的花粉粒，大部分花粉可發(fā)育成成熟地花粉，另一些發(fā)育愈傷組織。Yamada(1963):首次報(bào)道優(yōu)紫露草屬植物的花藥中分離得到了單倍體組織。印度地Guha和Maheshwari（1964）成功將曼陀羅成熟的花藥培養(yǎng)在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)了花粉能轉(zhuǎn)變成分裂狀態(tài)，從藥室轉(zhuǎn)化中長(zhǎng)出了胚狀體，獲得單倍體植株。我國(guó)單倍體育種1971年中科院遺傳所對(duì)水稻的花藥培養(yǎng)獲得了水稻幼苗，在小麥培養(yǎng)中獲得單倍體植物。花粉培養(yǎng)始于1953年，Tulecke誘導(dǎo)了銀杏的花粉獲得愈傷組織。另外在天仙子顛茄、小麥等獲得花粉植株。該技術(shù)在10個(gè)科、24個(gè)屬、34個(gè)種的250種植株上達(dá)到了發(fā)展?；ㄋ帯⒒ǚ奂?xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用價(jià)值在植物育種中使后代迅速純合單倍體選擇效率比二倍體高排除雜種優(yōu)勢(shì)對(duì)后代選擇的干擾遺傳研究中良好的實(shí)驗(yàn)材料體系；數(shù)量遺傳、研究細(xì)胞分裂極分化突變體篩選Hamada（1999）用離子束處理煙草的花藥，接種馬鈴薯病毒，從472株花藥再生植株中獲得15株抗病植株。消除致死基因選育新的自交系遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料第三節(jié)花粉培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)：（1）花粉培養(yǎng)可得到單倍體（2）可觀察到單個(gè)體細(xì)胞開(kāi)始雄核發(fā)育的全過(guò)程（3）花粉能均勻地接觸化學(xué)的物理的誘變因素，因而花粉是研究吸收、轉(zhuǎn)化和誘變的理想材料。（4）能從每個(gè)花藥得更多單倍體植株2、花粉分離培養(yǎng)時(shí)期：花粉在單核時(shí)對(duì)于誘導(dǎo)雄核發(fā)育的外界刺激最敏感。3、花粉分離的方法：（1）自然散落法：將花蕾消毒后，取出花藥，接種在培養(yǎng)基上，，當(dāng)花藥開(kāi)裂時(shí)，花粉散落在培養(yǎng)基上。將花藥去除。但效率低，一般不采用。（2）機(jī)械擠壓法擠壓花藥：用平頭大玻璃棒反復(fù)輕輕地?cái)D壓花藥。過(guò)濾收集：用200目的鎳絲網(wǎng)過(guò)濾，使花粉進(jìn)入濾液中心。離心清洗：把濾液放入離心管中，在200r/min速度下離心數(shù)分鐘，使花粉沉淀，吸取上清液，再加培養(yǎng)基懸浮，然后離心。反復(fù)3—4次。把洗凈的花粉沉淀：加入一定量的培養(yǎng)基。（3）破裂釋放法：用工具破裂花藥。4、花粉預(yù)處理（1）低溫處理：可以明顯提高花粉胚的誘導(dǎo)率。例曼陀羅的花蕾連同花梗一起采下，將其插入水中，于3℃保存48h，促進(jìn)花胚的產(chǎn)生。煙草的花藥低溫預(yù)處理在7—9℃下進(jìn)行，處理時(shí)間7—14天為宜。（2）離心處理：處理煙草單核后期的花粉再生頻率從30.5%提高到38.2%。（3）乙烯利處理：在減數(shù)分裂前用乙烯利噴施植株促使花粉細(xì)胞核分裂，促進(jìn)愈傷組織形成。還有利用輻射、高溫、變溫、黑暗或生長(zhǎng)素等處理，對(duì)于培養(yǎng)也有好處。5、花粉培養(yǎng)（1）平板培養(yǎng)法（2）看護(hù)培養(yǎng)法（3）條件培養(yǎng)法：合成培養(yǎng)基中加入失活的花藥提取物，然后接入花粉進(jìn)行培養(yǎng)。6、花粉植株的倍性鑒定方法（1）氣孔保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度：?jiǎn)伪扼w氣孔保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度60um以下，二倍體大于65um，標(biāo)準(zhǔn)率在90%以上。（2）葉綠體數(shù)：染色體倍性與氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)相關(guān)。（3）細(xì)胞染色體數(shù)：采用根尖，鏡檢染色體直接計(jì)數(shù)。7、染色體加倍（1）自然加倍離體培養(yǎng)過(guò)程中染色體自然加倍的現(xiàn)象得到二倍體純合，可通過(guò)培養(yǎng)基成分、溫度等條件調(diào)控。（2）人工加倍采用物理方法如加熱沖擊、伽瑪射線沖擊法第四節(jié)花藥培養(yǎng)花藥培養(yǎng)的一般程序材料的選取：以單核中、晚期花粉為宜，接種前用醋酸洋紅、I-KI溶液等染色壓片法，確定花粉發(fā)育的時(shí)期，如果花藥白色，則過(guò)嫩。處理的預(yù)處理：同花粉處理。材料表面滅菌：70%—75%酒精在表面浸一下在飽和的漂白粉溶液中，浸10—20分鐘或0.1L消毒7—10分鐘，用無(wú)菌水沖洗。接種：每管接種30—60粒，接種密度高些好。培養(yǎng)：一般先在暗處培養(yǎng)，待愈傷組織形成后在移植光下培養(yǎng)，溫度為25—28℃?；ǚ壑仓甑囊浦玻簾煵菝總€(gè)花藥上可產(chǎn)生200株以上的花粉植株。二、花藥培養(yǎng)方法（1）瓊脂固體培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基加入0.5%-0.8%瓊脂，濃度一般以花藥有1/3浸入而不沉沒(méi)于瓊脂中為宜。（2）液體培養(yǎng)法：在培養(yǎng)基中不加入瓊脂，直接把花藥接入呈液體狀態(tài)的培養(yǎng)基中。液體培養(yǎng)基是一薄層（約0.5cm液層）三、影響花粉培養(yǎng)成功的因素1、材料的基因型不同的植物，對(duì)花培的反應(yīng)極為不同。一般茄科的植物花藥培養(yǎng)容易成功，而棉花、大豆的花藥培養(yǎng)至今尚未成功。2、花粉的發(fā)育時(shí)期接種花藥的花粉發(fā)育時(shí)期，是決定花藥培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵因素。如水稻、煙草的花粉，從單核中期到雙核期皆可接受誘導(dǎo)，而小麥、玉米的花粉，以單核中期為佳，番茄、大麥則還要更早。3、培養(yǎng)基的作用（1）基本培養(yǎng)基：主要是MS、N6、B5、Miller、Nitsch等（2）植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑：在培養(yǎng)基中，起關(guān)鍵作用的主要是激素。生長(zhǎng)素與分裂的比例決定愈傷組織的分化程度。（3）糖對(duì)于花藥培養(yǎng)的作用：主要是提高碳源和調(diào)節(jié)滲透壓的作用。在煙草的花藥培養(yǎng)中，蔗糖的濃度在1%—3%的范圍內(nèi)。當(dāng)濃度達(dá)到3%時(shí)出苗率達(dá)到39.06%。當(dāng)濃度達(dá)到4%時(shí)，出苗率降到17.72%。在花藥培養(yǎng)中，蔗糖濃度一般以2%—5%為宜。在分化培養(yǎng)基中，蔗糖的濃度不宜太高，一般在3%左右，太高不利于苗的分化。特殊情況：大麥、小麥等需要9%左右。（4）有機(jī)附加物：促進(jìn)花粉發(fā)育也有著一定的作用。例如：水解乳蛋白（LH）、水解核酸（RH）、酵母提取物（YE）和谷氨酰胺等。（5）活性炭的作用：促進(jìn)花粉中愈傷組織和胚狀體形成的作用。例如1%的活性炭，使煙草花藥出苗率提高1—4倍。0.5%的活性炭，使玉米花藥中愈傷組織或胚狀體的誘導(dǎo)頻率提高1倍左右。（6）培養(yǎng)基中PH值對(duì)培養(yǎng)效果的影響：當(dāng)PH值達(dá)到5.8時(shí)，效果最好。PH值達(dá)到6.5時(shí)，花粉不形成胚狀體，經(jīng)鏡檢，未看到花粉發(fā)生細(xì)胞分裂。（7）植株的生理狀態(tài)：開(kāi)花后期的花藥不宜培養(yǎng)；缺N植株的花藥易培養(yǎng)。（8）條件培養(yǎng)基的作用：指植物組織培養(yǎng)可分泌某些物質(zhì)進(jìn)入培養(yǎng)基，使得培養(yǎng)基條件比，成為條件培養(yǎng)基。思考：花藥培養(yǎng)的意義；花粉的培養(yǎng)方法；花藥培養(yǎng)方法。第七章原生質(zhì)體培養(yǎng)及融合第一節(jié)一、原生質(zhì)體的優(yōu)點(diǎn)及意義原生質(zhì)體：把植物細(xì)胞除去細(xì)胞壁裸露的部分。優(yōu)點(diǎn)：（1）每個(gè)原生質(zhì)體都含有該個(gè)體的全部的遺傳信息，在適當(dāng)?shù)臈l件下，具有再生成與其親本相似個(gè)體的細(xì)胞全能性。（2）在同一時(shí)間內(nèi)獲得的大量原生質(zhì)體在遺傳上是同質(zhì)的，可為細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞生理、細(xì)胞遺傳學(xué)及其他生物學(xué)科提供良好的實(shí)驗(yàn)體系。（3）通過(guò)異源原生質(zhì)體的融合，開(kāi)展植物體細(xì)胞遺傳遠(yuǎn)緣雜交不親和機(jī)理等方面的研究，培育出具有優(yōu)良經(jīng)濟(jì)性狀的新品種。（4）比完整細(xì)胞易于攝取外源物質(zhì)。總之在遺傳轉(zhuǎn)化、改良作物品種、生物學(xué)的基礎(chǔ)研究有廣泛的用途。第二節(jié)原生質(zhì)體的分離及純化一、原生質(zhì)體的分離分為兩步：先除去胞間層，游離出單個(gè)細(xì)胞，再除去各個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞壁。（1）機(jī)械法：將細(xì)胞放在高濃度的糖溶液中。缺點(diǎn)：操作繁瑣，產(chǎn)量低；只用于液泡分化程度較高的細(xì)胞或長(zhǎng)形的細(xì)胞。很少使用。（2）酶法：所用濃度：纖維素酶濃度在0.5—3.0%，也較多的使用纖維素和果膠酶，柑橘用3%的果膠酶和纖維素酶獲得較好的效果。分離原生質(zhì)體所需的時(shí)間：短至30min,長(zhǎng)至20h,一般在4—24h之間。二、原生質(zhì)體培養(yǎng)的材料來(lái)源1、天然材料：包括田間栽培或野生的樹(shù)種（1）幼嫩葉片是分離原生質(zhì)體的號(hào)材料，取材方便，來(lái)源廣泛。（2）取材時(shí)間一般在冬末春初時(shí)，可從幼樹(shù)上切去40—50cm長(zhǎng)帶有休眠芽的枝條插在自來(lái)水中，并放置在生長(zhǎng)室8—10天，就可以萌發(fā)出幼嫩葉片。另外根、莖、子葉、下胚軸、果實(shí)等都可作為分離原生質(zhì)體的來(lái)源。選擇合適的基因型、生理狀態(tài)時(shí)培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。人工培養(yǎng)材料（1）無(wú)菌苗的子葉無(wú)菌苗的子葉分離原生質(zhì)體，不僅省略了表面滅菌的程序，而且獲得較高產(chǎn)量的原生質(zhì)體。（2）愈傷組織或懸浮培養(yǎng)細(xì)胞愈傷組織或懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，是最廣泛使用的原始材料。這些材料不受環(huán)境條件的影響，試驗(yàn)重復(fù)性好，分離的原生質(zhì)體在產(chǎn)量上比幼葉或子葉的產(chǎn)量高。缺點(diǎn)：需要多次繼代后才適于用來(lái)分離原生質(zhì)體。取處于指數(shù)生長(zhǎng)期懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，不僅分離原生質(zhì)體容易，而且可以獲得大量有活性的原生質(zhì)體。選材注意的問(wèn)題：1、選擇具有形態(tài)分化潛力的材料，易于器官發(fā)生。2、選擇經(jīng)過(guò)酶處理后可以達(dá)到大量原生質(zhì)體的材料，使產(chǎn)量維持較高的水平。3、原生質(zhì)體穩(wěn)定性好，不易破碎。4、原生質(zhì)體活性高，可持續(xù)分裂。三、細(xì)胞壁降解酶的種類(lèi)和方法降解細(xì)胞壁常用的酶有果膠酶、纖維素酶和半纖維素酶。果膠酶是從根霉中提取的，用果膠酶可使細(xì)胞間的果膠降解，把細(xì)胞從組織中分離出來(lái)纖維素酶是從綠色木霉中提取的一種復(fù)合酶制劑，其主要作用是降解細(xì)胞壁中纖維素，得到裸露的原生質(zhì)體，此外，還常用的是半纖維素。所需濃度：體積比通常1g鮮重，用10ml酶液。注意：沒(méi)混合液不