臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)主管技師考試輔導(dǎo)《臨床免疫學(xué)和免疫檢驗(yàn)》第二十章 免疫檢驗(yàn)自動(dòng)化儀器分析講義

第二十章免疫檢驗(yàn)自動(dòng)化儀器分析

第一節(jié)自動(dòng)化免疫濁度分析系統(tǒng)

免疫濁度分析屬液相沉淀試驗(yàn)，其基本原理是抗原、抗體在特定的電解質(zhì)溶液中反應(yīng)，形成小分子免

疫復(fù)合物（＜19S）,在增濁劑（如PEG、NaF等）的作用下，迅速形成免疫復(fù)合物微粒（＞19S）,使反

應(yīng)液出現(xiàn)濁度。

根據(jù)檢測(cè)器的位置及其所檢測(cè)的光信號(hào)性質(zhì)不同，免疫濁度分析可分為免疫透射比濁法

（turbi-dimetry）和免疫散射比濁法（nephelometry）。

一、免疫透射比濁法

（-）原理

可溶性抗原抗體反應(yīng)后形成的免疫復(fù)合物，使介質(zhì)濁度發(fā)生改變，光線通過(guò)抗原抗體反應(yīng)后的溶液時(shí),

被其中的免疫復(fù)合物微粒吸收，在保持抗體過(guò)量的情況下，吸光度（A值）與免疫復(fù)合物量呈正相關(guān)。與已

知濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)品相比較，可確定標(biāo)本中抗原的含量。

（二）儀器工作過(guò)程

1.將待檢標(biāo)本和抗原參考品作適當(dāng)稀釋。

2.將待測(cè)標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)抗原溶液（5個(gè)濃度抗原標(biāo)準(zhǔn)品）與適當(dāng)過(guò)量的抗血清混合，在一定條件下，抗原

抗體反應(yīng)完成后，在340nm處測(cè)定各管吸光度。

3.按方程進(jìn)行曲線擬合，制備劑量-反應(yīng)曲線，由計(jì)算機(jī)處理，計(jì)算出抗原濃度。

（三）方法評(píng)價(jià)

透射比濁法靈敏度比單擴(kuò)法高5?10倍，CV小于10%,操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，且能用全自動(dòng)或半全自

動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)，常用于生化指標(biāo)的測(cè)定。

本法的不足在于：

①抗體用量較大

②靈敏度較散射比濁法低

③耗時(shí)較長(zhǎng)

二、免疫膠乳比濁法

用抗體致敏的大小適中、均勻一致的膠乳顆粒，在遇到相應(yīng)抗原時(shí)，膠乳顆粒上的抗體與抗原特異結(jié)

合，引起膠乳顆粒凝聚。分散的單個(gè)膠乳顆粒直徑位于入射光波長(zhǎng)之內(nèi)，不阻礙光線通過(guò)，當(dāng)2個(gè)或2個(gè)

以上膠乳顆粒凝聚時(shí)，透射光和散射光即出現(xiàn)顯著變化?？乖?抗體反應(yīng)后溶液的吸光度或散射光強(qiáng)度與待

測(cè)抗原濃度呈正相關(guān)。采用透射比濁法或散射比濁法測(cè)定。

（二）方法評(píng)價(jià)

本法敏感度大大高于普通比濁法，可達(dá)ng/1.水平，操作簡(jiǎn)便，易自動(dòng)化；血清中的類風(fēng)濕因子（RF）

可與IgGFc段結(jié)合，使IgG致敏膠乳顆粒出現(xiàn)非特異性凝集，用F（ab'）2片段代替IgG既可消除此干

擾，又可克服IgG致敏膠的自凝現(xiàn)象；免疫膠乳輕度自凝或抗體活性降低會(huì)嚴(yán)重影響結(jié)果。

三、免疫散射比濁法

（-）原理

溶液中的微粒受到光線照射后，微粒對(duì)光線產(chǎn)生反射和折射而形成散射光。懸浮微粒對(duì)光散射形成的

散射光強(qiáng)度與微粒的大小、數(shù)量、入射光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度、測(cè)量角度等因素密切相關(guān)。

不同大小微粒形成的散射光分布不同。當(dāng)顆粒直徑小于入射光波長(zhǎng)的1/10時(shí)，散射光強(qiáng)度在各個(gè)方

向的分布均勻一致，稱為Rayleigh散射;當(dāng)粒徑大于入射光波長(zhǎng)的1/10到接近入射光波長(zhǎng)時(shí)，隨著顆粒

直徑增大，向前散射光強(qiáng)于向后散射光，稱為Debye散射;當(dāng)顆粒直徑等于或大于入射光波長(zhǎng)時(shí)，向前散

射光遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于向后散射光，稱為Mile散射。

(-)定時(shí)散射比濁法

定時(shí)散射比濁法是在保證抗體過(guò)量的情況下，加入待測(cè)抗原，此時(shí)反應(yīng)立即開(kāi)始，在反應(yīng)的第一階段,

溶液中產(chǎn)生的散射光信號(hào)波動(dòng)較大，所獲取的信號(hào)計(jì)算出的結(jié)果會(huì)產(chǎn)生一定的誤差。

1.儀器測(cè)定技術(shù)要點(diǎn)

(1)抗原抗體預(yù)反應(yīng)階段。

(2)反應(yīng)階段：加入全量標(biāo)本，在4分鐘內(nèi)測(cè)量散射光信號(hào)。

(3)信號(hào)檢測(cè)：將獲得的信號(hào)值，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理轉(zhuǎn)換為待測(cè)抗原濃度。

2.抗原過(guò)量檢測(cè)為保證檢測(cè)時(shí)所獲取的信號(hào)峰值是由被檢抗原產(chǎn)生的，應(yīng)使所有未知抗原全部與抗體

結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物，在本方法中采用了兩項(xiàng)保證措施：

(1)抗體過(guò)量。

(2)對(duì)抗原過(guò)量進(jìn)行閾值限定。

(三)速率散射比濁法

速率散射比濁法是抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)測(cè)定法

速率是指抗原抗體反應(yīng)在單位時(shí)間內(nèi)形成免疫復(fù)合物的量(不是免疫復(fù)合物累積的量)，連續(xù)測(cè)定各

單位時(shí)間內(nèi)復(fù)合物形成的速率與其產(chǎn)生的散射光信號(hào)聯(lián)系在一起，形成動(dòng)態(tài)的速率散射比濁法，每項(xiàng)檢測(cè)

僅1?2分鐘即可完成。

選取速率最大，且與被測(cè)物濃度變化呈線性關(guān)系的速率峰值，制作劑量-反應(yīng)曲線，通過(guò)計(jì)算機(jī)計(jì)算可

獲得被測(cè)物濃度的量。

儀器測(cè)定技術(shù)要點(diǎn)：

(1)開(kāi)啟機(jī)器，進(jìn)行定標(biāo)。

(2)反應(yīng)階段。

(3)抗原過(guò)量檢測(cè)。

(四)方法評(píng)價(jià)

散射比濁法是目前臨床應(yīng)用較多的一種方法，本法自動(dòng)化程度高，具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、精密等優(yōu)

點(diǎn)。采用抗原過(guò)量檢測(cè)方法，保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。但儀器和試劑價(jià)格比較貴，對(duì)抗體的質(zhì)量要求很高。

四、免疫比濁分析的影響因素和臨床應(yīng)用

(一)免疫比濁分析的影響因素

L抗原抗體比例

2.抗體的質(zhì)量

3.增濁劑的使用

4.偽濁度非抗原抗體特異性結(jié)合形成的濁度，稱為偽濁度，可導(dǎo)致抗原檢測(cè)結(jié)果假性升高。偽濁度形

成的原因包括：①混濁標(biāo)本、高血脂標(biāo)本、反復(fù)凍融標(biāo)本；②抗體效價(jià)低(<1：20)、抗血清滅活處理、

抗血清含有交叉反應(yīng)性抗體等；③增濁劑PEG濃度過(guò)高；④抗血清細(xì)菌污染和變質(zhì)；⑤器材尤其是比色杯

不清潔、塵埃污染等；⑥緩沖液的離子強(qiáng)度太高，pH和溫度不適合等，都對(duì)濁度產(chǎn)生影響。

5.入射光光源和波長(zhǎng)

6.結(jié)果報(bào)告中的計(jì)量單位

7.標(biāo)準(zhǔn)曲線制備與質(zhì)量控制應(yīng)用儀器規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)品制備劑量-反應(yīng)曲線，一般采用5點(diǎn)或6點(diǎn)定標(biāo)，

然后選擇適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)方法進(jìn)行曲線擬合；每更換一批試劑，應(yīng)重新制備劑量-反應(yīng)曲線。為保證結(jié)果準(zhǔn)確可

靠，選取合適的質(zhì)控血清，每次開(kāi)機(jī)進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量控制是極其必要的。

(二)臨床應(yīng)用

免疫比濁分析法主要用于檢測(cè)血漿、體液中的特定蛋白系列。

特定蛋白成分的定量檢測(cè)，可為臨床診斷、療效觀察、預(yù)后分析提供依據(jù)。

第二節(jié)自動(dòng)化發(fā)光免疫分析系統(tǒng)

自動(dòng)化發(fā)光免疫分析儀主要由樣本盤、試劑盤(盒)、溫育反應(yīng)系統(tǒng)、固相載體分離清洗系統(tǒng)、信號(hào)

檢測(cè)系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理、控制系統(tǒng)組成。

一、口丫咤酯標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析儀

口丫口定酯標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀是一種用發(fā)光劑直接標(biāo)記抗體或抗原的一類免疫分析法。該儀器利

用化學(xué)發(fā)光技術(shù)和磁性微粒子分離技術(shù)，以哇咤酯為化學(xué)發(fā)光劑，以細(xì)小的順磁性微粒為固相載體。

其測(cè)定原理與雙抗體夾心法、雙抗原夾心法和競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合法等相同。

儀器測(cè)定技術(shù)要點(diǎn)：

(1)抗原抗體結(jié)合。

(2)洗滌、分離。

(3)加入氧化劑發(fā)光。

(4)信號(hào)檢測(cè)。

二、酶聯(lián)發(fā)光免疫分析儀

前聯(lián)發(fā)光免疫分析儀是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光或熒光反應(yīng)的酶來(lái)標(biāo)記抗原或抗體，在抗原抗體反應(yīng)

后，加入底物(發(fā)光劑)，由酶催化和分解底物發(fā)光，通過(guò)光信號(hào)的強(qiáng)弱來(lái)進(jìn)行被測(cè)物的定量。常用的標(biāo)

記酶有辣根過(guò)氧化物醐(HRP)和堿性磷酸酶(ALP),常用的發(fā)光底物有魯米諾、AMPPD和4-MUP。

(一)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀

該儀器采用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記抗原或抗體、以塑料錐形小管為固相載體，魯米諾為化學(xué)發(fā)光

劑，還利用增強(qiáng)劑使化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度增加、時(shí)間延長(zhǎng)。

儀器測(cè)定技術(shù)要點(diǎn)：

(1)抗原抗體結(jié)合。

(2)洗滌、分離。

(3)加入信號(hào)試劑A和氧化劑B。

(4)信號(hào)檢測(cè)。

(二)堿性磷酸酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀

該儀器是以堿性磷酸酶標(biāo)記抗原或抗體，以順磁性微粒子為固相載體，用AMPPD作為化學(xué)發(fā)光劑進(jìn)行

測(cè)定的自動(dòng)化儀器。這種化學(xué)發(fā)光劑發(fā)光穩(wěn)定，持續(xù)時(shí)間可達(dá)幾十分鐘，容易測(cè)定，容易控制。

儀器測(cè)定技術(shù)要點(diǎn)：

(1)抗原抗體結(jié)合。

(2)洗滌、分離。

(3)加入AMPPD發(fā)光劑。

(4)信號(hào)檢測(cè)。

(三)堿性磷酸酶標(biāo)記的微粒子熒光免疫分析儀

該儀器以堿性磷酸酶標(biāo)記抗原或抗體，以塑料微粒為固相載體包被抗體(或抗原)，以4-甲基傘型酮

磷酸鹽（47IUP）作為酶促反應(yīng)的熒光基質(zhì)（底物），底物被酶水解后，脫磷酸根基團(tuán)，形成4-甲基傘型酮

（4-MU）,用360nm激發(fā)光照射，發(fā)出450nm的熒光。

儀器測(cè)定技術(shù)要點(diǎn)：

（1）抗原抗體結(jié)合。

（2）洗滌、分離。

（3）加入底物4-MUP。

（4）信號(hào)檢測(cè)。

三、電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀

一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個(gè)過(guò)程。

電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀是采用電化學(xué)發(fā)光技術(shù)、生物素放大技術(shù)，以順磁性微粒為固相載體，用三聯(lián)

噴咤釘標(biāo)記抗原或抗體，三丙胺（TPA）為電子供體，而設(shè)計(jì)的一種自動(dòng)化分析儀器。

儀器測(cè)定技術(shù)要點(diǎn)：

（1）抗原抗體結(jié)合。

（2）電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。

（3）光信號(hào)檢測(cè)。

（4）檢測(cè)完畢。

四、在臨床免疫檢測(cè)中的應(yīng)用

目前自動(dòng)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)都是采用將發(fā)光技術(shù)與免疫反應(yīng)和計(jì)算機(jī)技術(shù)完美結(jié)合的自動(dòng)化儀器分

析。可用于內(nèi)分泌激素類、腫瘤標(biāo)志物類、心肌標(biāo)志物類、病毒標(biāo)志物類、治療性藥物濃度、骨代謝指標(biāo)

和貧血類等方面的檢測(cè)，是目前免疫化學(xué)應(yīng)用最為廣泛的新技術(shù)。

第三節(jié)自動(dòng)化熒光免疫分析系統(tǒng)

熒光免疫自動(dòng)化分析主要是將抗原抗體結(jié)合反應(yīng)與熒光物質(zhì)發(fā)光分析和計(jì)算機(jī)技術(shù)有機(jī)結(jié)合的一項(xiàng)自

動(dòng)化免疫分析技術(shù)。

熒光免疫自動(dòng)化分析儀包括樣本盤、試劑盤（盒）、條碼識(shí)別系統(tǒng)、儀器控制系統(tǒng)、信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)、

數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，能自動(dòng)進(jìn)行加樣、溫育、洗滌、分離、熒光強(qiáng)度測(cè)定和報(bào)告打印等功能。

根據(jù)抗原抗體反應(yīng)后是否需要進(jìn)行固相分離，分為均相和非均相兩類。

非均相熒光免疫測(cè)定主要有時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定法。

均相熒光免疫測(cè)定主要有熒光偏振免疫測(cè)定法。

一、時(shí)間分辨熒光免疫分析儀

時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定（TRFIA）是以鐲系元素標(biāo)記抗原或抗體作為示蹤物，并與時(shí)間分辨測(cè)定技術(shù)相

結(jié)合，建立起來(lái)的一種新型非放射性微量分析技術(shù)，具有靈敏度高，鐲系元素發(fā)光穩(wěn)定，熒光壽命長(zhǎng)，不

受樣品自然熒光干擾，標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬等特點(diǎn)，己在臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用。

（一）原理

鐲系元素中Eu“最為常用。它的激發(fā)光譜帶較寬（波長(zhǎng)為300?350nm）,發(fā)射光譜帶窄（多在

613nm±10nm）,在此波段內(nèi)，來(lái)自生物樣品的熒光干擾少。激發(fā)光譜和發(fā)射光譜之間的Stokes位移大，

約為270nm,能有效地把激發(fā)光和發(fā)射的熒光分開(kāi)。

（二）儀器測(cè)定技術(shù)要點(diǎn)以雙抗體夾心法為例

1.抗原抗體結(jié)合

2.加入Eu"螯合抗體

3.加入酸性增強(qiáng)液

4.信號(hào)檢測(cè)

（三）解離增強(qiáng)原理

被鐲系元素標(biāo)記的抗體或抗原形成的如銅標(biāo)記抗原-抗體復(fù)合物在弱堿性反應(yīng)液中經(jīng)激發(fā)后的熒光信

號(hào)較弱，必須再加入一種增強(qiáng)液，使Eu"-抗體-抗原復(fù)合物的pH降低至2?3,以利于Eu"從復(fù)合物上完全

解離下來(lái)。

（四）注意事項(xiàng)

LTRFIA分析用的酸性增強(qiáng)液易受環(huán)境、試劑、容器等里面的錮系元素污染，使本底升高，所用試劑

和器材應(yīng)盡量防塵。

2.TRFIA分析用載體最常用的是聚苯乙烯微96孔板,其熒光本底低，并有洗滌微孔板的自動(dòng)裝置，但

不同廠家生產(chǎn)的微孔板，所產(chǎn)生的熒光有很大差異，應(yīng)選擇應(yīng)用。

二、熒光偏振免疫分析儀

熒光偏振免疫測(cè)定（FPIA）為一種均相熒光免疫測(cè)定方法，其利用熒光物質(zhì)在溶液中被單一平面的偏

振光（波長(zhǎng)485nm）照射后，可吸收光能而產(chǎn)生另一單一平面的偏振發(fā)射熒光（波長(zhǎng)525nm）,該熒光強(qiáng)度

與熒光標(biāo)志物質(zhì)在溶液中旋轉(zhuǎn)的速度與分子大小成反比，常采用抗原抗體