《甘蔗葉片赤腐病抗性評價(jià)技術(shù)規(guī)程》草案

1T/CATEAXXXX—2024本文件確立了甘蔗葉片赤腐病抗病性評價(jià)技術(shù)規(guī)程，規(guī)定了術(shù)語和定義、評價(jià)程序、接種體制備、接種、病情調(diào)查及抗病性評價(jià)的要求。本文件適用于甘蔗種質(zhì)材料和甘蔗品種（系）對葉片赤腐病的抗性評價(jià)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。T/CSTC02-2023甘蔗梢腐病抗性評價(jià)技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1甘蔗葉片赤腐病sugarcaneleafredrotdisease由鐮孢炭疽菌（ColletotrichumfalcatumWent）引起的發(fā)生在甘蔗葉片上的真菌病害。4評價(jià)程序甘蔗葉片赤腐病評價(jià)流程包括6個(gè)步驟，評價(jià)流程圖見圖1。圖1甘蔗葉片赤腐病抗性評價(jià)流程2T/CATEAXXXX—20245接種體制備5.1病原菌分離評價(jià)用真菌分離培養(yǎng)的方法從葉片赤腐病病葉上的病原物，并用病原物的特異引物ITS1/ITS4進(jìn)行PCR分子評價(jià)。葉片赤腐病病原菌的詳細(xì)信息見附錄A。5.2病原菌的保存用50%甘油懸浮，于-80℃超低溫冰箱進(jìn)行長期保存。5.3病原菌接種體制備將保存的菌株活化至PDA培養(yǎng)基平皿上，置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5d，用5mm打孔器制成菌餅用于接種。6接種6.1田間自然接種6.1.1田間鑒定圃田間鑒定圃設(shè)置參照T/CSTC02-2023的要求執(zhí)行。6.1.2田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)每個(gè)材料挑選蔗芽飽滿、一致的種芽300個(gè)于春季種植在鑒定圃中。試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，單行區(qū)，行長8m~10m、行距1.2m，3次重復(fù)，每個(gè)小區(qū)種植100個(gè)芽，試驗(yàn)區(qū)四周設(shè)置保護(hù)行。試驗(yàn)材料包括高感和高抗對照種，標(biāo)準(zhǔn)對照品種見附錄B。6.2人工接種6.2.1室內(nèi)苗期接種溫室環(huán)境溫度保持在27℃~33℃,濕度保持在75%~88%。采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)材料每個(gè)重復(fù)30株苗，將待評價(jià)材料種植于桶內(nèi)，每個(gè)桶內(nèi)保留3株苗，試驗(yàn)材料包括高感和高抗標(biāo)準(zhǔn)對照品種，詳見附錄B。待甘蔗材料長到4葉~5葉期時(shí)，使用無菌注射器在甘蔗葉片中部中脈造成微創(chuàng)傷口，將菌餅貼在創(chuàng)傷處，用保鮮膜包裹，用PDA無菌菌餅作陰性對照。6.2.2離體葉段接種拔節(jié)初期選取長勢一致的待評價(jià)甘蔗材料+1葉30片，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，包括高感和高抗標(biāo)準(zhǔn)對照品種，詳見附錄B。剪取8cm~10cm整齊對稱無裂痕葉段，使用無菌注射器在甘蔗葉片中部中脈造成微創(chuàng)傷口，將菌餅貼在創(chuàng)傷處，置于含有三層消毒濕潤濾紙的方盤中，每個(gè)品種每個(gè)重復(fù)接種葉片放置于同一個(gè)方盤，保證相同的濕度條件，用保鮮膜將方盤密封，置于25℃~30℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光周期為12h光照/12h黑暗，用PDA無菌菌餅作陰性對照。7病情調(diào)查7.1調(diào)查時(shí)間3T/CATEAXXXX—20247.1.1田間自然接種在甘蔗伸長盛期7月、8月、9月，每月調(diào)查一次。7.1.2室內(nèi)苗期在接種后7d~10d觀察到葉片赤腐病癥狀，每隔24h記錄發(fā)病情況，持續(xù)觀察30d直至病情穩(wěn)定。7.1.3離體葉段在接種后24h觀察到葉片赤腐病癥狀，每隔24h記錄發(fā)病情況，持續(xù)觀察7d直至病情穩(wěn)定。7.2分級標(biāo)準(zhǔn)甘蔗葉片赤腐病評價(jià)分級標(biāo)準(zhǔn)見附錄C。7.3記載方法田間自然接種和室內(nèi)苗期抗性評價(jià)記載方式為分別記錄每個(gè)重復(fù)的總株數(shù)，用目測法統(tǒng)計(jì)甘蔗葉片的發(fā)病株數(shù)及每一株的病害級別，調(diào)查并記載病害級別。甘蔗葉片赤腐病田間自然接種和室內(nèi)苗期抗性評價(jià)調(diào)查記載匯總表見附錄D表D.1。離體葉段抗性評價(jià)記載方式為通過觀察和測量病斑的長度，統(tǒng)計(jì)記錄甘蔗葉段的病害級別。甘蔗葉片赤腐病離體葉段抗性評價(jià)調(diào)查記載匯總表見附錄D表D.2。8抗病性評價(jià)8.1病情指標(biāo)計(jì)算根據(jù)病情癥狀描述，計(jì)算發(fā)病率（IC）。發(fā)病率按式（1）計(jì)算×100....................................................................根據(jù)病情癥狀描述，計(jì)算病情指數(shù)（DI）。病情指數(shù)按式（2）計(jì)算。×100..............................................................式中：IC——為發(fā)病率；DI——為病情指數(shù)；S——為最高病級值；M——為發(fā)病總株數(shù)；N——為調(diào)查總株數(shù)；n——為各級病株數(shù)；s——為發(fā)病等級值。8.2抗性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)8.2.1田間自然接種抗性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)評價(jià)材料的最高病情指數(shù)確定抗性水平，劃分標(biāo)準(zhǔn)見附錄E表E.1。4T/CATEAXXXX—20248.2.2室內(nèi)苗期抗性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)評價(jià)材料的最高病情指數(shù)確定抗性水平，劃分標(biāo)準(zhǔn)見附錄E表E.2。8.2.3離體葉段抗性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)評價(jià)材料微創(chuàng)傷口接種處的病害擴(kuò)展程度確定抗性水平，劃分標(biāo)準(zhǔn)見附錄E表E.3。8.3有效性判別感病對照品種或任一評價(jià)材料的抗性類別達(dá)到感病或以上時(shí)，該批次評價(jià)有效。8.4重復(fù)評價(jià)初次評價(jià)中表現(xiàn)為中抗和感病的材料，用相同的病原菌進(jìn)行重復(fù)評價(jià)，不同批次間評價(jià)結(jié)果不一致時(shí)，宜以最低抗性類別為準(zhǔn)。8.5抗病性評價(jià)報(bào)告宜以單個(gè)品種單獨(dú)出具，如集中批量送樣，也可多個(gè)品種出一份報(bào)告。評價(jià)結(jié)果報(bào)告單見附錄D表D.3，原始記錄應(yīng)保存完好備查。5T/CATEAXXXX—2024（資料性）甘蔗葉片赤腐病病原菌的生物學(xué)特性及分離鑒定和保存方法A.1生物學(xué)特性甘蔗葉片赤腐病病原菌為鐮孢炭疽菌（Colletotrichumfalcatumwent將葉片分離到的病原菌侵染蔗莖，發(fā)現(xiàn)該病原菌未對蔗莖造成侵染，同時(shí)在廣西田間赤腐病主要以葉片赤腐病形式存在，莖赤腐病發(fā)生較少，有研究表明葉片赤腐病分離到的病原菌不會(huì)對蔗莖造成傷害，與本研究結(jié)果一致。篩選到強(qiáng)致病菌株CF5，菌落呈圓形，菌絲體白色或灰色，分生孢子半月形，平均25μm×6μm，單孢，色淺，無隔膜，內(nèi)含粒狀物及優(yōu)點(diǎn)，常具一個(gè)中央大液泡，分生孢子密集時(shí)呈粉紅色或橙紅色，分生孢子長55μm~65μm，分生孢子梗長圓形，淡色，無隔膜，著生于分生孢子盤中，在分生孢子梗中雜有剛毛。除分生孢子外，此菌還常產(chǎn)生能抵抗干旱和不良環(huán)境的厚垣孢子，呈墨綠色，圓形或橢圓形，含油點(diǎn)，多生在菌絲的頂端，脫落后即發(fā)芽入侵寄主（圖A.1）。圖A.1甘蔗葉片赤腐病菌的菌落和分生孢子形態(tài)A.2病原菌分離、保存與鑒定A.2.1分離A.2.1.1分離病原菌取病健交界處（病斑與健康部分的交界處）的甘蔗葉片，剪成邊長為0.3cm~1.5cm大小的長方形葉片，在超凈工作臺(tái)中，將葉片置于0.1%升汞中滅菌30s，而后在70%的酒精溶液中浸泡30s，最后用ddH2O清洗三遍，置于滅菌濾紙上自然晾干。用鑷子將3片~5片葉片置于含100μg/mL氨芐青霉素的PDA培養(yǎng)基上，28℃倒置暗培養(yǎng)3d~4d。A.2.1.2培養(yǎng)純化6T/CATEAXXXX—2024待菌落長出后，挑取不同形態(tài)的菌落進(jìn)行劃線純化培養(yǎng)，28oC倒置培養(yǎng)2d~3d后，純化3~4代，直到菌株為純合。A.2.1.3真菌微生物的制備在無菌操作的條件下，取二代純化后的培養(yǎng)平板，使用滅菌的無菌槍頭挑取單個(gè)菌落邊緣的真菌置于PDW液體培養(yǎng)基中，于28oC搖床200rpm震蕩培養(yǎng)5d。A.2.2菌株保存及病原菌DNA提取無菌操作條件下，吸取菌液400μL于2mL離心管中，加入等體積的50%甘油混勻，用封口膜密封，置于-80oC保存菌株?；蚪MDNA使用真菌基因組試劑盒提取。A.2.3鑒定A.2.3.1病原菌分子鑒定利用特異引物ITS1/ITS4進(jìn)行PCR評價(jià)（ITS15’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS45’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。PCR反應(yīng)體系總體積為25μL，內(nèi)含2×Taqmix12.5μL，引物（10μmol/L）各1.0μL，40ng模板DNA1μL，ddH2O9.5μL。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用Bio-Rad公司凝膠成像系統(tǒng)照相，400bp處觀察到單一條帶，PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行測序、比對（序列GenBank登錄號(hào)：PP217426）。A.2.3.2致病性測定依據(jù)人工接種高感材料的病情指數(shù)確定菌株致病力，當(dāng)病情指數(shù)達(dá)到25以上，表明菌株致病力強(qiáng)。抗病性評價(jià)應(yīng)選取強(qiáng)致病力的菌株進(jìn)行。取純化后目標(biāo)菌株的培養(yǎng)平板，無菌條件下挑取單菌落邊緣菌絲接種于PDA培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5d，即菌株處于生命力極旺盛的指數(shù)生長期時(shí)，用5mm打孔器制成菌餅用于接種。使用無菌注射器在甘蔗葉片中部中脈造成微創(chuàng)傷口，將菌餅貼在創(chuàng)傷處，用保鮮膜進(jìn)行包裹，用PDA無菌菌餅作陰性對照。接種于易感品種中蔗9號(hào)，7d時(shí)開始記錄發(fā)病情況，此后每24h調(diào)查一次，持續(xù)觀察30d，直至病情穩(wěn)定。7T/CATEAXXXX—2024標(biāo)準(zhǔn)對照品種B.1標(biāo)準(zhǔn)對照品種在同一試驗(yàn)環(huán)境下，待測材料的抗性要參照已知抗性的標(biāo)準(zhǔn)對照品種見表B.1。表B.1甘蔗葉片赤腐病抗性對照品種抗性類別對照品種高抗（HR）新臺(tái)糖22號(hào)、新臺(tái)糖16號(hào)抗?。≧）云蔗99-596、桂糖03-351中抗（MR）CP88-1762、桂糖21號(hào)感病（S）中蔗1號(hào)、福農(nóng)04-3504高感（HS）中蔗9號(hào)、中蔗6號(hào)8T/CATEAXXXX—2024甘蔗葉片赤腐病分級標(biāo)準(zhǔn)C.1甘蔗葉片赤腐病分級標(biāo)準(zhǔn)甘蔗葉片赤腐病分級標(biāo)準(zhǔn)，以每株中發(fā)病最嚴(yán)重的葉片為準(zhǔn)，田間自然接種和室內(nèi)苗期劃分標(biāo)準(zhǔn)圖見圖C.1，對應(yīng)癥狀描述見表C.1。圖C.1甘蔗葉片赤腐病田間自然接種和室內(nèi)苗期分級標(biāo)準(zhǔn)圖表C.1甘蔗葉片赤腐病田間自然接種和室內(nèi)苗期病害級別病害級別癥狀描述0無癥狀1葉片中脈出現(xiàn)少許紅色小點(diǎn)或病斑2葉片中脈紅色病斑蔓延至全葉五分之一3葉片中脈病斑蔓延至全葉五分之三，呈紅褐色，中脈附近葉片褪綠黃化4整片葉中脈均為深紅褐色病斑，部分葉片出現(xiàn)折斷、下垂9T/CATEAXXXX—2024離體葉段劃分標(biāo)準(zhǔn)圖見圖C.2，對應(yīng)癥狀描述見表C.2。圖C.2甘蔗葉片赤腐病離體葉段分級標(biāo)準(zhǔn)圖表C.2甘蔗葉片赤腐病離體葉段病害級別病害級別癥狀描述0接種點(diǎn)出現(xiàn)輕微紅色病斑≤1.00cm1葉片中脈紅褐色病斑蔓延1.01cm~3.00cm2葉片中脈紅褐色病斑蔓延3.01cm~5.00cm，葉片出現(xiàn)輕微褪綠黃化3葉片中脈紅褐色病斑蔓延5.01cm~8.00cm，葉片褪綠面積增大4整個(gè)葉片中脈幾乎均為深紅褐色病斑，葉片嚴(yán)重褪綠，出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象T/CATEAXXXX—2024調(diào)查記載匯總表和結(jié)果報(bào)告單D.1甘蔗葉片赤腐病田間自然接種和室內(nèi)苗期抗性評價(jià)調(diào)查記載匯總表見表D.1。表D.1甘蔗葉片赤腐病田間自然接種和室內(nèi)苗期抗性評價(jià)調(diào)查記載匯總表鑒定方法調(diào)查株數(shù)各級病情株數(shù)病情指數(shù)抗病性水平備注2級4級評價(jià)人員：復(fù)核人員：日期：注：在開展評價(jià)調(diào)查時(shí)，評價(jià)人員與復(fù)核人員一同進(jìn)行，評價(jià)人員對評價(jià)植株病害級別進(jìn)行判斷，經(jīng)復(fù)核人員確定后記載。D.2甘蔗葉片赤腐病離體葉段評價(jià)調(diào)查記載匯總表見表D.2。表D.2甘蔗葉片赤腐病離體葉段抗性評價(jià)調(diào)查記載匯總表離體葉片數(shù)量各級葉片數(shù)量抗病性水平備注2級4級評價(jià)人員：復(fù)核人員：日期：注：在開展評價(jià)調(diào)查時(shí)，評價(jià)人員與復(fù)核人員一同進(jìn)行，評價(jià)人員對評價(jià)植株病害級別進(jìn)行判斷，經(jīng)復(fù)核人員確定后記載。T/CATEAXXXX—2024D.3甘蔗品種（系）葉片赤腐病抗性評價(jià)結(jié)果報(bào)告單見表D.3。表D.3甘蔗品種（系）葉片赤腐病抗性評價(jià)結(jié)果報(bào)告單品種編號(hào)品種名稱委托評價(jià)單位評價(jià)編號(hào)樣品接收時(shí)間樣品數(shù)量評價(jià)項(xiàng)目評價(jià)依據(jù)評價(jià)結(jié)果評價(jià)地點(diǎn)評價(jià)依據(jù)評價(jià)方法非自然接種的接種體組成種植日期接種日期調(diào)查日期病情指數(shù)/病斑長度抗病性水平結(jié)論備注制表人：審核人：批準(zhǔn)人：日期：注：評價(jià)結(jié)果報(bào)告應(yīng)蓋評價(jià)單位公章，應(yīng)有制表人、審核人和批準(zhǔn)人簽字。T/CATEAXXXX—2024抗性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)E.1田間自然接種抗性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表E.1。表E.1田間自然接種抗性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)抗性級別發(fā)病率(IC)病情指數(shù)(DI)抗性類別00<IC≤20%0<DI≤10高抗（HR）120<IC≤35%10<DI≤20抗?。≧）235<IC≤50%20<DI≤35中抗（MR）350<IC≤70%35<DI≤50感病（S）4高感（HS）E.2室內(nèi)苗期抗性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表E.2。表E.2室內(nèi)苗期抗性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)抗性級別病情指數(shù)(DI)抗性類別00<DI≤5高抗（HR）15<DI≤10抗病（R）210<DI≤15中抗（MR）315<DI≤25感?。⊿）4高感（HS）注：苗期接種發(fā)病率100%，以病情指數(shù)進(jìn)行抗性評價(jià)。E.3離體葉段抗性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表E.3。表E.3離體葉段抗性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)抗性級別癥狀描述（病斑長度）抗性類別0接種點(diǎn)出現(xiàn)輕微紅色病斑≤1.00cm高抗（HR）1紅褐色病斑蔓延（病斑暈圈沿中脈方向長度1.01cm~3.00cm）抗?。≧）2紅褐色病斑蔓延，葉片出現(xiàn)輕微褪綠黃化（病斑暈圈沿中脈方向長度3.01cm~5.00cm）中抗（MR）3紅褐色病斑蔓延，葉片褪綠面積增大（病斑暈圈沿中脈方向長度5.01cm~8.00cm）感病（S）4整個(gè)葉片中脈幾乎均為深紅褐色病斑，葉片嚴(yán)重褪綠，出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象（病斑暈圈沿中脈方向長度>8.01cm）高感（HS）T/CATEAXXXX—2024參考文獻(xiàn)[1]《中華人民共和國農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全法》2022年修訂.[2]AbbottE.PhysiologicformsofColletotrichumfalcatumWent.Phytopathology,1933,23,557-559.[3]李婕,張榮躍,王曉燕,