微生物成品 (終極版)

黃原膠生產(chǎn)應(yīng)用研究進展

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黃原膠發(fā)酵生產(chǎn)工藝簡介發(fā)酵生產(chǎn)方法改良黃原膠應(yīng)用阜豐集團是國內(nèi)最大的黃原膠生產(chǎn)企業(yè)一三二一、黃原膠發(fā)酵生產(chǎn)工藝簡介

1、黃原膠(xanthangum)黃原膠又稱黃膠、漢生膠，黃單胞多糖，是一種由黃單胞菌屬發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖。一般由甘藍黑腐病黃單胞菌以碳水化合物為主要原料，經(jīng)好氧發(fā)酵生物工程技術(shù)，切斷1,6-糖苷鍵，打開支鏈后，再按1,4-鍵合成直鏈組成的一種胞外雜多糖。是一種類白色或淺米黃色的粉末，無味、無毒、食用安全，易溶于水黃原膠基本結(jié)構(gòu)黃原膠是一種水溶性生物多糖，基本結(jié)構(gòu)是由重復(fù)的“五糖結(jié)構(gòu)單元”組成,相對分子質(zhì)量(Mr)為2xl06~2xl07，單體包括2個D-葡萄糖、2個D-甘露糖和1個D-葡糖醛酸，具有類似纖維素的一級結(jié)構(gòu)，包括由β-1,4鍵連接的D-葡萄糖基主鏈與D-甘露糖和D-葡糖醛酸交替連接的三糖側(cè)鏈組成，在C6位置帶有

乙酰基的D-甘露糖以α-1,3鍵與主鏈連接在側(cè)鏈末端的D-甘露

糖殘基上以縮醛形式帶有丙酮酸。黃原膠的二級結(jié)構(gòu)是其側(cè)鏈通過氫鍵反向纏繞主鏈形成雙螺旋或多螺旋結(jié)構(gòu),正是由于這些多螺旋體形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使黃原膠具有良好的控制水流動的性質(zhì)。黃原膠在氯化鈉水溶液中主要以多分子締合狀態(tài)存在,少量以單分子狀態(tài)存在,締合狀態(tài)的分子呈分段的雙股螺旋構(gòu)象黃原膠高級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)是二級結(jié)構(gòu)通過非共價鍵組成的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)黃原膠獨特的理化性質(zhì)由其二級結(jié)構(gòu)決定，黃原膠具有很強的耐酸、堿、鹽、熱等特性，具有突出的高粘性和水溶性、獨特的流變特性、優(yōu)良的溫度穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性、極好的兼容性等獨特的理化性質(zhì)黃原膠的性質(zhì)2.黃原膠生產(chǎn)1952年由美國農(nóng)業(yè)部伊利諾伊斯州皮奧里爾北部研究所分離得到的甘藍黑腐病黃單胞菌（Xanthomonascampestris），并使甘藍提取物轉(zhuǎn)化為水溶性胞外雜多糖而得到黃原膠甘藍黑腐病單胞菌(Xanthomonascampestris)菌體短桿狀，G-，單生，鞭毛，可移動，好氧，無芽孢，寬0.4μm-0.7μm，菌落一般呈黃色，光滑粘稠，產(chǎn)生非水溶性黃單胞菌色素。33生產(chǎn)工藝流程圖解黃原膠的生產(chǎn)受到培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)條件(溫度，pH值，溶氧等)、反應(yīng)器類型、操作方式(連續(xù)式或間歇式)等多方面因素的影響。培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基選用天然培養(yǎng)基，以葡萄糖、蔗糖或淀粉等為碳源，以蛋白質(zhì)、魚粉、豆粉或硝酸鹽為氮源，加KH2PO4、MgSO4、CaCO3等無機鹽和Fe2+、Mn2+、Zn2+等微量元素，以及生成促進劑谷氨酸、檸檬酸等。3.1發(fā)酵參數(shù)接種接種體積一般為反應(yīng)器中料液體積的5％-10％，接種的次數(shù)應(yīng)隨發(fā)酵液體積增大而增多菌種培養(yǎng)斜面活化→搖瓶種子→發(fā)酵種子培養(yǎng)：將保藏4℃的斜面種子在斜面上活化傳代2次，然后將菌苔接入到含50mL種子液的250mL搖瓶中，28℃、180r/min搖床培養(yǎng)24h搖瓶發(fā)酵：把5％(v/v)的種子液接入裝有100mL培養(yǎng)基的500mL的三角瓶中，溫度控制在28℃、轉(zhuǎn)速為180r/min，發(fā)酵周期為72h控制條件菌株可在25℃-30℃下生長，最適的發(fā)酵溫度為28℃，如需提高黃原膠產(chǎn)量，應(yīng)選擇溫度在31℃-33℃，而要增加丙酮酸含量就應(yīng)選擇溫度范圍在27℃-31℃。pH范圍在中性時最適于黃原膠的生產(chǎn)，隨著產(chǎn)品的產(chǎn)出，酸性基團增多，pH值降至5左右。研究表明控制反應(yīng)中的pH值對菌體生長有利，但對黃原膠的生產(chǎn)沒有顯著影響反應(yīng)器的類型及通氧速率、攪拌速率等都有相應(yīng)的經(jīng)驗數(shù)據(jù)，須根據(jù)具體條件而定。可參考如下數(shù)據(jù)：攪拌速率在200-300r/min，空氣流速為1L/L·min。操作方式多采用間歇式，但也有采取連續(xù)式操作方式3.2分離提純預(yù)處理(調(diào)pH值、加熱、稀釋等)固液分離(過濾、超濾、離心分離等)初步純化(超濾、沉淀、離心分離等)高度純化(溶解、超濾、沉淀、離心分離等)制成成品(干燥、粉碎等)預(yù)處理（滅菌、分離）預(yù)處理時可先用水稀釋，再加硅藻土過濾除去菌體；或調(diào)pH值6.3-6.9、加熱至80℃-130℃、時間10min-20min殺死菌體，再用中性蛋白酶分解菌體，除去菌體后可以降低黃原膠產(chǎn)品的總氮含量。(GB13886-2007:總氮≤1.5%)初步純化（沉淀）通常將發(fā)酵液濃縮至黃原膠濃度為6％左右，再用乙醇沉淀法提取，此法將比直接用乙醇沉淀提取黃原膠節(jié)約3～4倍乙醇。當然，發(fā)酵液經(jīng)硅藻土過濾后也可直接用乙醇沉淀法提取，或用鹽酸沉淀法提取工業(yè)級產(chǎn)品高度純化（產(chǎn)品分離）精制可采用溶解、超濾、沉淀和分離等方法；黃原膠精制尚沒有找到一種經(jīng)濟實用的方法制成成品（脫水干燥）黃原膠粘度大，干燥操作困難，常用的方法有真空干燥法、噴霧干燥法、盤式連續(xù)干燥法、滾筒干燥法、沸騰干燥法等。真空干燥法簡便易行，可用于生產(chǎn)各種等級的黃原級產(chǎn)品；噴霧干燥法不預(yù)處理發(fā)酵液、不除菌體，直接進行噴霧干燥，所得產(chǎn)品雜質(zhì)含量多、顏色深，粘度較小，產(chǎn)品通常為工業(yè)級；滾筒干燥法、沸騰干燥法等用于生產(chǎn)食品級黃原膠二、發(fā)酵生產(chǎn)方法改良（1）產(chǎn)膠量取發(fā)酵液適當稀釋后，12000r/min離心10min除去菌體及剩余淀粉，上清液用2倍體積乙醇沉淀黃原膠多糖，50℃真空干燥后稱重，并換算成單位重量發(fā)酵液中的含膠量。（2）發(fā)酵液黏度黃原膠發(fā)酵結(jié)束后,用Brookfield黏度計03號轉(zhuǎn)子60r/min下測定發(fā)酵液黏度值。布氏粘度計粘度測定原理是通過浸入被測液中的轉(zhuǎn)子的持續(xù)旋轉(zhuǎn)形成的扭矩來測量粘度值，扭矩與浸入樣品中的轉(zhuǎn)子被粘性拖拉形成的阻力成比例，因而與粘度也成比例。1、發(fā)酵效果評價指標（3）丙酮酸丙酮酸含量測定釆用2,4-二硝基苯肼比色法

在375nm處測吸光度，與已知丙酮酸標準曲線進行比較，即可求得樣品中丙酮酸含量(GB13886-2007)棕紅色菌種在發(fā)酵中起著重要作用，它是決定發(fā)酵產(chǎn)品是否具有產(chǎn)業(yè)化價值和商業(yè)化價值的關(guān)鍵因素。而自然界分離的菌種往往生產(chǎn)能力很低，不符合發(fā)酵工業(yè)要求，因此需要通過育種和條件培養(yǎng)打破微生物的正常代謝，使微生物按照人們要求的代謝方向積累代謝產(chǎn)物。

常規(guī)的菌種選育包括自然誘變、誘變育種、雜交育種、原生質(zhì)體融合育種等技術(shù)。2、菌種改良紫外線誘變育種技術(shù)路線：活化菌種→紫外線誘變→初篩→復(fù)篩→亞硝基胍誘變→初篩→復(fù)篩→目的菌株出發(fā)菌株：實驗室保存的野油菜黃單胞菌紫外誘變條件：

15W的紫外燈管，處于對數(shù)生長期的細胞

紫外線誘變育種原理：紫外線照射能使DNA鏈中兩個相鄰的嘧啶核苷酸形成二聚體造成局部DNA分子無法配對,而影響DNA的正常復(fù)制,造成基因突變。紫外誘變對微生物致死率的影響紫外誘變菌株的初篩紫外誘變菌株的穩(wěn)定性實驗UV-32的亞硝基胍誘變亞硝基胍(NTG):黃色結(jié)晶狀物質(zhì)，性質(zhì)不穩(wěn)定，見光易分解，不溶于水,因此用作誘變劑時需要加入助溶劑溶解誘變機理：亞硝基胍屬烷化劑，而烷化劑是突變中一類相當有效的化學(xué)誘變劑，這類誘變劑具有1個或多個活性烷基，它們易取代DNA分子中活潑的氫原子，使DNA分子上的堿基及磷酸部分被烷化，DNA復(fù)制時導(dǎo)致堿基配對錯誤而引起突變?nèi)芤旱乃釅A影響NTG的誘變效果，當pH6.0時，NTG的烷基化作用最強，因此需配置磷酸緩沖液來調(diào)節(jié)pH值。出發(fā)菌株：UV-32亞硝基胍對微生物致死率的影響亞硝基胍誘變菌株的初篩亞硝基胍誘變菌株穩(wěn)定性實驗通過上述紫外線誘變和化學(xué)誘變過程，得到菌株UN-26，在相同條件下，其黃原膠產(chǎn)量比原菌株高39.9%。3.1發(fā)酵后期補糖黃原膠的發(fā)酵屬于菌體生長與產(chǎn)物生成半偶聯(lián)型。在前期主要是菌體生長期，后期主要為產(chǎn)膠期。較低的C/N利于菌體的生長，而高的C/N較利于黃原膠的合成。前期菌體基本上達到最大值，黃原膠的合成主要在中后期，所以考慮補糖的時間應(yīng)選在中前期。3、發(fā)酵條件改良3.2氧氣

甘藍黑腐病黃單胞桿菌是好氧菌，溶氧量在黃原膠發(fā)酵中有著非常重要的作用。

溶氧濃度會影響到黃單胞桿菌的生長速率、黃原膠的生成率以及質(zhì)量。

隨著發(fā)酵過程中黃原膠含量的增加，發(fā)酵液濃度增大，氧含量顯著降低，影響黃原膠的持續(xù)合成針對氧含量問題，可采取以下措施：3.2.1轉(zhuǎn)基因技術(shù)

可在表達載體中插入細菌血紅蛋白基因,構(gòu)建了新的基因工程菌,提高菌株結(jié)合氧的能力,進一步提高黃原膠的產(chǎn)量。

轉(zhuǎn)入的細菌血紅蛋白能夠結(jié)合環(huán)境中的氧氣，在細胞內(nèi)創(chuàng)造更高水平的氧濃度，這樣可以促進細胞的生長，顯著地增加細胞對氧的吸收，并且增加產(chǎn)量。3.2.2氧載體（攜氧劑）

▲通過在發(fā)酵液中引入一種新的液相(與發(fā)酵液互不相溶)，以減少氣液傳氧阻力，從而提高氧氣的傳質(zhì)速率，這種液相一般具有比水更高的溶氧能力。例如：加入大豆油使黃原膠產(chǎn)率有明顯提高，與未加大豆油的對照組相比，黃原膠產(chǎn)率由1.64%增加到2.41%（加入6%大豆油）。隨著大豆油加入量的增加，產(chǎn)率反而下降，這可能是因為雖然氧載體能提高溶氧能力，但由于培養(yǎng)基失水較多，影響產(chǎn)率另外，表觀粘度的不斷增加會影響氧傳質(zhì)系數(shù)由于黃原膠的粘連性極好，在發(fā)酵中后期，發(fā)酵液粘度非常高。物料的混合及氧的分散能力大大下降，導(dǎo)致供氧不足，發(fā)酵無法進行。要獲得優(yōu)質(zhì)的黃原膠產(chǎn)品，必須先除去發(fā)酵終產(chǎn)物中的菌體。通常要將發(fā)酵液稀釋幾倍，然后離心除去菌體，這樣必然導(dǎo)致沉淀分離黃原膠時的乙醇含量增加?！梢圆捎脽o菌體的發(fā)酵液——酶液發(fā)酵合成黃原膠。一級培養(yǎng)是為了獲得較大生物量的胞外酶而不生成黃原膠。由于黃原膠會影響胞外酶的分泌及菌體的分離，因而采用少量的碳源及較低的碳氮比。第二步由于是采用一級培養(yǎng)產(chǎn)生的胞外酶作用底物合成黃原膠，因此可采用無氮培養(yǎng)基進行發(fā)酵。3.3發(fā)酵方式改良2酶液發(fā)酵VS普通法可以看出，發(fā)酵前期普通法粘度增加較快，而后兩者幾乎同時到達最高點，粘度相差不大酶液發(fā)酵：一級培養(yǎng)25小時，5000r/min分離除菌后進行發(fā)酵3.4.1醇種類對醇沉淀黃原膠的影響

傳統(tǒng)使用單一有機溶劑作為沉淀劑，嘗試采用不同比例的乙醇和異丙醇的混合溶劑來提取。3.4提取方法改良提膠率隨著醇用量的增加而提高，當醇量為發(fā)酵液體積3倍時提膠率最高,當醇量繼續(xù)增加，提膠率降低。3.4.2醇用量對醇沉淀提取黃原膠的影響3.4.3無機鹽對醇沉淀提取黃原膠的影響

將各添加劑按等摩爾電荷加入已經(jīng)預(yù)處理好的發(fā)酵液中,加入混醇(乙醇:異丙醇=3:l),離心30min(4000r/min)。添加5種無機鹽，結(jié)果如圖3.4.4發(fā)酵液稀釋倍數(shù)對醇沉淀提取黃原膠的影響

發(fā)酵72h后，發(fā)酵液十分粘稠，

如果直接進行預(yù)處理，硅藻土不

能將菌體、色素及其他雜質(zhì)完全

吸附，而且還可能吸附部分膠體，導(dǎo)致?lián)p失。所以在預(yù)處理時，就

要進行一定的稀釋，降低膠液的

粘度三、黃原膠的應(yīng)用

發(fā)展歷程：1988年8月衛(wèi)生部頒布了食品級黃原膠的衛(wèi)生標準，并將黃原膠列入食品添加劑名單，1992年制定了食品添加劑黃原膠的國家標準(GB13886-92)，2007年又出臺了新的國標(