《植物組織培養(yǎng)》課件-項目六 組培試驗方案設計

植物組織培養(yǎng)模塊三崗位提升

項目六組培試驗方案設計任務1植物離體快繁技術任務2組培試驗設計與分析任務3植物脫毒技術任務4組培工廠化生產(chǎn)【知識點】

掌握離體組織的再生途徑

組織培養(yǎng)的基本過程

植物微體快繁方法【技能點】會植物快繁技術

素質(zhì)要求：培養(yǎng)學生無菌意識、創(chuàng)新意識、團隊合作意識和生態(tài)環(huán)保意識；具有任務執(zhí)行力，規(guī)范操作、注意安全；科學嚴謹、實事求是的工作態(tài)度。任務1植物離體快繁技術一、植物離體快速繁殖的概念1、定義又稱微體,快繁利用組織培養(yǎng)技術進行的一種營養(yǎng)繁殖方法。在無菌條件下，把離體的植物器官、組織、放在人工控制的環(huán)境中，使其分化、繁殖，在短時間內(nèi)產(chǎn)生大量遺傳性一致的完整新植株的技術。2、意義和作用繁殖系數(shù)高短期獲遺傳穩(wěn)定一致群體獲無病毒苗，回復植物原有種性木本植物潛力大，可保持其雜合性推廣良種的重要手段工廠化生產(chǎn)無季節(jié)限制原始材料少繁殖速度快繁殖周期短3、應用珍惜植物品種和育種原始材料的擴大繁殖繁殖和保存無毒原種材料市場需求大、短期內(nèi)常規(guī)繁殖方法難滿足需求的植物經(jīng)濟效益高、難常規(guī)營養(yǎng)繁殖植物二、

離體快速繁殖程序（1）無菌培養(yǎng)體系的建立——啟動培養(yǎng)（2）增殖培養(yǎng)（3）壯苗生根培養(yǎng)（4）生根苗馴化和移栽（5）再生植株鑒定（1）無菌培養(yǎng)體系的建立從外植體選擇、清洗、滅菌、接種和莖芽誘導，到獲得莖芽穩(wěn)定生長和增殖，莖芽繁殖數(shù)量可控制的整個時期。目標：獲得無懼培養(yǎng)材料，誘導芽的發(fā)生。提供合適的試管環(huán)境使培養(yǎng)物（莖芽）的生長達到穩(wěn)定。無菌苗：在無菌條件下，用于試管內(nèi)繼代增殖的植物材料，稱為無菌苗或“無菌母株”或“繁殖母株”。外植體的滅菌在一定濃度的滅菌劑藥液中浸泡滅菌。藥劑滅菌的好壞關系著培養(yǎng)的成功率。根據(jù)材料、滅菌劑、經(jīng)驗等決定滅菌劑種類、濃度和處理時間。如：藥劑對各種菌類的殺滅效果。如：材料對殺菌劑的忍耐力。把植物材料、滅菌劑及濃度、滅菌時間四者統(tǒng)一考慮。采用多種藥劑配合使用。(2)增殖培養(yǎng)促進培養(yǎng)物分化培養(yǎng)，反復繼代增殖，達到需要數(shù)量。芽增殖途徑對增殖結(jié)果影響大。芽增殖速度快、慢的關鍵是培養(yǎng)基。（適宜外源激素種類和濃度配比極其重要）。（細胞分裂素與生長素影響繁殖系數(shù)好不定芽質(zhì)量）試管苗的繁殖速率及計算m為無菌母株苗數(shù)，X為每個培養(yǎng)周期增殖的倍數(shù)n為全年可增殖的周期數(shù)提高繁殖速度的方法：改進培養(yǎng)基：培養(yǎng)基種類、無機及有機成分、糖濃度、瓊脂、植物生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度。（生長素比例大，不定芽生長健壯，細胞分裂素高，繁殖系數(shù)高，但組培苗細弱，要將二者比例調(diào)整到適宜水平。）改善培養(yǎng)條件：溫度、光照（光強、光質(zhì)、光周期）、濕度、培養(yǎng)器皿、通氣狀況、培養(yǎng)基的pH值等都與材料的增殖密切相關。培養(yǎng)物保存：當暫時不需要育苗或珍貴資源需保存時，采用低溫（1-9℃）進行的中短期保存。芽增殖過程中，值得注意外源激素的累積。長期繼代增殖，外源激素的大量積累會造成各種畸形芽（莖）、玻璃化芽,影響不定芽質(zhì)量。繼代培養(yǎng)中需要酌情降低外源激素水平。（3）誘導不定根形成目標：使誘導培養(yǎng)出來的芽叢或不定芽生出不定根，形成完整的小苗（Plantlet）。功能：保證組織培養(yǎng)不定芽生根，提高適應環(huán)境能力。壯苗和生根：對不定芽進行壯苗培養(yǎng)，誘導生根。誘導生根的途徑試管（瓶）內(nèi)生根將組織培養(yǎng)莖芽的生根誘導同馴化培養(yǎng)結(jié)合在一起，直接將莖芽扦插到試管外有菌環(huán)境中，邊誘導生根邊馴化培養(yǎng)。試管（瓶）外生根在試管內(nèi)的無菌培養(yǎng)基上誘導生根，生根苗移栽到有菌環(huán)境下馴化培養(yǎng)。誘導根分化技術關鍵：1）調(diào)節(jié)外源激素種類和濃度。生長素/細胞分裂素。2）調(diào)節(jié)基本培養(yǎng)基營養(yǎng)組成。3）調(diào)大量元素中硝酸鹽和銨鹽的含量和比例。4）降低大量元素和微量元素的用量。5）調(diào)節(jié)滲透壓，降低糖濃度。(4)生根苗的煉苗馴化和移栽1）將小苗進行分級苗高和根數(shù)是評估移栽苗的重要指標。2）移栽前煉苗移植前要加強自然光照，使小苗逐漸適應外界環(huán)境。（在自然光的煉苗室中閉口自然光煉苗2-3周，開口煉苗1-3天。待小苗莖葉綠色加深，根系顏色由白色變?yōu)辄S褐色即可移栽出瓶。）生根苗的煉苗馴化和移栽：3）濕度鍛煉：使小苗逐步適應周圍環(huán)境的濕度。移栽前開瓶蓋進行濕度鍛煉。4）基質(zhì)疏松：珍珠巖、蛭石、西沙，營養(yǎng)土、腐殖土等。5）調(diào)控光、溫、濕等因子：生長季閉口煉苗期間調(diào)控光照強度、防雨水影響。部分遮光條件下移栽后管理，保持合適溫度。移苗注意：苗盤消毒：用0.1%的高錳酸鉀對苗盤進行浸泡消毒或噴淋消毒?；|(zhì)消毒：對已用過的需用0.1%高錳酸鉀噴淋后用自來水沖洗干凈。移栽技術：當根系打到一定長度（小于1cm）時移栽，帶瓊脂少，傷根輕，移栽時應將小苗基部的培養(yǎng)基沖洗干凈，切忌傷根和莖葉。如根長，可剪為2-3cm。移栽后根迅速固著于土壤基質(zhì)并吸收營養(yǎng)。苗盤移栽：將消毒后的蛭石或珍珠巖放在苗盤內(nèi)，厚度約4-6cm，用水淋透后，將洗凈的組培苗栽植在培養(yǎng)基質(zhì)內(nèi)，用水噴淋透后放置在拱棚內(nèi)保護培養(yǎng)2-3周。保持溫度和濕度。營養(yǎng)缽移栽：營養(yǎng)缽與營養(yǎng)土的準備：營養(yǎng)土最好采用腐殖土與細沙（或蛭石）按照3：1的比例混合過篩后備用。將組培苗從苗盤提出，栽植在營養(yǎng)缽中，澆一次透水后集中擺放在不易積水的地方，遮蔭、保溫、保濕。移栽后的管理：遮蔭和保濕。移栽初期防止陽光直射，逐漸增加日照時間和強度，提高自養(yǎng)能力，提高成活率。塑料膜保濕和噴霧保濕結(jié)合。（5）再生植株的鑒定意義培養(yǎng)時取材部位不同、器官發(fā)生途徑不同、培養(yǎng)基中各種物質(zhì)，特別是植物外源激素，對植物細胞構(gòu)成化學誘變環(huán)境。那些在遺傳上可塑性強的種和那些易于器官發(fā)生型的植物種的再生植株群體，可能會發(fā)生變異，故需要進行鑒定。方法1、形態(tài)鑒定：在田間對再生株的植物學性狀進行鑒定，發(fā)現(xiàn)變異株再作細胞學鑒定。2、細胞學鑒定：對再生株群體抽樣檢查根尖染色體數(shù)目以及減數(shù)分裂期的染色體行為。3、分子鑒定：抽取再生株中的個體幼嫩葉片，提取DNA，通過分子標記手段，檢查標記類型是否與原有品種（系）保持一致。離體快速繁殖程序例:千頭椿離體快速繁殖程序及技術要求初始外植體（帶芽莖段或莖尖）無菌培養(yǎng)物穩(wěn)定繁殖體愈傷組織叢生芽嫩梢有效嫩莖試管內(nèi)生根試管外生根溫室苗鑒定大田苗栽植流水沖洗1-4h，70%酒精30s，0.2%HgCl2消毒2-8min，無菌水沖洗3-5次，接種到初代培養(yǎng)基，培養(yǎng)10-20天接種到繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)30-35天接種到生根培養(yǎng)基，培養(yǎng)10-30天100mg/kgIBA浸30g定植移栽三、組培分化過程的類型不同植物不同外植體類型不同培養(yǎng)基器官再生途徑差異大1.無菌短枝和芽叢型選取頂芽或腋芽，促進其生長和誘導不定芽并使其生根形成植株的方式。莖尖會分化出葉片和側(cè)芽，側(cè)芽又再次分化為葉片和側(cè)芽莖尖會誘發(fā)腋芽萌發(fā)，形成芽叢芽叢被分割成單芽或小芽叢，繼代增殖產(chǎn)生大量試管苗頂端優(yōu)勢效應應抑制腋芽生長。將腋芽從植物上分離，給相應培養(yǎng)條件，形成大量不定芽。特點：繁殖率高、繁殖數(shù)量大、保持遺傳穩(wěn)定性。例如：草莓，半個月內(nèi)可增加10倍，1年內(nèi)1棵草莓可產(chǎn)生數(shù)以百萬計的試管苗。3）器官發(fā)生型從器官誘導愈傷組織，經(jīng)細胞再分化生成植株的方式。例：禾本科：甘蔗、水稻、小麥、大蘭莖草、印度草，百合、浙貝母、小蒼蘭、菊花、番茄、石刁柏、柑橘、棕桐等。特點：繁殖速度快，遺傳性不穩(wěn)定。4）胚狀體發(fā)生型由植物器官、組織和細胞培養(yǎng)直接發(fā)生類胚結(jié)構(gòu)，以胚狀體成苗的方式。胚狀體：植物組織培養(yǎng)過程中，起源于一個非合子細胞、經(jīng)過胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育過程形成具有雙極性的胚狀結(jié)構(gòu)，又稱體細胞胚直接體胚發(fā)生途徑：從外植體某些部位直接誘導分化出體細胞胚。（如百合與花序和百合鱗片）間接體胚發(fā)生途徑：外植體先脫分化形成愈傷組織，再從愈傷組織的某些細胞分化出體細胞胚。（如蘿卜、芹菜、苜蓿、一品紅、滿天星、康乃馨）。特點：遺傳性一致，數(shù)量大。如胡蘿卜1L培養(yǎng)基有10萬個以上的胚狀體。5）原球莖發(fā)生型是蘭屬特有的器官發(fā)生方式，促進蘭花栽培變革，建立蘭花工業(yè)。將蘭花莖尖培養(yǎng)于MS培養(yǎng)基，附加適量的椰子汁、NAA和6-BA，經(jīng)26℃暗培養(yǎng)，分化出乳白色圓球莖，切成數(shù)塊繼代培養(yǎng)到相同的液體培養(yǎng)基上震蕩培養(yǎng)，形成大量圓球莖。將叢生的圓球莖轉(zhuǎn)接于固體培養(yǎng)基上，大量增殖，并抽葉生根，形成完整蘭花苗。不同器官發(fā)生方式對比發(fā)生方式優(yōu)點缺點腋芽型易成苗，對培養(yǎng)基要求低，遺傳穩(wěn)定取材受限器官發(fā)生型遺傳性不穩(wěn)定，成苗數(shù)量大對培養(yǎng)基要求高，器官發(fā)生條件苛刻，染色體容易發(fā)生數(shù)量和結(jié)構(gòu)變異，較難保持穩(wěn)定遺傳性。胚狀體發(fā)生型遺傳性較穩(wěn)定，成苗數(shù)量大對培養(yǎng)基要求高，器官發(fā)生條件苛刻1.植物離體快速繁殖概念2.器官發(fā)生方式3.離體快速繁殖程序4.無菌苗定義5.誘導生根的途徑6.再生植株的鑒定方法小結(jié)【知識點】

了解組培試驗方案設計方法【技能點】會簡單分析觀察結(jié)果

素質(zhì)要求：培養(yǎng)學生無菌意識、創(chuàng)新意識、團隊合作意識和生態(tài)環(huán)保意識；具有任務執(zhí)行力，規(guī)范操作、注意安全；科學嚴謹、實事求是的工作態(tài)度。任務2組培試驗設計與分析一、培養(yǎng)基的選擇選擇合適的培養(yǎng)基是組培快繁成功的基礎。選擇合適的培養(yǎng)基主要從以下兩方面考慮：一是基本培養(yǎng)基；二是各種激素的濃度及相對比例。預備試驗→正式試驗→最佳組合培養(yǎng)基配方參觀咨詢文獻檢索1.組培信息搜索

為了更好地進行組培試驗設計，通常在試驗設計前需要大量搜集和分析相關組培信息。一般重點搜集的組培信息有以下幾方面：1）組培對象的學名、品種名、商品名；

2）外植體的類型與取材時間、部位；

3）培養(yǎng)基配方；

4）培養(yǎng)條件；

5）培養(yǎng)效果；

6）移栽馴化條件與基質(zhì)配比等。組培信息搜索后，要對所搜集的材料進行鑒別、分類、組合、排列和編目、確保信息的準確性、系統(tǒng)性和信息搜集質(zhì)量，為下一步試驗設計提供重要依據(jù)。2.組培試驗設計常用試驗方法主要有單因子試驗、雙因子試驗、多因子試驗三類方法。實際順序是從多因子到單因子。1）單因子試驗是指在整個試驗中保證其他因子不變，只比較一個試驗因子不同水平的試驗。這是最基本、最簡單的試驗方法。2）雙因子試驗是指在整個試驗中其他因子不變，只比較兩個試驗因子不同水平的試驗。常用于選擇生長素和細胞分裂素的濃度配比。雙因子試驗多采用拉丁方設計。見表3。表3雙因子試驗設計單位：mg/LNAABA1.02.05.0合計平均0.10.52.0合計平均3）多因子試驗是指在同一試驗中同時研究兩種以上試驗因子的試驗。多因子試驗設計由該試驗所有試驗因子的水平組合構(gòu)成。此方法主要用于對培養(yǎng)基種類、激素種類及其濃度的篩選。多因子試驗方案分為完全方案和不完全方案，實際中多采用不完全實施的正交試驗設計。

所謂正交試驗是指利用正交表來安排與分析多因子試驗的一種設計方法。例如采用4因子3水平9次試驗的L9（34）正交試驗，可以一次選擇培養(yǎng)基、生長素、細胞分裂素、赤霉素等眾多因子及其水平（見表4），然后查證正交表組合因子及其水平（見表5）。表4L9（34）正交試驗設計單位：mg/L水平因子培養(yǎng)基生長素（IBA）細胞分裂素（BA）赤霉素（GA）1MS0.50.51.02B51.01.02.03WPM2.02.04.0

表5L9（34）正交試驗方案單位：mg/L編號培養(yǎng)基生長素（IBA）細胞分裂素（BA）赤霉素（GA）1MS0.50.51.02MS1.01.02.03MS2.02.04.04B50.51.04.05B51.02.01.06B52.00.52.07WPM0.52.02.08WPM1.00.54.09WPM2.01.01.04）逐步增加和逐步排除的試驗方法在尋找最佳激素配比時，經(jīng)常用到這種逐步添加與逐步減少的簡單方法。

二、試驗數(shù)據(jù)采集與分析1.試驗數(shù)據(jù)采集在組培過程中，一定要充分利用轉(zhuǎn)接、出瓶等時機，直接調(diào)查，采集數(shù)據(jù)。組培主要技術指標的含義及計算方法見表6-4，組培苗觀察與計算的主要內(nèi)容見表6-5。表6-4

組培主要技術指導指標名稱含義計算公式出愈率反映無菌材料愈傷組織誘導的效果愈傷組織=（形成愈傷組織的材料數(shù)/培養(yǎng)材料總數(shù)）×100%分化率反映無菌材料的分化能力與再分化的效果分化率=（分化的材料數(shù)/培養(yǎng)材料總數(shù)）×100%污染率大致反映雜菌侵染程度和接種質(zhì)量污染率=（污染的材料數(shù)/培養(yǎng)材料總數(shù)）×100%增殖率反映中間繁殖體的生長速度和增殖數(shù)量的變化Y=mXnY:年生產(chǎn)量；m:每瓶苗數(shù)；X:每周期增殖倍數(shù)；n:年增殖周期數(shù)生根率大致反映無根芽苗根原基發(fā)生的快慢和生根效果生根率=（生根總數(shù)/生根培養(yǎng)總苗數(shù)）×100%成活率反映組培苗的適應性與移栽消費，一定程度上說明組培與快繁成功的高低成活率=（40天時成活植株總數(shù)/移栽植株總數(shù)）×100%表6-5

組培苗觀察的內(nèi)容與方法觀察階段觀察的內(nèi)容要點觀察方法初代培養(yǎng)外植體變化（形態(tài)、結(jié)構(gòu)、顏色）愈傷組織、胚狀體或芽萌動時間與數(shù)量出愈率、分化率、胚狀體或原球莖的誘導率污染率、褐變率等異?，F(xiàn)象目視觀察、照相、計算繼代培養(yǎng)中間繁殖體的長勢（生長量、健壯程度等）長相（形態(tài)、結(jié)構(gòu)、質(zhì)地、大小、高度、顏色、位置等）增殖率和污染率、褐變率、玻璃化苗發(fā)生率、變異率等異?，F(xiàn)象目視、照相、顯微觀察生根培養(yǎng)根發(fā)生時間長勢（根生長量、根發(fā)達程度等）長相（根長、根數(shù)、根粗、根色、位置等）生根率和污染率、畸形根發(fā)生率等異?，F(xiàn)象目視、照相、顯微觀察、計算馴化移栽試管苗長勢（生長量、健壯程度等）長相（株高、根數(shù)、根長、根色、葉數(shù)等）馴化移栽成活率壯苗指數(shù)變異率等目視觀察、計算、試驗2.編制組培觀察表

觀察表在設計上要合理全面，因根據(jù)實際情況而定。下表6-6只是做參考。學生可以自己設計。表6-6

組織培養(yǎng)試驗觀察表（參考）項目名稱：

項目組：

觀察日期：基礎數(shù)據(jù)CK

接種瓶數(shù)

每瓶接種量

處理1

接種瓶數(shù)

每瓶接種量

處理2

接種瓶數(shù)

每瓶接種量

處理3

接種瓶數(shù)

每瓶接種量

試驗觀察項目與內(nèi)容試驗處理技術指標調(diào)查定性觀察處理意見污染率出愈率分化率增生率生根率成活率生長與分化情況異?，F(xiàn)象1（CK）

2

3

組長簽字：

指導教師簽字：

3.組培苗觀察注意事項（1）準備觀察用具。（2）認真觀察苗組培苗。要求尊重事實，調(diào)查全面、記錄完整。（3）最好不要手握封口膜處，以防二次污染。（4）培養(yǎng)瓶最好不要帶出培養(yǎng)室。（5）填寫觀察記錄表，要求概括、全面、言簡意賅，計算準確。（6）出愈率、分化率、生根率等技術指標的數(shù)據(jù)統(tǒng)計一般要求以30個培養(yǎng)物調(diào)查為依據(jù)；培養(yǎng)物的生長量等數(shù)據(jù)一般至少5個培養(yǎng)物的平均值；污染率、玻璃化發(fā)生率、褐化率等數(shù)據(jù)統(tǒng)計以一次接種的培養(yǎng)物為基數(shù)。1.組培試驗設計方法2.數(shù)據(jù)采集與分析小結(jié)【知識點】

掌握熱處理、微莖尖、以及莖尖培養(yǎng)

結(jié)合熱處理脫除病毒的原理及方法

脫病毒苗木的獲得

脫病毒植株的檢測等【技能點】會莖尖培養(yǎng)。素質(zhì)要求：培養(yǎng)學生無菌意識、創(chuàng)新意識、團隊合作意識和生態(tài)環(huán)保意識；具有任務執(zhí)行力，規(guī)范操作、注意安全；科學嚴謹、實事求是的工作態(tài)度。任務3植物脫毒技術一、病毒特性及危害1.病毒特性及其侵染癥狀病毒無細胞結(jié)構(gòu)，由蛋白質(zhì)外殼保衛(wèi)著核酸。核酸僅為DNA或RNA。寄生于活細胞，不能獨立代謝，缺乏核糖體，必須依賴寄主合成蛋白質(zhì)。其核酸能利用寄主細胞進行自我復制。具有侵染力，其核酸能從一種寄主細胞轉(zhuǎn)移到其他寄主細胞。2.病毒轉(zhuǎn)運方式短距離轉(zhuǎn)運：胞間連絲。速度慢，普通煙草花葉病毒運轉(zhuǎn)速度為6-13μm/小時。長距離轉(zhuǎn)運：植物韌皮部的疏導組織（篩管和管胞），木質(zhì)部的導管和管胞不參與。隨營養(yǎng)輸送進行轉(zhuǎn)移，速度快。一旦病毒進入韌皮部，轉(zhuǎn)運速度突然增快。水稻條紋葉枯病毒運轉(zhuǎn)速度為25cm/h。無性繁殖植物：受一種或多種病原菌侵染。如草莓可感染62種病毒和類菌質(zhì)體，造成產(chǎn)量降低，品質(zhì)退化。葡萄扇葉病毒使葡萄減產(chǎn)10-18%?；ɑ懿《疚：Γ河^賞價值下降，如花少而小，產(chǎn)生畸形、變色等。3.植物病毒病的危害柑橘衰退病：曾毀滅巴西的柑橘，圣包羅洲600萬株甜橙死亡（占總數(shù)的75%），至今仍威脅著世界上的柑橘產(chǎn)業(yè)。棗瘋?。簬缀鯕缑茉频慕鸾z小棗。馬鈴薯：病毒侵染（有10多種）后，塊莖小，產(chǎn)量下降，由8000-10000斤降到1000-2000斤。4.解決植物病毒病的對策離體培育無毒苗已成為農(nóng)作物、園林植物、經(jīng)濟作物的優(yōu)良品種繁育、生產(chǎn)中的一個重要環(huán)節(jié)。不少國家已將其納入常規(guī)良種繁育的一個重要程序，建立無病毒（virus-freeliant）產(chǎn)生基地，為提供無病毒良種種苗。5.無病毒良種種苗的特點產(chǎn)量提高：如草莓可增產(chǎn)20-30%，馬鈴薯可增產(chǎn)40%以上，地瓜脫毒提產(chǎn)30-50%。品質(zhì)提高：脫毒后的植物所結(jié)果實品質(zhì)提高，如地瓜脫毒可提高出干率0.1-1.5%?？共⌒栽鰪姡簩Σ∠x的抗性增強，如地瓜脫毒后可增強抗莖線蟲??；脫毒時還會脫除細菌、真菌、線蟲等。二、脫毒方法1.熱處理原理：植物組織處于高于正常溫度環(huán)境時，組織內(nèi)部的病毒受熱后鈍化，其復制功能受到影響，以致病毒含量不斷降低；甚至死亡，從而達到脫毒的目的。熱處理對葡萄扇葉病毒、蘋果花葉病毒、康乃馨病毒等一類的圓形或線性的病毒起作用。如：葡萄扇葉病毒在38℃處理30分鐘可脫除。1889年，瓜哇人用熱水浸甘蔗種，得到病毒減輕的甘蔗。最早熱處理脫毒是英國的卡尼斯（1950）：馬鈴薯塊莖37℃處理20天，卷葉病毒消失。熱處理脫毒方法溫水浸漬處理：適用于休眠器官，在50℃左右的溫水中浸漬10min至數(shù)小時，簡單易行，但材料易受傷。熱空氣處理：將材料放在高溫生長室（在35-40℃），使其頂端分生組織比次生分生組織生長迅速，切取其莖尖分生組織進行離體培養(yǎng)。處理時間因植物而異，短則幾十分鐘，長可達數(shù)月。2.微莖尖脫毒越靠近莖頂端區(qū)域的病毒的感染濃度越低，生長點（約0.1-1.0mm區(qū)域）則幾乎不含或含病毒很少。分生區(qū)域內(nèi)無維管束，病毒只能通過胞間連絲傳遞，趕不上細胞不斷分裂和活躍的生長速度。微莖尖培養(yǎng)脫毒案例3.愈傷組織脫毒原理從器官或組織誘導愈傷組織，分化不定芽，生根培養(yǎng)成植株，可獲脫毒苗。如馬鈴薯、大蒜、草莓、水仙、香蕉等。原理及依據(jù)：病毒在植物體內(nèi)的不同器官或組織分布不均勻，甚至在同一感病的組織內(nèi)，存在不感病毒的細胞群落。這些無病毒細胞在愈傷組織的增殖中獲得無病毒組織。病毒顆粒在愈傷組織的增殖過程中逐漸降低。繼代培養(yǎng)的愈傷組織產(chǎn)生抗性變異。技術關鍵：誘導可再生出植株的愈傷組織。愈傷組織脫毒案例4.珠心組織培養(yǎng)脫毒原理病毒是通過維管組織傳播的，而珠心組織與維管組織沒有直接聯(lián)系，故珠心組織培養(yǎng)可獲得無病毒植株。柑橘、葡萄，通過珠心組織培養(yǎng)獲得了無病毒植株。柑橘、葡萄，通過珠心組織培養(yǎng)獲得了無病毒植株。5.微體嫁接離體培養(yǎng)脫毒特點：微體嫁接法是20世紀70年代發(fā)展的一種培養(yǎng)無病毒苗的方法，也稱試管嫁接?？砂褬O?。ㄐ∮?.2mm）莖尖，作為接穗嫁接到生長在試管中的實生砧木上（種子獲無菌苗實生苗不帶毒）。接穗在砧木的飼喂下很容易成活。接穗是很小的莖尖，帶毒概率小，可獲無毒苗。已在柑橘、蘋果上獲得成功。技術關鍵：剝離技術高：嫁接的成活率與接穗大小呈正相關，而脫毒率與及接穗大小呈負相關。莖尖大?。呵o尖越小脫毒效果越好，小于0.2mm的莖尖嫁接可脫除多數(shù)病毒。培養(yǎng)基篩選：考慮砧木和接穗對營養(yǎng)的要求。接穗的取材季節(jié)：不同的取材季節(jié)嫁接成功率不同。4-6月份取材嫁接成活率較高。三、脫毒檢測1.視覺觀察法看植株莖、葉是否有該病毒所有的可見癥狀，受侵染的植株表現(xiàn)為局部或系統(tǒng)花葉、皺縮、卷葉、黃化等。生長勢減弱，有矮化或畸形等癥狀。2.生物鑒定法（指示植物法）原理：有些植物對病毒極為敏感，一旦感染病毒就會在其葉片乃至全株上表現(xiàn)特有的病斑，這種植物為病毒敏感植物或指示植物。例：馬鈴薯病毒的敏感植物有：千日紅、黃花煙、心葉煙、毛葉曼陀羅等鑒定法a.摩擦接種法b.嫁接鑒定法取待檢測植物的汁液，摩擦接種或?qū)⒋龣z植物接穗嫁接到對應的敏感植物上，視其有無病斑，判斷是否脫毒病毒。3.電子顯微鏡鑒定法原理：用電鏡直接觀察經(jīng)脫毒培養(yǎng)的葉片，檢查是否有病毒粒子的存在，測量病毒顆粒的大小、形狀和結(jié)構(gòu)。電鏡鑒定法是準確、科學、先進的檢測方法?？芍《绢w粒的大小、形狀和結(jié)構(gòu)?？贵w概念：當動物被病毒感染或人工注射異體蛋白質(zhì)時，其體內(nèi)會產(chǎn)生一種特異性免疫球蛋白，其被稱為抗體?？乖拍睿阂鹦纬煽贵w的物質(zhì)（病毒或異體蛋白）。4.抗血清鑒定法血清反應：抗體在特色細胞內(nèi)形成，進入血液存在于血清和體液內(nèi)?？乖涂贵w相結(jié)合的反應稱為血清反應。含特異性“抗體”的血清稱為“抗血清”。特異性：抗原和抗體結(jié)合，有很強的特異性。即一種病毒產(chǎn)生的抗體只能結(jié)合該種病毒，用已知病毒的抗血清可鑒定未知病毒的種類。測定速度快，幾小時甚至幾分鐘就可完成。病毒抗血清在診斷上的價值病毒抗血清具有高度的?；裕阂环N病毒產(chǎn)生的“抗體”，只能結(jié)合該種病毒（抗原）。對于受感染而沒有癥狀的帶毒植物，也能診斷，有很高的實用價值。玻璃片凝聚法：在清潔玻璃片的一端，用毛細管滴加5滴稀“抗血清”，另一端滴加等量對照血清。然后各加滴被檢植物壓榨出的原汁液兩滴。用玻璃棒攪勻，在常溫下靜置20-50min，然后在40-60倍顯微鏡下觀察。帶病毒的葉綠體發(fā)生典型的凝集現(xiàn)象。將抗原固定在酶標板上，加入待測血清，然后再加入酶標記的抗體，使之與待測血清中已與抗原結(jié)合的特異性抗體結(jié)合用酶標儀作出判斷。該方法敏感，能檢測出【10】

（-5）數(shù)量級病毒濃度。5.分光光度計法用于定量病毒步驟：把病毒的純品干燥稱重配成已知濃度上午病毒算浮液在260nm下測其光密度并折算成消光系數(shù)查消光系數(shù)表四、無病毒種苗的保存和利用1、無病毒原種的保存無病毒苗原種要在隔離區(qū)或采用隔蟲網(wǎng)室種植保存。隔離區(qū)可為海島、山地、未種植過該種植物的新區(qū)；隔蟲網(wǎng)室用300網(wǎng)紗，防蚜蟲進入。種植苗圃的土壤應消毒，保證原種是在與病毒嚴密隔離的條件栽培。及時和定時對原種進行病毒的檢測和測定。離體保存。種苗經(jīng)鑒定后，選擇無病原種株系，回接于試管內(nèi)，長期保存，是理想的保存方法。2、無病毒原種的繁殖無病毒株數(shù)量有限，需擴繁滿足生產(chǎn)需要。在無毒源和其他病蟲害的大田中進行，場地要消毒防治蚜蟲等傳播媒介。對脫毒株系進行植物學性狀鑒定，保留性狀優(yōu)良無毒株系。嚴格原種繁育制度和栽培管理制度。1.脫毒苗培育的意義2.植物脫毒處理方法3.微莖尖培養(yǎng)脫毒操作程序4.無病毒種苗的保存和利用小結(jié)【知識點】掌握組培苗工廠化生產(chǎn)工藝流程

了解檢測組培苗質(zhì)量方法【技能點】能制定科學合理的生產(chǎn)計劃

素質(zhì)要求：具備獨立獲取知識、終身學習和適應職業(yè)變化的能力；培養(yǎng)從事組培苗木生產(chǎn)管理人員的素質(zhì)與能力。任務15組培工廠化生產(chǎn)一、工廠化生產(chǎn)流程與計劃制定1.植物組培苗工廠化生產(chǎn)工藝流程根據(jù)植物組織培養(yǎng)的技術路線，擬定工藝流程。如：莖尖→表面消毒→接種誘導培養(yǎng)基→莖尖生長→病毒檢測鑒定→培養(yǎng)無根小植株→培養(yǎng)生根→完整小植株→煉苗20-25天→移栽成活。常規(guī)情況下詳細的生產(chǎn)流程圖如下：2.組培苗生產(chǎn)計劃的制定1)試管苗增殖率的估算根據(jù)幾何增加的原理，按下面的公式計算出年增殖率的理論值：試管苗年繁殖總數(shù)：y；無菌母株苗數(shù)：m；每周期增殖的倍數(shù)：X；年增殖周期數(shù)：n；理論上計算組培苗生產(chǎn)數(shù)量的公式為：y＝mXn案例：一個培養(yǎng)瓶中有無菌母株苗數(shù)5株，每年增殖8次，每次增殖4倍，則全年理論生產(chǎn)為多少？y＝mXn=5×48=327180（株）2）生產(chǎn)計劃的制定制定的要點：1）對各種植物的增殖率應做出切合實際的估算；2）要有植物組織培養(yǎng)信不過各的技術儲備；3）熟悉各種組培苗的定植時間和生長環(huán)節(jié)；4）要掌握組培苗可能產(chǎn)生的后期效應。全年生產(chǎn)量=全年出瓶苗數(shù)×煉苗成活率案例：某商業(yè)生產(chǎn)玫瑰組培苗，平均30天為一個增殖周期，一名工人每天轉(zhuǎn)苗1000株，全年280個工作日，損耗率為10%，30%苗量增殖培養(yǎng)，70%苗量生根培養(yǎng)。全年生產(chǎn)量=1000×280=280000（株）全年出苗量=280000×70%×（1-10%）=176400（株）3)組培苗生產(chǎn)計劃實施步驟主要為：

準備繁殖材料，建立無性繁殖系。繁殖材料必須是來源清楚、無檢疫性病害、無肉眼可見病害癥狀、具有典型品種特性的優(yōu)良單株或群體。

試管苗繁殖材料的快速繁殖。存架增殖總瓶數(shù)的控制就成為影響試管苗生產(chǎn)效益的關鍵因素。有效控制試管苗的增殖總瓶數(shù)，便于在一個生產(chǎn)周期內(nèi)全部轉(zhuǎn)接、更新1次培養(yǎng)基，使增殖材料處于不同生長階段的最佳狀態(tài)，調(diào)高其質(zhì)量。4)生產(chǎn)計劃的制定與實施生產(chǎn)計劃是根據(jù)市場需求和經(jīng)營策略，對未來一定時期的生產(chǎn)目標和活動所做的統(tǒng)一安排。生產(chǎn)計劃的制定是進行組培苗規(guī)范化生產(chǎn)的關鍵，生產(chǎn)量不足或過剩都會直接影響經(jīng)濟效益。在實際生產(chǎn)中，首先應對植物材料的增殖率做出一個切合實際的估算，再根據(jù)生產(chǎn)能力和市場需求制定相應的生產(chǎn)計劃，并有效組織生產(chǎn)。5)案例分析生產(chǎn)計劃的制定主要是要考慮到供貨時間，依據(jù)供貨時間來推算生根時間和繁殖增量時間。以康乃馨組培為例，一般康乃馨的移栽時間在清明節(jié)前后，那么煉苗正好在上海最冷的時候，在沒有加溫設施的條件下需要3個月左右的時間，這樣組培生根就安排在12月份進行。五四組培室計劃在清明節(jié)前后供應4200萬株康乃馨組培苗，從1月份開始庫存12個品種苗各為50株。平均30d為一個增殖周期，康乃馨的繁殖率為2.5，一部超凈工作臺每人每天轉(zhuǎn)苗量1200株，各種損耗10%，移栽成活率90%，每人每天移栽2000棵苗，出苗包裝每人每天4000棵苗。根據(jù)上述已知條件，計算出每月平均生產(chǎn)量和全年生產(chǎn)量和用工情況，并制定一年的生產(chǎn)計劃。求：1、每月平均生產(chǎn)量2、全年生產(chǎn)量3、用工情況4、

康乃馨組培生產(chǎn)計劃（見附件）二、植物組培苗的質(zhì)量鑒定根據(jù)種苗的用途不同，其質(zhì)量標準也有所不同。1.生產(chǎn)性組培瓶苗的質(zhì)量標準用于生產(chǎn)的組培瓶苗質(zhì)量，主要依據(jù)苗的根系狀況、整體感、出瓶苗高、葉片數(shù)及葉片顏色等四個方面進行判定。(1)根系狀況根系狀況是指種苗在瓶內(nèi)的生根情況，包括根的有無、多少、長勢和色澤。一般通過目測評定，合格的組培瓶苗必須有根，根量適中，并且長勢好、色白健壯。(2)整體感整體感是指組培苗在容器內(nèi)的長勢和整體感觀，包括長勢是否旺盛、種苗是否粗壯挺直等。此項指標是一個綜合的感官評判項目，靠目測評定，應由熟悉組培生產(chǎn)及種類組培瓶苗形態(tài)特征的人員進行檢測。(3)出瓶苗高出瓶苗高是指出瓶時組培苗的高度。組培苗過矮過小，移栽難以成活。多數(shù)種類組培苗的高度超過指標后，其質(zhì)量反而下降，繼續(xù)生長變成徒長、瘦弱的超苗期，降低移栽成活率。(4)葉片數(shù)及葉片顏色葉片數(shù)是指在組培苗進行光合作用的有效葉片數(shù)。通常通過目測評定，適當數(shù)量和形態(tài)正常的葉片表明植株生長健壯。葉片顏色直接表明組培苗的健壯狀況，葉色深綠有光澤，表明生長勢強壯，光合能力強，適宜移栽；葉片發(fā)黃、發(fā)脆、透明、及局部干枯都是組培苗病態(tài)的表現(xiàn)，移栽難以成活。2.原種組培苗的質(zhì)量標準（1）品種純度。品種純度是指原種組培苗是否具備品種典型性。品種純度是非常重要的一個質(zhì)量指標。品種純度鑒定可根據(jù)外觀性狀判斷，有條件的可利用分子檢測技術進行鑒定。（2）健康狀況。健康狀況是指原種組培苗是否攜帶病菌，包括真菌、細菌、病毒等。3.出圃苗的質(zhì)量標準主要從以下幾個方面進行考慮：（1）商品特性。苗高、冠幅、地徑、葉片數(shù)、芽數(shù)、葉片顏色、根的數(shù)量、長度等。（2）健壯情況?？共⌒?、抗蟲性、抗逆性。（3）遺傳穩(wěn)定性。品種典型性狀、是否整齊一致。三、組培苗的運輸1.育苗方法及苗齡一般采用水培或以多孔材料（如沙礫、爐渣）作基質(zhì)育苗的苗木，起苗后全部裸露，須采取保濕措施處理，否則經(jīng)長途運輸后成活率會受到影響。2.組培苗的包裝穴盤育苗運輸時帶基質(zhì)，應先振動秧苗，使穴盤分離，然后將苗取出，帶基質(zhì)擺放于箱內(nèi)，以提高定植后的成活率及緩苗速度。水培苗或基質(zhì)培苗，取苗后基本不帶基質(zhì)，可由數(shù)十株至百株扎成一捆，用水苔或其他保濕包裝材料將根部裹好再裝箱。3.對運輸工具及運輸適溫的要求根據(jù)運輸距離的遠近選擇運輸工具。對于珍貴的種苗或有緊急時間要求者也可選擇空運。注意事項：在種苗運輸過程中應注意調(diào)