GB/T 42821-2023 貝類包納米蟲病診斷方法（正式版）

ICS65.020.30貝類包納米蟲病診斷方法Diagnosticmethodsforbonamiosisofm國家市場監(jiān)督管理總局國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會I Ⅲ 1 1 1 1 1 2 3 3 310組織病理檢查 311PCR檢測 4 5 6附錄A(規(guī)范性)組織印片、組織病理檢查及DNA提取相關(guān)溶液配制 7附錄B(資料性)貝類包納米蟲病 ⅢGB/T42821—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出。本文件由全國水產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(SAC/TC156)歸口。柏建山。1貝類包納米蟲病診斷方法本文件給出了貝類包納米蟲病(bonamiosis)診斷的縮略語、試劑和材料、器材和設(shè)備，描述了臨床本文件適用于牡蠣包納米蟲(Bonamiaostreae)和殺蠣包納米蟲(Bonamiaexitiosa)引起的貝類包下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語與定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。bp:堿基對(basepair)Ct:擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(cyclethreshold)DNA:脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)dNTPs:脫氧核糖核苷三磷酸混合物(deoxy-ribonucleosidetriphosphatemixture)EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)FAM:羧基熒光素(carboxyfluorescein)TE:Tris鹽酸和EDTA緩沖溶液(EDTATris·HCl)Tris:三羥甲基氨基甲烷(trishydroxymethylaminomethane)2GB/T42821—20235.1水：符合GB/T6682中規(guī)定的一級水。5.5生理鹽水(0.9%):常溫保存。5.610×PCR緩沖液(無Mg2+):—20℃保存。5.7MgCl?溶液(25mmol/L):-20℃保存。5.9TaqDNA聚合酶(5U/μL):-20℃保存。5.10姬姆薩染液、戴維森氏固5.11蛋白酶K(20mg/mL):按A.3配制。5.1210%SDS:按A.4配制。5.13乙酸銨(10mol/L):按A.5配制。5.14酚/三氯甲烷/異戊醇混合液：配制比例25:24:1。5.15乙醇溶液(75%):按A.6配制。5.171×電泳緩沖液：按A.9配制。5.21引物BonF:5'-CATTTAATTGGTCGGGCCGC-3'(10μmol/L),-20℃保存。5.22引物BonR:5'-CTGATCGTCTTCGATCCCCC-3'(10μmol/L),-20℃保存。5.23引物BonqF:5'-GAGCTGGAGTAATGATTGATAGAAAC-3'(10μmol/L),-20℃保存。5.24引物BonqR:5'-CATAAGTTAGTCTCACCGGAATTAAAG-3'(10μmol/L),-20℃保存。5.25探針BonqP:5'-FAM-TCTGGCCCGGCGATACTAGCACCC-Eclipse-3'(10μmol/L),-20℃保存。5.27核酸染料：4℃保存。5.286×上樣緩沖液：—20℃保存。5.29DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)溶液：-20℃保存。5.31載玻片。6器材和設(shè)備6.1組織切片機(jī)。6.2顯微鏡。6.34℃冰箱。6.4—20℃冰箱。6.5—80℃冰箱。6.6勻漿研磨器。6.7冷凍高速離心機(jī)。6.8二級生物安全柜。3GB/T42821—20236.9普通PCR儀。6.10熒光PCR儀。6.11水平電泳儀。6.12凝膠成像儀。6.13水浴鍋。6.14微量移液器。6.15電子天平。8采樣優(yōu)先采集2齡及以上瀕死的貝類。臨床無癥狀貝類樣品每個批次采集150個以上，臨床有癥狀貝類樣品每個批次采集30個以上。進(jìn)口貝類樣品的采樣數(shù)量應(yīng)符合GB/T18088的規(guī)定。24h內(nèi)冷鏈送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，立即檢測或保存于一80℃冰箱待檢。9組織印片檢查后置于400倍～1000倍顯微鏡下觀察。用戴維森氏固定液固定樣品，固定液與組織塊的體積比為(15:1)～(20:1),固定24h～48h。4GB/T42821—2023按A.13的要求采用組織切片機(jī)制備石蠟切片，封片后置于400倍～1000倍顯微鏡下觀察。切片組織中發(fā)現(xiàn)蟲體即判為陽性。檢測實(shí)驗(yàn)室的分區(qū)要求、質(zhì)量控制和質(zhì)量保證應(yīng)符合GB/T19495.2的規(guī)定。11.2操作步驟11.2.1DNA提取11.2.1.1利用電子天平稱取30mg～50mg組織樣品，置于0℃~4℃的生理鹽水(4℃冰箱預(yù)冷)中反復(fù)沖洗，濾紙吸干表面水分后置于勻漿研磨器中并加入0℃~4℃(4℃冰箱預(yù)冷)的生理鹽水，充分11.2.1.2加入2.5μL20mg/mL蛋白酶K至終濃度100μg/mL,再至終濃度為1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),上下顛倒混勻后置于50℃水浴鍋中水浴3h,不時旋動。向勻漿液中按1:1體積比加入酚/三氯甲烷/異戊醇混合液(25:24:1),輕輕震蕩混勻加入兩倍體積預(yù)冷無水乙醇(—20℃冰箱預(yù)冷)混勻，置于一20℃冰箱放置2h。11.2.1.6采用冷凍高速離心機(jī)12000r/min離心10min,沉淀DNA,傾去上清液。11.2.1.7向沉淀中加入75%乙醇溶液500μL,輕輕混勻后采用冷凍高速離心機(jī)12000r/min離心11.2.1.9可采用同等抽提效果的其他方法或商品化DNA提取試劑盒。在二級生物安全柜中用微量移液器向PCR管內(nèi)加入10×PCR緩沖液(無Mg2+)2.5μL、MgCl?溶1.0μL、dNTPs(各2.5mmol/L)2.0μL,加入模板DNA2.0μL,補(bǔ)充雙蒸水至25.0pL。利用普通PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，設(shè)置擴(kuò)增程序如下：94℃預(yù)變性5min;94℃變性1min,55℃退5GB/T42821—2023配制1%～2%的瓊脂糖凝膠并加入核酸染料，待膠凝固后置于含有1×電泳緩沖液的水平電泳儀陽性對照在300bp處有擴(kuò)增條帶，陰性對照300bp處無擴(kuò)增條帶，空白對照無任何條帶，檢測有效。若待檢樣品在300bp處無條帶，則判為PCR檢測核酸陰性。對PCR檢測為核酸陽性的樣品PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果同參考序列比對分析(見附錄C中C.1、C.2),若序列中同時存在HaeⅡ和BglI兩個酶切位點(diǎn)(見C.1),可判定樣品為Bonamiaostreae核酸陽性。若序列中只存在HaeⅡ酶切位點(diǎn)(見C.2),則判定樣品為Bonamiaexitiosa核酸陽性。12熒光PCR檢測12.1實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求檢測實(shí)驗(yàn)室的分區(qū)要求、質(zhì)量控制和質(zhì)量保證應(yīng)符合GB/T19495.2的規(guī)定。12.2.1DNA提取按11.2.1規(guī)定執(zhí)行。在二級生物安全柜中用微量移液器向PCR管內(nèi)加入10×PCR緩沖液(無Mg2+)2.5μL、MgCl?溶利用熒光PCR儀進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)，設(shè)置擴(kuò)增程序如下：95℃預(yù)變性4min;95℃變性陽性對照Ct值≤35,且出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線；陰性對照無Ct值或者Ct值>40且無特異性擴(kuò)增曲6GB/T42821—202312.3.2熒光PCR檢測結(jié)果判定若樣品Ct值≤35,則判定熒光PCR檢測核酸陽性。若樣品無擴(kuò)增曲線或者Ct值>40,則判定熒光PCR檢測核酸陰性。若35<Ct≤40,判定為疑似，此時可調(diào)整模板濃度后對樣品重新進(jìn)行熒光PCR檢測，如果樣品重復(fù)檢測時的Ct值≤40,則判定熒光PCR檢測核酸陽性；如果樣品重復(fù)檢測時無擴(kuò)增曲線或者Ct值>40,則判為熒光PCR檢測核酸陰性(熒光PCR擴(kuò)增序列及引物、探針的位置見C.3)。13.2確診判定組織印片檢查和組織病理檢查一種或兩種方法檢測為陽性，且PCR檢測或者熒光PCR檢測為陽組織印片檢查和組織病理檢查一種或兩種方法檢測為陽性，且PCR檢測或者熒光PCR檢測為陽7GB/T42821—2023(規(guī)范性)A.1姬姆薩染液A.1.2工作液：取貯存液采用蒸餾水10倍稀釋即可，臨用時配制。A.2戴維森氏固定液海水335mL95%乙醇330mL37%甲醛220mL冰乙酸115mLA.320mg/mL蛋白酶K蛋白酶K20mg溶解后分裝于1.5mL離心管中(0.25mL/管),—20℃下保存。加熱至68℃助溶，加入幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH至7.2,加水定容至100mL。SDS微細(xì)晶粒易于擴(kuò)散，稱量時要戴面罩，稱量完畢后要清除殘留在稱量工作臺區(qū)和電子天平上乙酸銨77g無水乙醇8GB/T42821—20230.5mol/LEDTA(pH8.0)加水定容至高壓蒸汽滅菌，4℃貯存。A.850×電泳緩沖液Tris冰乙酸0.5mol/LEDTA(pH8.0)加水定容至室溫貯存。A.91×電泳緩沖液50×電泳緩沖液加水定容至室溫貯存。2mL242g57.1mL20mLA.10蘇木精染液的配制方法蘇木精無水乙醇硫酸鋁鉀蒸餾水氧化汞冰乙酸200mL分別用無水乙醇溶解蘇木精，蒸餾水加熱溶解硫酸鋁鉀，然后兩液混合并煮沸，加入氧化汞，繼續(xù)加熱和攪拌至溶液為深紫色，立即用冰水冷卻，恢復(fù)至室溫后過濾備用。A.11伊紅染液的配制選用水溶性伊紅。配方為：伊紅1g、70%～75%酒精100mL、伊紅用少許蒸餾水調(diào)成耀糊狀，再加入酒精，邊加邊攪拌，直至徹底溶解，此時試劑有些渾濁，取0.1mL冰乙酸，加入試劑中，試劑逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榍辶?，呈鮮紅色。A.12返藍(lán)液的配制取5mL氫氧化氨，加入1000mL蒸餾水中即可。A.13石蠟切片制備取材固定24h,修整組織塊，換固定液重新固定12h,自來水沖洗24h、70%乙醇1h、85%乙醇1h、95%乙醇45min2次，無水乙醇30min3次，二甲苯30min,二甲苯5min～20min2次，放入石蠟二甲苯10min2次，然后依次通過無水乙醇、無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇各2min,再93min后，返藍(lán)液2min～5min,自來水5min,蒸餾水5min,然后依次通過50%乙醇、70%乙醇、80%GB/T42821—2023(資料性)B.1疾病描述包納米蟲病是由牡蠣包納米蟲(Bonamiaostreae)、殺蠣B.2病原現(xiàn)發(fā)現(xiàn)的包納米蟲包括5個種，除主要寄生在歐洲平牡蠣(Ostreaedulis)體內(nèi)的牡蠣包納米蟲(Bonamiaostreae)外，還有寄生在悉尼巖牡蠣(Saccostreaglomerata)體內(nèi)的魯夫來包納米蟲其在寄主細(xì)胞內(nèi)定位接觸30min即可感染牡蠣，其中以顆粒血細(xì)胞中的病原感染力最強(qiáng)。造成廣泛危害的主要為牡蠣包納米蟲和殺蠣包納米蟲。B.3易感宿主B.4臨床癥狀B.5地理分布我國目前尚未有水生動物包納米蟲病發(fā)生的報道。B.6組織印片檢查包納米蟲見圖B.1中箭頭所指位置。GB/T42821—2023圖B.1組織細(xì)胞內(nèi)的包納米蟲B.7血淋巴印片檢查在顯微鏡下可觀察到蟲體寄生于血淋巴細(xì)胞內(nèi)，呈球形或卵圓形，大小為2μm～5μm,姬姆薩染圖B.2牡蠣血液中的包納米蟲B.8組織病理學(xué)檢查包納米蟲呈球形或卵圓形，蟲體大小為2μm～5μm,細(xì)胞核紅染，細(xì)胞質(zhì)藍(lán)染。包納米蟲見圖B.3中箭頭所指的位置。GB/T42821—2023圖B.3牡蠣石蠟切片中包納米蟲的觀察GB/T42821—2023目標(biāo)擴(kuò)增序列及引物、探針的位置C.1Bonamiaostreae的PCR目標(biāo)擴(kuò)增序列及引物位置(300bp)CATTTAATTGGTCGccCTGGTCCTGATCCTTTACTTTGAGAAAATTAAAGTGCTCAAAGCAGGCTCGCGCCTGAATGCATTAGCATGG'AATAATAAGACACGACTTCGGCGC|CGCCT|CGGCGGTTGTTTTGTTGGTTTTGAGCTGGAGTAATGATTGATAGAAACAATTGGGGGTGCTAGTATCGCCGGGCCAGAGGTAAAATTCTTTAATTCCGGTGAGACTAACTTATGCGAAAGCATTCACCAAGCGTGTTTTCTTTAATCAAGAACTAAAGTTGGGGGATCGAAGACGATCAG點(diǎn)的酶切位置