GB/T 43158-2023 馬鈴薯黑脛病菌檢疫鑒定方法（正式版）

ICSCCS65.020.20馬鈴薯黑脛病菌檢疫鑒定方法國家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)IGB/T43158—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草原則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由全國植物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC271)提出并歸口。本文件起草單位：中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院、上海海關(guān)動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心、廣州海關(guān)技術(shù)中心。1GB/T43158—2023馬鈴薯黑脛病菌檢疫鑒定方法本文件描述了馬鈴薯黑脛病菌的檢測(cè)和鑒定方法。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成文本必不可少的條款。其中，注日期的引用文本文件。SN/T1157進(jìn)出境植物苗木檢疫規(guī)程SN/T2122進(jìn)出境植物及植物產(chǎn)品檢疫抽樣方法本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4馬鈴薯黑脛病菌基本信息菌目(Enterobacteriales)、溶果膠菌科/果膠桿菌科(Pectobacteriaceae)、狄克氏菌屬(Dickeya)。馬鈴薯黑脛病菌的相關(guān)信息見附錄A。5方法原理以及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,PCR)儀6.1.2培養(yǎng)箱。6.1.4離心機(jī)。2GB/T43158—20236.1.5Biolog儀。6.1.6PCR儀。6.1.7實(shí)時(shí)熒光PCR儀。6.2主要試劑除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純。7檢測(cè)流程病菌的分離、鑒定等檢測(cè)流程如圖1所示，檢測(cè)步驟可分步或同時(shí)進(jìn)行。有癥樣品有癥樣品病菌分離PCR檢測(cè)致病性測(cè)試Biolog測(cè)試煙草過敏性反應(yīng)馬鈴薯黑脛病菌馬鈴薯黑脛病菌陰性圖1檢測(cè)流程圖8檢測(cè)鑒定按SN/T1157和SN/T2122的規(guī)定取樣，觀察樣品上是否有變色和腐爛癥狀(見附錄A)。8.2病菌分離取癥狀樣品病健交界處組織0.1g～0.2g,使用70%酒精表面消毒30s,滅菌水洗3次后轉(zhuǎn)入離心管中，加入1mL滅菌水，浸泡15min,按照附錄B規(guī)定制作培養(yǎng)基，取浸出液在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NutritionAgarmedium,NA)平板上劃線分離；也可將浸出液稀釋10倍、100倍和1000倍后分別取100μL涂布NA平板，置于28℃下培養(yǎng)2d~3d后挑取疑似菌落，純化3次后用于后續(xù)試驗(yàn)。典型菌3GB/T43158—2023圖2NA培養(yǎng)基上的菌落8.3PCR檢測(cè)分離物提取脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid,DNA),按照附錄C的規(guī)定進(jìn)行常規(guī)PCR檢測(cè)或按照附錄D的規(guī)定進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，陽性分離物進(jìn)行后續(xù)測(cè)試，包括Biolog測(cè)試、致病性測(cè)試和煙草過敏性反應(yīng)測(cè)試等。8.4Biolog測(cè)試(可選)分離物在NA上培養(yǎng)24h后轉(zhuǎn)移至按照附錄B要求制作的BUG培養(yǎng)基上，置于30℃下培養(yǎng)24h,按照Biolog使用說明，調(diào)整菌懸液濁度加入GENⅢ微孔板中，每孔100μL。30℃下培養(yǎng)18h后8.5致病性測(cè)試分離物在NA上28℃培養(yǎng)24h后用滅菌水配成10?CFU/mL的菌懸液，針刺接種風(fēng)信子和馬鈴薯幼莖，以滅菌水作為對(duì)照，28℃光照培養(yǎng)，2d后觀察發(fā)病情況。風(fēng)信子接種癥狀如圖3所示，風(fēng)信子葉片上病斑呈水漬狀，病健交界清晰，后期變色軟腐；馬鈴薯接種癥狀如圖4所示，馬鈴薯莖干迅速變果判斷接種分離菌和接種物是否是同種細(xì)菌，完成致病性測(cè)試。4GB/T43158—2023圖4馬鈴薯上的接種癥狀(左側(cè)2株：Dickeyasolani;右側(cè)2株：無菌水)分離物在NA上28℃培養(yǎng)24h后用滅菌水配成10?CFU/mL的菌懸液，用滅菌注射器針頭注入普通煙草葉片背面表皮下，以滅菌水作為對(duì)照，28℃光照培養(yǎng)24h～48h,觀察煙草是否出現(xiàn)過敏性分離物的菌落形態(tài)特征與目標(biāo)菌相符，常規(guī)PCR或?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)為陽性，且致病性測(cè)試為陽性，判定為馬鈴薯黑脛病菌Dickeyasolani。必要時(shí)(實(shí)驗(yàn)室首次截獲、新寄主、新分布地等),增加Biolog測(cè)試和煙草過敏性反應(yīng)，Biolog測(cè)試為Dickeyasolani,能引起煙草過敏性反應(yīng)，判定為馬鈴薯黑脛病菌Dickeyasolani。樣品置于陰涼干燥處或冰箱中保存6個(gè)月。陽性樣品至少保存1年，以備復(fù)檢、談判和仲裁，樣品陽性分離物用30%甘油制成菌懸液，置于一80℃下保存1年；或凍干后于-20℃下保存。5GB/T43158—2023(資料性)病菌基本信息A.1名稱及分類地位分類地位：細(xì)菌界(Bacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、腸桿菌目(Enterobacteriales)、溶果膠菌科/果膠桿菌科(Pectobacteriaceae)、狄克氏菌屬(Dickeya)。A.2地理分布A.3寄主馬鈴薯(Solanumtuberosum)和風(fēng)信子(Hyacinthusorientalis)。A.4傳播途徑病菌主要通過球莖、塊莖、花卉、觀賞植物等繁殖材料的調(diào)運(yùn)進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播。田間傳播主要是通A.5生物學(xué)特征NA培養(yǎng)基上菌落圓形，扁平，邊緣略呈波紋狀生物3型，產(chǎn)生磷酸酶和吲NA培養(yǎng)基上39℃可生長。A.6癥狀病菌主要侵染莖基部和薯塊，在馬鈴薯生長期的各個(gè)階段均可發(fā)病。病菌主要通過帶病的種薯傳播，由傷口或莖皮孔侵入組織后發(fā)病，導(dǎo)致地下部塊莖腐爛與地上部植株莖腐及葉片枯死，如圖A.1和圖A.2風(fēng)信子種球上腐爛癥狀6GB/T43158—2023病重的塊莖播種后，種薯不發(fā)芽，或剛發(fā)芽就爛在土中，不能出苗；有的幼苗出土后病害發(fā)展至莖地軟化，呈乳白色至棕褐色。腐爛組織邊緣呈褐色至黑色，病健組織分界明顯，而后擴(kuò)展致整個(gè)塊莖腐爛，最后只剩薄薄的外皮。病株的葉片多先從上部葉片發(fā)病向下部葉片擴(kuò)展。發(fā)病初期，葉緣變枯干基部中空壞死。7GB/T43158—2023(規(guī)范性)培養(yǎng)基的制作要求B.1營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NutritionAgarmedium,NA)牛肉浸膏3.0g蛋白胨5.0g瓊脂17.0g酵母粉2.0g氯化鈉5.0g蒸餾水1000mL調(diào)整pH至7.4,121℃濕熱滅菌15min。B.2BUG瓊脂培養(yǎng)基(BUGagarmedium)BUG瓊脂培養(yǎng)基57.0g調(diào)整pH至7.4,121℃濕熱滅菌15min。B.3金氏B培養(yǎng)基(King's蛋白胨甘油磷酸氫二鉀硫酸鎂瓊脂蒸餾水Bmedium,KB)20.0g調(diào)整pH至7.2～7.4,121℃濕熱滅菌15min。8GB/T43158—2023(規(guī)范性)引物為Ds4(5'-aatgctaacgacggcgta-3')/Ds5(5'-atggtgttgcccaggttctg-3'),源于鞭毛蛋白編碼(flagellin-C.2反應(yīng)體系酸(deoxy-ribonucleosidetriphos上下游引物(引物濃度各為5μmol/L),1μL模板DNA,1.5UTaq聚合酶(5U/μL),加水至25μL。也可使用等效的PCR預(yù)混液配制反應(yīng)體系。以滅菌去離子水作空白對(duì)照，以D.solani的DNA作為陽性對(duì)照，以同屬其他種(如D.chrysanthemi或D.dadantii)DNA作為陰性對(duì)照。PCR反應(yīng)程序：94℃3min;94℃30s,65℃30s,72℃30s,循環(huán)35次；最后72℃10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠1×Tris乙酸鹽乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA)緩沖液(Trisacetate-EDTAbuffer,TAE)電泳，溴化乙錠(Ethidiumbromide,EB)或核酸9GB/T43158—2023(規(guī)范性)實(shí)時(shí)熒光PCRD.1引物及探針引物Ds4(5'-aatgctaacgacggcgta-3′)/Ds5(5'-atggtgttgcccaggttctg-3),D.3反應(yīng)條件(溫度/時(shí)間)D.4結(jié)果判定陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照均正常：GB/T43158—2023[1]SlawiakM,EojkowskaE,VanderWolfJM.FcausedbyDickeyaspp.(syn.Erwiniachrysanthemi)inPoland.PlantPathology.2009,58:794.tatoproductioninEurope.PlantPathology.2011,60(3):385-399.[3]Tsror(Lahkim)L,ErlichO,LebiushS.,etal.AssessmentofrecentoutbreaksofDickeyasp.(syn.Erwiniachrysanthemi)slowwiltinpotatocropsinIsrael.Europthology.2009,123:311-320.plantpathogenicbacteriumisolatedfrompotato(Solanumtuberosum).InternationalJournalofSys-[5]SarrisPF,TrantasE,PagoulatouM,etal.FirstreportofpotatoblacklegcausedbybiovaDickeyasp.(Pe