版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡介
關(guān)于酵母雙雜交酵母單雜交酵母三雜交酵母雙雜交系統(tǒng)的建立是基于對真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認(rèn)識。細(xì)胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與第2頁,共26頁,星期六,2024年,5月
反式轉(zhuǎn)錄激活因子
結(jié)構(gòu)上是組件式的,即這些因子往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,其中有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNAbindingdomain,簡稱為BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activationdomain,簡稱為AD)。
第3頁,共26頁,星期六,2024年,5月
這兩個(gè)結(jié)合域?qū)⑺鼈兎珠_時(shí)仍分別具有功能,但不能激活轉(zhuǎn)錄,只有當(dāng)被分開的兩者通過適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近時(shí),才能重新呈現(xiàn)完整的轉(zhuǎn)錄因子活性,并可激活上游激活序列(upstreamactivatingsequence,UAS)的下游啟動(dòng)子,使啟動(dòng)子下游基因得到轉(zhuǎn)錄。
第4頁,共26頁,星期六,2024年,5月酵母雙雜交第5頁,共26頁,星期六,2024年,5月酵母雙雜交系統(tǒng)的另一個(gè)重要的元件
報(bào)道株指經(jīng)改造的、含報(bào)道基因(reportergene)的重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。
最常用的是酵母細(xì)胞,酵母細(xì)胞作為報(bào)道株具有許多優(yōu)點(diǎn):
〈1〉易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴(kuò)增質(zhì)粒。
〈2〉具有可直接進(jìn)行選擇的標(biāo)記基因和特征性報(bào)道基因。
〈3〉酵母的內(nèi)源性蛋白不易同來源于哺乳動(dòng)物的蛋白結(jié)合第6頁,共26頁,星期六,2024年,5月根據(jù)這個(gè)特性,將編碼DNA-BD的基因與已知蛋白質(zhì)Baitprotein的基因構(gòu)建在同一個(gè)表達(dá)載體上,在酵母中表達(dá)兩者的BD-Baitprotein融合蛋白。將編碼AD的基因和cDNA文庫的基因構(gòu)建在
AD-LIBRARY表達(dá)載體上,在酵母中表達(dá)兩者的融合蛋白。第7頁,共26頁,星期六,2024年,5月第8頁,共26頁,星期六,2024年,5月如果誘餌蛋白和靶蛋白能夠相互作用,那么GAL4DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和GAL4激活結(jié)構(gòu)域就會相互作用,從而激活lacZ報(bào)道基因的表達(dá)。所以我們可以通過轉(zhuǎn)化的酵母的表型來確定誘餌蛋白和靶蛋白是否有相互作用。
第9頁,共26頁,星期六,2024年,5月
第10頁,共26頁,星期六,2024年,5月這種改造后的酵母細(xì)胞的基因組中既不能產(chǎn)生GAL4,又不能合成ADE、HIS、LEU、TRP,因此,酵母在缺乏這些營養(yǎng)的培養(yǎng)基上無法正常生長。當(dāng)上述兩種載體所表達(dá)的融合蛋白能夠相互作用時(shí),功能重建的反式作用因子能夠激活酵母基因組中的報(bào)告基因ADE、HIS、LACZ、MEL1,從而通過功能互補(bǔ)和顯色反應(yīng)篩選到陽性菌落。將陽性反應(yīng)的酵母菌株中的AD-LIBRARY載體提取分離出來,從而對載體中插入的文庫基因進(jìn)行測序和分析工作。
第11頁,共26頁,星期六,2024年,5月綜上:酵母雙雜交系統(tǒng)通過兩個(gè)雜交蛋白在酵母細(xì)胞中的相互結(jié)合及對報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄激活來捕獲新的蛋白質(zhì),其大致步驟為:
1、視已知蛋白的cDNA序列為誘餌(bait),將其與DNA結(jié)合域融合,構(gòu)建成誘餌質(zhì)粒。
2、將待篩選蛋白的cDNA序列與轉(zhuǎn)錄激活域融合,構(gòu)建成文庫質(zhì)粒。第12頁,共26頁,星期六,2024年,5月3、將這兩個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化于酵母細(xì)胞中。4、酵母細(xì)胞中,已分離的DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活域不會相互作用,但誘餌蛋白若能與待篩選的未知蛋白特異性地相互作用,則可激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄;反之,則不能。利用4種報(bào)告基因的表達(dá),便可捕捉到新的蛋白質(zhì)。第13頁,共26頁,星期六,2024年,5月
酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用1、利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能當(dāng)我們將已知基因作為誘餌,在選定的cDNA文庫中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白,從篩選到的陽性酵母菌株中可以分離得到AD-LIBRARY載體,并從載體中進(jìn)一步克隆得到隨機(jī)插入的cDNA片段,并對該片段的編碼序列在GENEBANK中進(jìn)行比較,研究與已知基因在生物學(xué)功能上的聯(lián)系。另外,也可作為研究已知基因的新功能或多個(gè)篩選到的已知基因之間功能相關(guān)的主要方法。第14頁,共26頁,星期六,2024年,5月
2、利用酵母雙雜交在細(xì)胞體內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用
利用酶聯(lián)免疫(ELISA)、免疫共沉淀(CO-IP)技術(shù)都是利用抗原和抗體間的免疫反應(yīng),可以研究抗原和抗體之間的相互作用,但是,它們都是基于體外非細(xì)胞的環(huán)境中研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用。而在細(xì)胞體內(nèi)的抗原和抗體的聚積反應(yīng)則可以通過酵母雙雜交進(jìn)行檢測。
第15頁,共26頁,星期六,2024年,5月
3、利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點(diǎn)以及藥物對蛋白質(zhì)之間相互作用的影響
酵母雙雜交的報(bào)告基因能否表達(dá)在于誘餌蛋白與靶蛋白之間的相互作用。對于能夠引發(fā)疾病反應(yīng)的蛋白互作可以采取藥物干擾的方法,阻止它們的相互作用以達(dá)到治療疾病的目的。例如:Dengue病毒能引起黃熱病、肝炎等疾病,研究發(fā)現(xiàn)它的病毒RNA復(fù)制與依賴于RNA的RNA聚合酶(NS5)與拓?fù)洚悩?gòu)酶NS3,以及細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)受體BETA-importin的相互作用有關(guān)。研究人員通過酵母雙雜交技術(shù)找到了這些蛋白之間相互作用的氨基酸序列。如果能找到相應(yīng)的基因藥物阻斷這些蛋白之間的相互作用,就可以阻止RNA病毒的復(fù)制,從而達(dá)到治療這種疾病的目的。
第16頁,共26頁,星期六,2024年,5月4、利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖
眾多的蛋白質(zhì)之間在許多重要的生命活動(dòng)中都是彼此協(xié)調(diào)和控制的。基因組中的編碼蛋白質(zhì)的基因之間存在著功能上的聯(lián)系。通過基因組的測序和序列分析發(fā)現(xiàn)了很多新的基因和EST序列,HUA等人利用酵母雙雜交技術(shù),將所有已知基因和EST序列為誘餌,在表達(dá)文庫中篩選與誘餌相互作用的蛋白,從而找到基因之間的聯(lián)系,建立基因組蛋白連鎖圖。對于認(rèn)識一些重要的生命活動(dòng):如信號傳導(dǎo)、代謝途徑等有重要意義第17頁,共26頁,星期六,2024年,5月
在酵母雙雜交的基礎(chǔ)上,又發(fā)展出了
酵母單雜交、酵母三雜交和酵母的反向雜交技術(shù)。它們被分別用于核酸和文庫蛋白之間的研究、三種不同蛋白之間的互作研究和兩種蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)和位點(diǎn)。第18頁,共26頁,星期六,2024年,5月
酵母單雜交技術(shù)最早是從酵母雙雜交技術(shù)發(fā)展而來,酵母雙雜交技術(shù)通過對報(bào)告基因的表型進(jìn)行檢測以實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)間相互作用的研究,而酵母單雜交技術(shù)則通過對報(bào)告基因的表型檢測,分析DNA、蛋白之間的相互作用,以研究真核細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)調(diào)控。第19頁,共26頁,星期六,2024年,5月
原理用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL4蛋白即是一種典型的轉(zhuǎn)錄因子。研究表明GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域靠近羧基端,含有幾個(gè)鋅指結(jié)構(gòu),可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(diǎn)(UAS);而轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可與RNA聚合酶或轉(zhuǎn)錄因子TFIID相互作用,提高RNA聚合酶的活性。在這一過程中,DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可完全獨(dú)立地發(fā)揮作用。據(jù)此,我們可將GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域置換為其他蛋白,只要他能與我們想要了解的目的基因相互作用,就照樣可以通過其轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域激活RNA聚合酶,從而啟動(dòng)對下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。第20頁,共26頁,星期六,2024年,5月
正是基于這一理論,酵母單雜交系統(tǒng)由2部分組成:(1)將文庫蛋白片段與GAL4轉(zhuǎn)錄激活域融合表達(dá)的cDNA文庫質(zhì)粒;(2)含有目的基因和下游報(bào)告基因的報(bào)告質(zhì)粒.
首先將報(bào)告質(zhì)粒整合入酵母基因組,產(chǎn)生帶有目的基因的酵母報(bào)告株;
再將文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入報(bào)告株;
若存在文庫蛋白與目的基因的相互作用,可通過對報(bào)告基因的表達(dá)將文庫蛋白的基因篩選出來.第21頁,共26頁,星期六,2024年,5月
酵母三雜交系統(tǒng)的原理與酵母雙雜交相似,利用了酵母細(xì)胞的GAL4蛋白調(diào)節(jié)目的基因(半乳糖苷酶基因及His3基因)轉(zhuǎn)錄的特點(diǎn)。GAL4蛋白具有兩個(gè)可分離的功能區(qū),N端是DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,C端為轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。只要這兩個(gè)相對獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域能夠通過一定的方式在空間上足夠的靠近(如借助其他分子的相互結(jié)合使其足夠靠近),即使它們之間沒有共價(jià)結(jié)合也可激活轉(zhuǎn)錄,這為研究蛋白質(zhì)與其他分子的相互作用提供了可能。第22頁,共26頁,星期六,2024年,5月
第23頁,共26頁,星期六,2024年,5月
上圖顯示了酵母三雜交系統(tǒng)的原理。在酵母三雜交系統(tǒng),lexA啟動(dòng)子調(diào)控下游LacZ基因和His3基因的表達(dá),而lexA啟動(dòng)子的激活取決于DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域能否在空間上相互靠近。其中第一個(gè)融合蛋白由兩部分組成,一部分為能結(jié)合lexA啟動(dòng)子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,另一部分為噬菌體衣殼蛋白MS2。第二個(gè)融合蛋白也由兩部分組成,一部分為能激活lexA啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域,另一部分為有待研究的RNA結(jié)合蛋白“Y”。第24頁,共26頁,星期六,2024年,5月
這兩個(gè)融合蛋白通過第三個(gè)融合的RNA分子相連,其一端為含有噬菌體衣殼蛋白MS2結(jié)合位點(diǎn)的MS2RNA,另一端為有待研究的RNA“X”。一旦“X”和“Y”能有相互作用就使得這個(gè)復(fù)合物形成一個(gè)功能性的轉(zhuǎn)錄激活因子,從
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 人人文庫網(wǎng)僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 專業(yè)水產(chǎn)養(yǎng)殖銷售協(xié)議格式2024年版一
- 2025-2030全球卡布奇諾發(fā)泡劑行業(yè)調(diào)研及趨勢分析報(bào)告
- 2025年全球及中國CO2激光冷水機(jī)行業(yè)頭部企業(yè)市場占有率及排名調(diào)研報(bào)告
- 2025-2030全球ZSM-5沸石分子篩行業(yè)調(diào)研及趨勢分析報(bào)告
- 2025-2030全球無人機(jī)飛行表演行業(yè)調(diào)研及趨勢分析報(bào)告
- 二零二五年機(jī)場建設(shè)砂石料購銷合同2篇
- 2025年全球及中國望遠(yuǎn)鏡赤道儀跟蹤支架行業(yè)頭部企業(yè)市場占有率及排名調(diào)研報(bào)告
- 2025-2030全球醫(yī)療用超低溫冰箱 (ULF)行業(yè)調(diào)研及趨勢分析報(bào)告
- 2025-2030全球生產(chǎn)型印刷系統(tǒng)行業(yè)調(diào)研及趨勢分析報(bào)告
- 2025年全球及中國防水卡尺行業(yè)頭部企業(yè)市場占有率及排名調(diào)研報(bào)告
- 2025年河北供水有限責(zé)任公司招聘筆試參考題庫含答案解析
- 《材料分析測試技術(shù)》全套教學(xué)課件
- 人教版8年級上英語各單元語法課件大全
- (完整版)形式發(fā)票模版(國際件通用)
- 武漢東湖賓館建設(shè)項(xiàng)目委托代建合同
- 安徽大學(xué)大學(xué)生素質(zhì)教育學(xué)分認(rèn)定辦法
- 巴布亞新幾內(nèi)亞離網(wǎng)光儲微網(wǎng)供電方案
- 高度限位裝置類型及原理
- 中文版gcs electrospeed ii manual apri rev8v00印刷稿修改版
- 新生兒預(yù)防接種護(hù)理質(zhì)量考核標(biāo)準(zhǔn)
- 除氧器出水溶解氧不合格的原因有哪些
評論
0/150
提交評論