《基于mRNA-LNP技術的（細胞）免疫治療產品開發(fā)指南》征求意見稿

1T/FDSAXXXX—202X基于mRNA-LNP技術的（細胞）免疫治療產品開發(fā)指南本文件適用于基于mRNA-LNP技術的（細胞）免疫治療產品開發(fā)的全流程和相關質量管理，包括mRNA-LNP制備及質量控制、工程化免疫細胞制備及質量控制、功能驗證，以及物料管理、生產環(huán)境、生產設備、人員管理等須遵循的基本要求和原則，旨在幫助研究機構更好地利用mRNA-LNP技術開發(fā)細胞免疫治療產品。本文件適用于科研機構、生產企業(yè)基于mRNA-LNP技術開發(fā)CAR-T或CAR-NK細胞等免疫治療產品的全過程。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成對本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T29022粒度分析動態(tài)光散射法GB/T42398細胞培養(yǎng)潔凈室設計技術規(guī)范GB50457醫(yī)藥工業(yè)潔凈廠房設計標準JGJ91科研建筑設計標準ISO17867粒度分析-小角度X射線散射[Particlesizeanalysis—SmallangleX-rayscattering（SAXS）]中華人民共和國藥典（簡稱《中國藥典》）國家藥包材標準免疫細胞治療產品藥學研究與評價技術指導原則（試行）細胞治療產品研究與評價技術指導原則（試行）細胞制品研究與評價技術指導原則體外基因修飾系統(tǒng)藥學研究與評價技術指導原則（試行）基因修飾細胞治療產品非臨床研究技術指導原則（試行）體細胞臨床研究工作指引（試行）藥物非臨床研究質量管理規(guī)范脂質體藥物非臨床藥代動力學研究指導原則新藥用輔料非臨床安全性評價指導原則藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則藥品包裝材料與藥物相容性試驗指導原則醫(yī)療衛(wèi)生機構開展研究者發(fā)起的臨床研究管理辦法藥物臨床試驗質量管理規(guī)范中華人民共和國人類遺傳資源管理條例化學藥品與彈性體密封件相容性研究技術指導原則（試行）化學藥品注射劑與塑料包裝材料相容性研究技術指導原則（試行）化學藥品注射劑與藥用玻璃包裝容器相容性研究技術指導原則（試行）化學藥品注射劑生產所用的塑料組件系統(tǒng)相容性研究技術指南（試行）國際人用藥品注冊技術協(xié)調會（ICH）E6（GoodClinicalPractice）2T/FDSAXXXX—202X來源于人或動物細胞系的生物技術產品的病毒安全性評價（ViralSafetyEvaluationofBiotechnologyProductsDerivedfromCellLinesofHumanorAnimalOrigin）美國藥典（TheUnitedStatesPharmacopoeia）3術語和定義3.1信使核糖核酸（mRNA）MessengerRNAmRNA是由DNA的一條鏈作為模板轉錄而來的單鏈核糖核酸，攜帶遺傳信息能指導蛋白質合成的一類單鏈核糖核酸。在細胞內，mRNA通過與核糖體結合，并在tRNA（轉運RNA）的幫助下，翻譯成多肽鏈，進而形成蛋白質。mRNA在基因表達過程中起著承上啟下的作用，它從DNA傳遞遺傳信息，指導蛋白質的合成，從而控制生物體的生長、發(fā)育和功能。3.2自擴增核糖核酸（saRNA）Self-amplifyingRNA自擴增RNA是一種能夠以自身序列為模板，進行自我擴增的線性mRNA。saRNA主要衍生于甲病毒基因組，通過替換病毒結構蛋白的編碼基因序列編碼來構建。因此，saRNA保持了源于RNA病毒載體的自復制活性，在進入細胞內后可以像病毒一樣，能夠利用宿主細胞進行自我復制，并指示細胞持續(xù)制造治療性蛋白質來發(fā)揮作用。3.3環(huán)狀RNA（circRNA）circularRNA一類單鏈閉合的RNA分子，由mRNA前體通過可變剪接產生，與傳統(tǒng)的線性RNA不同，circRNA分子呈封閉環(huán)狀結構，不受RNA外切酶影響，表達更穩(wěn)定，不易降解。3.4體外轉錄Invitrotranscription主要是以質粒DNA為模板通過體外轉錄得到RNA，常用的是以線性化質粒DNA或PCR擴增產物為模板利用RNA聚合酶在體外轉錄合成。3.5PIE（PermutedIntron-Exon）系統(tǒng)一種將mRNA合成環(huán)狀RNA的系統(tǒng)。通過序列設計將天然的內含子、外顯子反向剪切而形成新的內含子-外顯子構建體，可以在構建體中間插入目的序列，這個構建體為PIE系統(tǒng)。3.6超濾ultrafiltration一項膜分離技術，主要以壓力為動力，將大分子與小分子進行分離，常用于溶液中溶劑的置換，樣品的純化等。3.73T/FDSAXXXX—202XRNAR酶RNaseR具有催化功能的小分子RNA，屬于生物催化劑。RNaseR能消化線性RNA（LinearRNA），但不能消化環(huán)狀RNA（CircularRNA，circRNA）、套索RNA（LariatRNA）、3’突出末端少于7個核苷酸的雙鏈RNA以及具有復雜二級結構的tRNA、5SRNA等。3.8脂質納米顆粒（LNP）lipidnanoparticle是一種由多個脂質成分構建的納米級載體。它通常由可電離脂質、輔助脂質、膽固醇和PEG化脂質組成。3.9聚合物分散性指數(shù)（PDI）polydispersityindex一種描述顆粒尺寸分布均勻程度的參數(shù)。PDI的值越小，顆粒尺寸分布越均勻；反之，PDI的值越大，顆粒尺寸分布越不均勻。3.10佐劑adjuvant與抗原同時或預先注射，可非特異性地增強或改變機體對抗原免疫應答的物質，稱為佐劑。3.11微流控microfluidic使用微管道（尺寸為數(shù)十到數(shù)百微米）處理或操縱微小流體（體積為納升到阿升）。3.12氮磷比（N/P）nitrogenphosphorusratio基于陽離子胺氮（在陽離子脂質中）和核酸中磷酸基團濃度計算正負電荷之比。3.13跨膜壓（TMP）transmembranepressure純化系統(tǒng)中跨越透析膜兩側的壓力差。3.14免疫原性immunogenicity能引起免疫應答的性能，即抗原能刺激特定的免疫細胞，使免疫細胞活化、增殖、分化，最終產生免疫效應物質抗體和致敏淋巴細胞的特性。3.15轉錄Transcription是遺傳信息從DNA流向RNA的過程。即以雙鏈DNA中的確定的一條鏈（模板鏈用于轉錄，編碼鏈不用于轉錄）為模板，以A、U、C、G四種核糖核苷酸為原料，在RNA聚合酶催化下合成RNA的過程。3.164T/FDSAXXXX—202X質粒plasmid一類存在于細菌和真菌細胞中獨立于染色體DNA而自主復制的共價、閉合、環(huán)狀DNA分子，通常攜帶一定數(shù)量的基因，是基因工程最常見的載體。3.17外周血單個核細胞（PBMC）peripheralbloodmononuclearcell血液中具有單個核的細胞，主要包括淋巴細胞、單核細胞、巨細胞、樹突狀細胞和少量其他細胞類型。3.18核糖核酸酶（RNase）ribonuclease水解核糖核酸（RNA）中磷酸二酯鍵，生成寡核苷酸或單核苷酸的核酸酶。3.19脫氧核糖核酸酶（DNase）deoxyribonuclease水解脫氧核糖核酸（DNA）中磷酸二酯鍵，生成寡核苷酸或單核苷酸的核酸酶。3.20STR分析shorttandemrepeatSTR分型檢測是一種用于檢測人類及哺乳動物的基因組。3.21T細胞T-lymphocyteT淋巴細胞來源于骨髓的多功能干細胞（胚胎期則來源于卵黃囊和肝）。在人體胚胎期和初生期，骨髓中的一部分多能干細胞或前T細胞遷移到胸腺內，在胸腺激素的誘導下分化成熟，成為具有免疫活性的T細胞。3.22感受態(tài)細胞competentcell理化方法誘導細胞，吸收周圍環(huán)境中的DNA分子，使其處于最適攝取和容納外來DNA的生理狀態(tài)。3.23核苷酸nucleotide核苷酸是一類由嘌呤堿或嘧啶堿、核糖或脫氧核糖以及磷酸三種物質組成的化合物，又稱核甙酸。3.24自然殺傷細胞（NK）naturalkillercell自然殺傷細胞是機體重要的免疫細胞，不僅與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調節(jié)有關，而且在某些情況下參與超敏反應和自身免疫性疾病的發(fā)生，能夠識別靶細胞、殺傷介質。3.25原液Bulk5T/FDSAXXXX—202X指用于制造最終配制物（Fillalformulation）或半成品（FinalBulk）的均一物質。4縮略語3’UTR：3′非翻譯區(qū)（3’Un-translatedregion）5’UTR：5′非翻譯區(qū)（5’Un-translatedregion）ATP：腺嘌呤核苷三磷酸（adenosinetriphosphate）CAR：嵌合抗原受體（ChimericAntigenReceptor）CAR-T：嵌合抗原受體T細胞（chimericantigenreceptorTcell）CAR-NK：嵌合抗原受體NK細胞（chimericantigenreceptorNKcell）CAR-qPCR：測定CAR部分的qPCR方法（CARQuantitativePCR）CD3+：分化抗原簇3（ClusterofDifferentiation3）CD4+：分化抗原簇4（ClusterofDifferentiation4）CD8+：分化抗原簇8（ClusterofDifferentiation8）CRS：細胞因子釋放綜合征（cytokinereleasesyndrome）DLT：劑量限制性毒性（Doselimitingtoxicity）DNA：脫氧核糖核酸（DeoxyriboNucleicAcid）ddPCR：微滴式數(shù)字PCR（DropletDigitalPCR）dsRNA：雙鏈核糖核酸（double-strandedRNA）ELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linkedimmunosorbentassay）FACS：流式細胞術（FlowCytometry）FOB：功能觀察試驗組合（FunctionalObservationBattery）GTP：鳥苷三磷酸（Guanosinetriphosphate）HHV：人類皰疹病毒（Humanherpesvirus）HPLC：高效液相色譜法（HighPerformanceLiquidChromatography）HPLC-CAD：高效的高效液相色譜-電霧式檢測器（high-performanceliquidchromatography-diodearraydetection）HLA：人類白細胞抗原（humanleukocyteantigen）IIT：研究者發(fā)起的臨床試驗（Investigator-InitiatedClinicalTrial）IL-2：白細胞介素-2（interleukin2）IL-4：白細胞介素-4（interleukin4）IL-6：白細胞介素-6（interleukin6）IL-10：白細胞介素-10（interleukin10）INF-γ：干擾素γ（Interferongamma）IVT：體外轉錄（Invitrotranscription）IST：藥企發(fā)起的臨床試驗（Industry-SponsoredClinicalTrial）mRNA：信使RNA（MessagerRNA）mRNAseq：轉錄組測序技術（mRNAsequencing）nickedRNA：circRNA的開環(huán)異構體NAT：核酸擴增檢測法（nucleicacidamplificationtest）NTP：核苷三磷酸（Nucleosidetriphosphate）PBMC：外周血單個核細胞（Peripheralbloodmononuclearcell）PCR：聚合酶鏈式反應（PolymeraseChainReaction）Poly（A）：聚腺嘌呤（Polyadenine）6T/FDSAXXXX—202XRT-PCR：逆轉錄PCR（ReverseTranscriptionPCR）preRNA：前體RNA（precursorRNA）qPCR：定量PCR（QuantitativePCR）RNA：核糖核酸（RibonucleicAcid）SAXS：X射線小角散射（small-anglex-rayscattering）TNF-α：腫瘤壞死因子-α（TumorNecrosisFactor）5mRNA-LNP制備及質量控制5.1模板質粒序列設計與合成5.1.1mRNA模板質粒序列設計與合成線性mRNA模板質粒序列設計與合成.1DNA轉錄模板設計宜包括：a）目的基因。宜分別闡述其序列來源、基因和氨基酸序列、共翻譯機制，以及在疾病預防或治療中的作用；b）功能性元件的設計及確認研究結果。功能性元件的設計宜包括轉錄啟動子的選擇，帽子結構設計，5’UTR和3’UTR的設計，信號肽和蛋白標簽的設計（如有Poly（A）加尾結構及長度設計，線性化位點選擇，所用核苷三磷酸（NTP）類型及其修飾信息等。.2若對編碼目的蛋白的mRNA序列進行了任何修飾、序列優(yōu)化（如密碼子優(yōu)化等宜保留修飾或序列優(yōu)化的依據(jù)與目的（如提高mRNA翻譯效率、降低模板合成難度、降低先天免疫原性、增加穩(wěn)定性等）。宜保留修飾或優(yōu)化后的序列示意圖等，并對序列修飾或優(yōu)化的利弊進行權衡分析，保留確認的支持性研究結果。自復制mRNA模板質粒序列設計與合成.1使用自復制mRNA載體來表達目的蛋白，除了闡述目的基因外，需保留以下信a）編碼病毒RNA依賴性RNA聚合酶復合物（復制子）的序列來源，并闡述其功能；b）若復制子序列含有氨基酸突變，闡述突變的依據(jù)和功能變化；c）若自復制mRNA的加帽序列與病毒天然起始序列不一致，闡述選擇依據(jù)和效果對d）若病毒復制子與目的蛋白分別位于不同的mRNA分子上，需額外的控制措施（比如二者長度、純度、加帽類型和摩爾比例）以確保它們的協(xié)同作用，并予以說明。.2若對自復制mRNA序列進行了任何修飾、序列優(yōu)化，宜保留修飾或序列優(yōu)化的依據(jù)與目的。宜保留修飾或優(yōu)化后的序列示意圖等，并對序列修飾或優(yōu)化的利弊進行權衡分析，保留確認的支持性研究結果。5.1.2circRNA模板質粒序列設計與合成序列設計策略circRNA成環(huán)策略包括化學合成法、酶促連接法、Ⅰ型內含子自剪接系統(tǒng)、Ⅱ型內含子自剪接系統(tǒng)等，宜闡述模板設計的環(huán)化方式及成環(huán)原理。目的基因7T/FDSAXXXX—202X.1宜闡述目的基因來源、基因和氨基酸序列及蛋白結構，及其表達蛋白在疾病預防或治療中的作用或作用機理。.2關注序列篩選及優(yōu)化過程，若對編碼目的基因序列進行了任何修飾、序列優(yōu)化或序列改構，宜保留修飾或序列優(yōu)化的依據(jù)與目的。宜保留結構示意圖等，宜與數(shù)據(jù)庫收錄的相關序列進行序列比對，并對基因修飾或序列改構的利弊進行權衡分析，保留確認的支持性研究結果。功能性元件.1宜提供功能性元件的設計及確認研究結果。功能性元件的設計宜包括轉錄啟動子、自剪切內含子的選擇，IRES結構設計，5’UTR和3’UTR的設計，外顯子殘留，Poly（A）加尾結構及長度設計，增強轉錄及翻譯效率相關元件、選擇性標記、復制起始位點、額外引入的基因序列等的來源及選擇依據(jù)，明確完整的帶注釋的序列信息。.2宜設計合理線性化酶切位點，避免多余序列殘留。.3質粒構建時宜避免使用β-內酰胺類抗生素抗性基因。5.1.3質粒載體骨架部分序列設計與合成對質粒模板骨架中包含的控制元件和選擇標記的序列與來源進行闡述，如：轉錄啟動子、轉錄終止子、抗生素抗性標記、質粒復制子、多克隆位點、線性化位點等。a）宜選擇高拷貝的質粒復制子（如pUC/pBR322），以提升質粒產量。b）抗生素使用應符合《中國藥典》的相關要求，避免使用β-內酰胺類抗生素抗性基因。c）多克隆位點宜包含常見且唯一的限制性內切酶位點如HindIII、BamHI、NotI等。d）明確轉錄啟動子（如T7啟動子）及其下游的加帽起始序列。e）明確終止子的序列及其功能。f）宜設計合理線性化酶切位點，避免多余序列殘留。5.2模板質粒序列設計與合成質量控制5.2.1對轉錄模板的控制元件和選擇標記的序列與來源進行闡述，如：轉錄啟動子、轉錄終止序列、抗生素抗性標記等進行分析?？股厥褂脩稀吨袊幍洹返南嚓P要求。5.2.2提供構建和制備轉錄模板質粒的詳細信息和步驟、鑒定及確證方法。5.2.3宜結合工程菌種子庫的檢定對轉錄模板質粒進行全基因序列分析及確認，提供用于生產mRNA或circRNA的轉錄模板的全長核苷酸序列，宜分析轉錄模板的控制元件、插入的目的基因序列、選擇標記基因有無變異等。5.2.4質粒模板中包含Poly（A）序列，宜通過測序等方法確保質粒模板中Poly（A）序列的完整性可以滿足下游應用。5.3建立種子批系統(tǒng)5.3.1建立種子批的關鍵起始原材料包括質粒DNA和感受態(tài)細胞，宜有清晰的來源和完整的溯源信息，對轉錄模板質粒宜明確其控制元件和選擇標記的序列與來源，如轉錄啟動子、抗生素抗性標記等。5.3.2將合格的目的質粒轉化至適宜的宿主菌，經(jīng)克隆篩選后建立至少兩級種子批系統(tǒng)，宜避免存在其他細菌、真菌和噬菌體的污染，以及確保在限定代次內具有遺傳穩(wěn)定性。5.3.3原始種子庫的建立過程包括模板質粒轉化宿主菌、單克隆篩選和傳代培養(yǎng)。其中單克隆篩選宜重點關注模板質粒的產量、超螺旋純度、Poly（A）完整性等。5.3.4主種子庫和工作種子庫的建立過程包括種子復蘇、傳代培養(yǎng)和分裝凍存。建庫過程8T/FDSAXXXX—202X宜遵循《藥品生產質量管理規(guī)范》要求，確保無外源因子污染和交叉污染。5.3.5建立種子庫使用的物優(yōu)先采用風險級別較低的物料，如國家已批準上市的藥品，藥用級原輔料，GMP級物料，宜避免使用人源或動物源性物料。5.3.6對各級種子庫，宜明確制備規(guī)模、擴增條件、貯存條件等信息。種子庫標簽標明菌種編號、模板質粒名稱、代次、批號、規(guī)格和制備日期等內容。5.3.7種子庫的管理宜遵循《中國藥典》通則“生物制品生產檢定用菌毒種管理及質量控制”的要求。5.4種子庫檢定和穩(wěn)定性研究5.4.1種子批檢定宜遵循《中國藥典》通則“生物制品生產檢定用菌毒種管理及質量控制”和“人用基因治療制品總論”的要求。5.4.2種子批的檢定項目一般包括菌落形態(tài)、鑒別、染色鏡檢、生化特性、活率、抗生素抗性、電鏡檢查、目的基因和其他元件測序、限制性酶切圖譜等，種子批宜無其他細菌、真菌、噬菌體等污染。5.4.3對主種子庫和工作種子庫進行傳代穩(wěn)定性研究，使用模擬或代表實際生產工藝的條件開展傳代穩(wěn)定性研究，種子批的遺傳和表型特征宜能滿足生產需求。5.4.4傳代穩(wěn)定性考察的指標一般包括質粒序列、質粒限制酶切圖譜、質粒保有率、質?？截悢?shù)、超螺旋純度、Poly（A）完整性等。根據(jù)研究結果明確種子批的限定傳代代次。限定傳代代次需要覆蓋生產規(guī)模的最大代次。5.4.5宜對主種子庫和工作種子庫開展貯存穩(wěn)定性研究，關注在貯存條件下和時長內種子庫的活菌數(shù)和活率等，種子批的貯存穩(wěn)定性宜能滿足生產需求。5.5模板質粒制備5.5.1模板質粒的制備應基于種子庫系統(tǒng)，一般包括種子庫復蘇和擴增、發(fā)酵、純化和分裝保存，宜遵循《藥品生產質量管理規(guī)范》要求，確保無外源因子污染和交叉污染。宜采取適當?shù)拇胧┓乐笵Nase等污染，包括環(huán)境、耗材及原料中的DNase消除和殘留檢測。5.5.2模板質粒的制備過程中不宜使用人源和動物源性材料。5.5.3在發(fā)酵過程中不宜使用β-內酰胺類抗生素。如需使用其他種類的抗生素，如卡那霉素，宜說明使用的必要性，并對模板質粒的純化中間體及成品的抗生素殘留量進行控制和安全性評估。5.5.4模板質粒的純化工藝單元的設定宜考慮后續(xù)生產規(guī)模放大的可行性，宜采用可放大的超濾和層析操作單元。5.5.5模板質粒的成品分裝規(guī)格宜與后續(xù)的質粒DNA線性化規(guī)模相適應，宜開展儲存穩(wěn)定性研究。5.5.6模板質粒的成品標簽標明質粒名稱、貯存條件、批號、規(guī)格、生產日期等信息。5.6模板質粒質量控制5.6.1宜建立模板質粒質量控制要求，根據(jù)不同的mRNA-LNP制備工藝及研發(fā)側重點選取相應的質量控制指標。特別注意外源因子污染和交叉污染，宜采取適當?shù)拇胧┓乐笵Nase等污染，包括環(huán)境、耗材及原料中的DNase消除和殘留檢測。無菌可參照《中國藥典》通則“1101無菌檢查法”，或選用快速無菌檢查法如ATP生物發(fā)光法、固相細胞計數(shù)、呼吸作用進行檢測。9T/FDSAXXXX—202X細菌內毒素按照《中國藥典》通則“1143細菌內毒素檢查法：凝膠法、光度測定法”檢測。外觀可參照《中國藥典》通則“0901溶液顏色檢查法”、“0902澄清度檢查法”、“0904可見異物檢查法”進行檢測。pH按照《中國藥典》通則“0631pH值測定法”檢測。質粒純度（A260/280）按照《中國藥典》通則“0401紫外-可見分光光度法”檢測。宿主細胞蛋白質殘留按照《中國藥典》通則“3412菌體蛋白質殘留量測定法”檢測。宿主細胞DNA殘留量按照《中國藥典》通則“3407外源性DNA殘留量測定法”檢測。宿主細胞RNA殘留量可參照《中國藥典》通則“0541電泳法”、“0542毛細管電泳”，或選用PCR法、熒光毛細管電泳CE法進行檢測。全序列測定可參照《中國藥典》指導原則“9108DNA測序技術指導原則”，或選用sanger法進行檢測。0質粒濃度（A260）按照《中國藥典》通則“0401紫外-可見分光光度法”檢測。1RNase殘留可參照熒光探針法（詳見附錄A），或選用ELISA法進行檢測。2限制性內切酶鑒別可參照《中國藥典》通則“0541電泳法”、“0542毛細管電泳”進行檢測。3Poly（A）完整性可參照《中國藥典》指導原則“9108DNA測序技術指導原則”、“05或選用sanger法進行檢測。4超螺旋比例可參照《中國藥典》通則“0512高效液相色譜法”、“0513離子色譜法”、“0542毛細管電泳法”、“3431質粒DNA構象測定法”進行檢測。5.6.2質量控制指標匯總見表1。T/FDSAXXXX—202X表1模板質粒質量控制指標匯總表）；）；- 質-《中國藥典》三部毛細管電泳（通則0542）----pH5.7質粒DNA線性化5.7.1制備流程制備流程：酶切→陰離子交換層析→超濾濃縮→除菌過濾→分裝。5.7.2模板質粒的線性化T/FDSAXXXX—202X模板質粒的線性化宜遵循《藥品生產質量管理規(guī)范》要求，宜使用一次性設備和耗材，避免外源因子污染和交叉污染。宜采取適當?shù)拇胧┓乐笵Nase等污染，包括環(huán)境、耗材及原料中的DNase消除和殘留檢測。模板質粒的線性化過程宜通過被確認過的工藝參數(shù)，獲得線性化比例符合質量控制要求的線性化DNA。5.7.3線性化質粒的純化線性化質粒的純化宜遵循《藥品生產質量管理規(guī)范》的要求，明確制造工藝各單元操作，同時按照經(jīng)過驗證和批準后的操作規(guī)程的要求進行。純化過程宜建立合理的中間體質量控制程序，監(jiān)測和控制工藝相關雜質，如宿主DNA殘留，宿主蛋白殘留，和宿主RNA殘留。5.7.4線性化質粒的分裝在無菌條件下，使用符合要求的包裝材料對除菌過濾后的樣品進行分裝，分裝精度、規(guī)格、包材宜經(jīng)過確認和驗證。樣品宜儲存在經(jīng)確認和驗證過的合適的儲存條件及環(huán)境下。5.8線性化質粒DNA原液質量控制5.8.1宜建立線性化質粒DNA原液質量控制要求，根據(jù)不同的mRNA-LNP制備工藝及研發(fā)側重點選取相應的質量控制指標。細菌內毒素、外觀、pH、A260/A280純度、宿主細胞蛋白質殘留、宿主細胞DNA殘留量、宿主細胞RNA殘留、序列測定、濃度、RNase殘留按照—1檢測。質粒檢查按照《中國藥典》通則“0541電泳法”檢測。線性比例可參照《中國藥典》通則“0512高效液相色譜法”、“0513離子色譜法”、“0542毛細管電泳法”、“3431質粒DNA構象測定法”進行檢測?？偟鞍讱埩艨蓞⒄铡吨袊幍洹吠▌t“0731蛋白質含量測定法”，或選用熒光法（詳見附錄D）進行檢測。微生物限度按照《中國藥典》通則“1105非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法”檢測。5.8.2質量控制指標匯總見表2。表2線性化質粒原液質量控制指標匯總表T/FDSAXXXX—202XpH）；-量留量--PCR法--定定5.9mRNA合成5.9.1線性mRNA合成mRNA的合成所用原材料遵循《藥品生產質量管理規(guī)范》的要求，根據(jù)物料風險等級建立相適應的控制措施。mRNA生產過程需要進行原料藥制備，再進行制劑的制備，原料藥制備過程中常使用PCR產物或者質粒作為模板，宜制定模板的質量標準。mRNA原料藥和制劑生產過程遵循《藥品生產質量管理規(guī)范》要求，宜保證純度以及無外源因子污染和交叉污染。宜采取適當?shù)拇胧┓乐筊Nase等污染，包括環(huán)境、耗材T/FDSAXXXX—202X及原料中的RNase消除和殘留檢測。研究與優(yōu)化mRNA的關鍵工藝參數(shù)，根據(jù)不同的mRNA-LNP制備工藝選取相應的關鍵工藝參數(shù)，關鍵工藝參數(shù)如下：a）體外轉錄工藝中的反應體系、RNA聚合酶濃度以及活性標準、帽子類似物（共轉錄體系）、NTP濃度、轉錄時間、溫度、Mg2+、補料方式、終止反應條件等；b）DNA酶處理工藝（如有）中的DNA酶濃度、純度酶活性標準、處理時間、溫度、補料方式、終止反應條件等；c）酶法加帽工藝（如有）宜研究RNA反應濃度、加帽反應緩沖體系、加帽酶濃度純RNA酶抑制劑、加帽酶等）、補料方式、反應溫度、反應時間等；d）對加帽類型（如有）及不同加帽類型的比例進行研究，有利于mRNA轉錄的5’UTR和3’UTR的選擇和優(yōu)化；e）加Poly（A）尾工藝（如有）宜研究加尾反應體系、ATP濃度、加尾酶濃度純度活性標準、反應溫度、時間、補料方式等；f）去磷酸化工藝中（如有）的磷酸酶濃度、反應時間、補料方式等；g）如涉及修飾核苷酸，宜明確被修飾的核苷酸、修飾類型、修飾后的純化方法和純度、投料比例等。且在保證不影響mRNA轉染的情況下，對修飾進行優(yōu)化，促進mRNA的穩(wěn)定性；h）mRNA純化（如有）宜研究純化方式、純化條件、純化后mRNA濃度、純度、完整性、雜質殘留等；i）過濾除菌工藝（如有）宜研究過濾后mRNA的生物活性；j）mRNA凍干（如有）宜研究凍干方式、凍干條件、分裝方式、凍干復溶后mRNA濃度質量，如濃度、純度、完整性、溶解性、表達蛋白效力等；5.9.2circRNA合成circRNA合成所用原材料宜遵循《藥品生產質量管理規(guī)范》的要求，根據(jù)物料風險等級建立相適應的控制措施。DNA模板的質量控制應當符合《中國藥典》要求，保證無外源因子污染和交叉污染。宜采取適當?shù)拇胧┓乐筊Nase污染。circRNA制備宜明確circRNA環(huán)化方法，包括以下幾種：將線性RNA的首尾連接成環(huán)。b）酶法連接：常用于RNA環(huán)化的酶有3種，T4DNA連接酶1（T4Dnl1）、T4RNA連接酶1（T4Rnl1）和T4RNA連接酶2（T4Rnl2）。c）PIE系統(tǒng)：常用于RNA環(huán)化PIE系統(tǒng)-Ⅰ型內含子自剪接、PIE系統(tǒng)-Ⅱ型內含子自剪接。宜對circRNA合成的體外轉錄、DNA酶處理、RNA環(huán)化等工藝步驟的關鍵工藝參數(shù)進行研究與優(yōu)化，以提高產率和效率，對關鍵工藝參數(shù)及其控制范圍進行確認。宜研究與優(yōu)化circRNA合成關鍵工藝參數(shù)，根據(jù)不同的mRNA-LNP制備工藝選取相應的關鍵工藝參數(shù)，關鍵工藝參數(shù)如下：a）體外轉錄工藝參數(shù)：RNA聚合酶濃度、NTP濃度、模板濃度、轉錄時間、溫度、Mg2+、終止反應條件等；b）DNA酶處理工藝參數(shù)（如有DNA酶濃度、處理時間、溫度、終止反應條件等；T/FDSAXXXX—202Xc）RNA環(huán)化工藝參數(shù)（如有）：IVT產物濃度、溫度、反應時間、GTP濃度、Mg2+濃度、連接酶濃度等；d）如涉及修飾核苷酸，宜明確被修飾的核苷酸、修飾類型、修飾后的純化方法和純度、投料比例等。5.10mRNA合成質量控制5.10.1線性mRNA合成質量控制宜建立mRNA合成質量控制要求，根據(jù)不同的mRNA-LNP制備工藝及研發(fā)側重點選取相應的質量控制指標。.1外觀、pH、細菌內毒素、無菌按照—檢測。.2總蛋白殘留可參照《中國藥典》通則“0731蛋白質含量測定法”，或選用熒光法（詳見附錄D）進行檢測。.3mRNA序列長度可參照《中國藥典》通則“0541電泳法”、“0542毛細管電泳法”進行檢測。.4mRNA純度可參照《中國藥典》通則“0542毛細管電泳法”、“0401紫外-可見分光光度法”進行檢測。.5DNA模板殘留量按照《中國藥典》通則“3407外源性DNA殘留量測定法”檢測。.6mRNA含量可參照《中國藥典》通則“0401紫外-可見分光光度法”，或選用《美國藥典》“mRNA疫苗質量分析方法-指南草案”RiboGreen熒光檢測法（詳見附錄E或選用“熒光PCR法”、“ddPCR法”進行檢測。.7dsRNA殘留量可參照《中國藥典》通則“3429免疫化學法”，或選用《美國藥典》“mRNA疫苗質量分析方法-指南草案”ELISA法（詳見附錄B）進行檢測。.8金屬元素殘留量按照《中國藥典》通則“0412電感耦合等離子體質譜法”檢測。.9DNase殘留熒光探針法，詳見附錄C。.10游離單核苷酸（NTPs）殘留量可參照《中國藥典》通則“0512高效液相色譜法”、“0431質譜法”進行檢測。T/FDSAXXXX—202X.11酶殘留量按照《中國藥典》通則“3429免疫化學法”檢測。.12序列完整性及準確性（特別是關鍵元件）可參照《中國藥典》指導原則“9109標準核酸序列建立指導原則”，或選用mRNAseq法進行檢測。.13有機溶劑殘留量按照《中國藥典》通則“3200化學殘留物測定法”檢測。.14帽子類似物殘留量按照《中國藥典》通則“0512高效液相色譜法”檢測。.15加帽率可參照《中國藥典》通則“0542毛細管電泳法”、“0431質譜法”、“0512高效液相色譜法”進行檢測。.16ploy（A）尾長度可參照《中國藥典》通則“0431質譜法”、“0512高效液相色譜法”、“0542毛細管電泳法”進行檢測。.17表達成蛋白的能力使用基于細胞的轉染實驗檢測。.18不完整mRNA按照《中國藥典》通則“0542毛細管電泳法”檢測。.19mRNA聚集體按照《中國藥典》通則“0541電泳法”初步判斷，“0512高效液相色譜法”、“0514分子排阻色譜法”進行檢測。.20生物負載量按照《中國藥典》通則“1105非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法”檢測。質量控制指標匯總見表3。表3mRNA合成質量控制指標匯總表pH0901）、澄清度檢查法（通則0902）、可見異物檢查法（通則0904）T/FDSAXXXX—202X）；性高效液相色譜法（通則0512））；>30%）；＜0.1/%---T/FDSAXXXX—202X量5.10.2circRNA合成質量控制宜建立circRNA合成產物質量控制要求，根據(jù)不同的mRNA-LNP制備工藝及研發(fā)側重點根據(jù)不同的mRNA-LNP制備工藝選取相應的質量控制指標。.1外觀、pH、細菌內毒素、無菌按照—檢測。.2circRNA序列長度、circRNA純度、總蛋白殘留、DNA模板殘留量、circRNA含量、dsRNA殘留量、金屬元素殘留量、DNase殘留、游離單核苷酸（NTPs）殘留量、酶殘留、序列完整性及準確性、有機溶劑殘留量按照.2—.13檢測。.3preRNA可參照《中國藥典》通則“0542毛細管電泳法”檢測，或使用RT-PCR和特異性引物檢測preRNA的存在，以評估轉錄過程中的效率和精確性。.4內含子片段可參照《中國藥典》通則“0542毛細管電泳法”檢測，或采用特異性PCR和電泳技術檢測是否有未正確剪接的內含子片段，以確保RNA的成熟和功能性。.5nickedRNA可參照《中國藥典》通則“0542毛細管電泳法”檢測，或采用靈敏的電泳分析，識別和定量可能存在的nickedRNA，以評估RNA合成過程中的完整性。.6RNaseR耐受性可參照《中國藥典》通則“0541電泳法”檢測，或處理樣品后用RNaseR酶處理，通過RT-PCR和電泳確認circRNA的耐酶性，以驗證其環(huán)狀結構的完整性和穩(wěn)定性。.7環(huán)化比例可參照《中國藥典》通則“0542毛細管電泳法”，或選用qPCR法進行檢測，或通過RT-PCR結合特異性引物，定量環(huán)化和非環(huán)化RNA的比例，確保產品的一致性。T/FDSAXXXX—202X.8環(huán)化位點可參照《中國藥典》指導原則“9109標準核酸序列建立指導原則”檢測?；蚰孓D錄反應后，按照Sanger法檢測?；虿捎肦T-PCR結合測序技術定位circRNA的環(huán)化位點，確保環(huán)化的特異性和準確性。質量控制指標匯總見表4。表4circRNA體外合成質量控制指標匯總表pH可見異物檢查法（通則0904）性）；）；）；）；法preRNA）；）；）；）；-T/FDSAXXXX—202X---定定5.11mRNA純化5.11.1線性mRNA純化mRNA純化所用物料宜優(yōu)先采用風險級別較低的物料，根據(jù)物料風險等級建立相適應的控制措施。mRNA純化生產過程宜遵循《藥品生產質量管理規(guī)范》要求，保證無外源因子污染和交叉污染。宜采取適當?shù)拇胧┓乐筊Nase污染，包括環(huán)境、耗材及原料中的RNase消除和殘留檢測。mRNA的純化工藝單元的設定需要考慮后續(xù)生產規(guī)模放大的可行性，宜采用可放大的超濾和層析操作單元。宜對mRNA純化工藝參數(shù)（如層析介質的選擇、載量、上樣和洗脫溶液條件、超濾膜截留分子量、流速和跨膜壓等）進行研究和優(yōu)化，開發(fā)穩(wěn)定的純化工藝。宜對mRNA純化工藝建立相應的過程控制程序，包括純化產物檢測，如mRNA濃度、mRNA完整性、Poly（A）完整性、產品及工藝相關雜質去除率等，確保mRNA的純度和結構完整性。宜明確mRNA純化工藝中各單元操作的目的，進行工藝相關雜質清除研究。純化后mRNA原液的保存溶液和分裝規(guī)格應與后續(xù)的LNP制備過程相適應。并開展儲存穩(wěn)定性研究，制定合理的儲存時長和儲存條件。mRNA原液的標簽需標明mRNA名稱、貯存條件、批號、規(guī)格、生產日期等信5.11.2circRNA純化circRNA純化所用原材料宜遵循《中國藥典》“生物制品生產用原材料及輔料質T/FDSAXXXX—202X量控制規(guī)程”要求，并根據(jù)物料風險等級建立相適應的控制措施。circRNA純化生產過程宜遵循標準的實驗操作規(guī)程和安全規(guī)范，確?？芍貜托院桶踩裕ＷC無外源因子污染和交叉污染。宜采取適當?shù)拇胧┓乐筊Nase污染，包括環(huán)境、耗材及原料中的RNase消除和殘留檢測。circRNA純化工藝單元的設定需考慮后續(xù)生產規(guī)模放大的可行性，宜采用可放大的超濾和層析操作單元。宜明確circRNA純化工藝中各純化步驟的目的，并研究各純化步驟的雜質去除如采用T4連接酶法制備circRNA，所制的circRNA與前體片段大小相同，宜詳細說明其純度的評估方式。若采用RNaseR消除前體，宜評估RNaseR對環(huán)的結構或完整性的影響。宜對circRNA純化工藝參數(shù)（如層析介質的選擇依據(jù)、載量、雜質去除率、上樣和洗脫溶液條件、超濾膜截留分子量、流速和跨膜壓、R酶消化等）進行研究和優(yōu)化，開發(fā)穩(wěn)定的純化工藝。宜對circRNA純化工藝建立相應的過程控制程序，包括純化產物檢測，如RNA濃度、RNA完整性、環(huán)化接口驗證、circRNA純度、R酶消化、產品及工藝相關雜質去除率等，確保circRNA的純度和結構完整性。circRNA原液成品的溶劑宜與LNP包封過程中的溶劑相同。0宜對circRNA原液開展穩(wěn)定性研究，以確定合理的儲存條件和時長。1circRNA原液的標簽需標明circRNA名稱、貯存條件、批號、規(guī)格、生產日期等信息。5.12mRNA原液質量控制5.12.1線性mRNA原液質量控制宜建立mRNA原液質量控制要求，根據(jù)不同的mRNA-LNP制備工藝及研發(fā)側重點選取相應的質量控制指標。.1外觀、pH、細菌內毒素、無菌按照—檢測。.2mRNA純度、DNA模板殘留量、mRNA含量、dsRNA殘留量按照.4—.7檢測。.3帽子類似物殘留量、加帽率、poly（A）尾長度、目的蛋白表達按照.13—.16檢測。.4mRNA測序可參照《中國藥典》指導原則“9109標準核酸序列建立指導原則”，或選用sanger法、高通量測序技術進行檢測。.5mRNA鑒別按照《中國藥典》通則“0541電泳法”檢測。.6A260/A230純度T/FDSAXXXX—202X按照《中國藥典》通則“0401紫外-可見分光光度法”檢測。.7NTP殘留（A、G、C、U）按照《中國藥典》通則“0512高效液相色譜法”檢測。.8總蛋白殘留可參照《中國藥典》通則“0731蛋白質含量測定法”，或選用熒光法（詳見附錄D）進行檢測。.9mRNA完整性可參照《中國藥典》通則“0542毛細管電泳法”，或選用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。.10工具酶殘留如T7RNA聚合酶按照《中國藥典》通則“3429免疫化學法”檢測。質量控制指標匯總見表5。表5mRNA原液質量控制指標匯總表）；ddPCR法-《中國藥典》第三毛細管電泳法（通則0542）《中國藥典》四部毛細管電泳法（通則0542）-《中國藥典》四部高效液相色譜法（通則0512）-《中國藥典》四部毛細管電泳法（通則0542）-法-《中國藥典》三部高效液相色譜法（通則0512）T/FDSAXXXX—202X《中國藥典》三部高效液相色譜法（通則0512）pH《中國藥典》四部毛細管電泳法（通則0542）-《中國藥典》四部高效液相色譜法（通則0512）-5.12.2circRNA原液質量控制宜建立circRNA原液質量控制要求，根據(jù)不同的mRNA-LNP制備工藝及研發(fā)側重點選取相應的質量控制指標。.1外觀、PH、細菌內毒素、無菌按照—檢測。.2circRNA純度、DNA模板殘留量、circRNA含量、dsRNA殘留量按照.4—.7檢測。.3preRNA、內含子片段、nickedRNA按照3.3—3.5檢測。.4總蛋白殘留、工具酶殘留如T7RNA聚合酶、序列完整性按照8—.0檢測。.5circRNA序列長度按照《中國藥典》通則“0541電泳法”檢測。.6環(huán)化接口逆轉錄反應后，按照Sanger法檢測。.7環(huán)化效率T/FDSAXXXX—202X按照《中國藥典》通則“0542毛細管電泳法”檢測。.8磁珠（如適用）可參照原子吸收光譜法（AAS）或感應耦合等離子體質譜法（ICP-MS）進行檢測。.9有機溶劑按照《中國藥典》通則“3200化學殘留物測定法”檢測。.10circRNA體外翻譯活性使用基于細胞的轉染實驗。.11RaseR耐受性酶按照《中國藥典》通則“0401紫外-可見分光光度法”檢測。質量控制指標匯總見表6。表6circRNA原液質量控制指標匯總表pH可見異物檢查法（通則0904））；--）；法-preRNA）；-）；）；）；-T/FDSAXXXX—202X--定定5.13脂質納米顆粒Mix配方與mRNA包封/裝載及純化5.13.1脂質納米顆粒Mix配方脂質納米顆粒原材料脂質納米顆粒原材料的質量可能會對終產品RNA（包含mRNA、circRNA、saRNA）-LNP的粒徑與PDI、電荷、包封率、制備及純化工藝、免疫原性及活性產生重要的影響，宜對脂質原材料進行充分的篩選和質量控制。宜保留LNP各個脂質原材料的選擇依據(jù)、來源（動物源、植物源；全合成、半合成等）、生產用原材料、生產純化工藝、特征鑒定、穩(wěn)定性及雜質等研究資料。雜質研究可考慮在合成或者生產過程中引入的有機溶劑或者重金屬殘留。多組分及（或）佐劑LNP通常由4個組分組成：可電離脂質、輔助脂質（磷脂）、膽固醇和聚乙二醇化脂質（PEG脂質）；目前國內外部分前沿研究中已經(jīng)出現(xiàn)5組分LNP及（或）佐劑的添加。對于多出的組分或佐劑，宜重點說明添加的原理，確保不會影響脂質納米顆粒關鍵質量指標，宜保留多出組分或佐劑的安全性數(shù)據(jù)、提高產品藥效性能或穩(wěn)定性的數(shù)據(jù)等。同時，鑒于mRNA遞送系統(tǒng)的復雜性及可能存在的佐劑作用、國內外在研mRNA遞送平臺的實際情況，宜參照CDE《新型冠狀病毒預防用mRNA疫苗藥學研究技術指導原則（試行）》指導要求，不建議添加單獨的佐劑成分。如需添加佐劑，應保證添加的佐劑不會引起不可接受的毒性。臨床前須通過明確的功能指標及試驗研究證實佐劑發(fā)揮的具體的免疫調節(jié)作用，同時關注添加該佐劑成分后可能引入的風險，如，對mRNA結構、非預期免疫反應及免疫損傷和免疫病理等，對佐劑添加進行全面的藥學研究。T/FDSAXXXX—202X新型原材料的首次使用遵循國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心《新藥用輔料非臨床安全性評價指導原則》，對新型脂質材料的作用機制、合成純化工藝、質量控制、供應商信息、生產批次、安全性、功效性等進行充分研究及闡述。原材料的變更不同生產純化工藝、不同供應商提供的脂質材料，可能會在純度、雜質或其他關鍵質量參數(shù)方面有差異。如脂質材料的合成或生產工藝、純化工藝、供應商等發(fā)生變更，宜當對變更后的新材料進行詳盡的質量特性研究，確保變更不會對下游工藝及成品產生負面影響。5.13.2RNA包封/裝載及純化RNA的包封/裝載主要是基于微流控或類似技術，將脂質混合物的乙醇溶液RNA酸性溶液快速通過微流控混合器來達到包封的目的。RNA-LNP的純化、換液、濃縮主要采用切向流過濾，以除去游離的脂質分子，RNA，乙醇等。不同的包封及純化工藝、緩沖液體系及其它輔助添加劑可能會對RNA-LNP的關鍵質量指標、功效性、免疫原性、穩(wěn)定性產生重要影響。宜提交相關資料，說明包封/裝載及純化工藝步驟的合理性以及工藝參數(shù)控制范圍的合理性?？刹捎妹荛]式的生產工藝，以減少生產過程中的暴露環(huán)節(jié)和儲存環(huán)節(jié)。生產過程中中間產物如需儲存，宜開展穩(wěn)定性研究和相關驗證研究，明確儲存條件、儲存方式a）包封設備及耗材如采用微流控包封設備來制備RNA-LNP，宜說明包封設備的混合原理、包封設備接觸原液的管路的材料種類和性質。LNP包封過程中，通常是在乙醇和酸性緩沖液共存的條件下混合制備，如果包封設備的管路表面為非生物兼容性材料，宜關注包封設備管路表面是否被腐蝕破壞，制備產品是否被污染。微流控芯片推薦使用GMP/FDA認可的衛(wèi)生級金屬材質，如316L。對于使用塑料材料為微流控芯片的LNP包封生產工藝，應當按照國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心發(fā)布的《化學藥品注射劑生產所用的塑料組件系統(tǒng)相容性研究技術指南（試行）》相關要求，基于風險評估及必要的相容性研究，確認上述塑料芯片組件系統(tǒng)的適用性。對于微流控芯片的質量，應當建立合理的測試方案和指標，確認不同批次微流控芯片間的質量穩(wěn)定性，以及重復使用芯片每次生產時的芯片質量一致性。生產過程中設備應對此相關指標進行連鎖監(jiān)控，以確保設備在良好的狀態(tài)下穩(wěn)定生產。微流控包封設備的輸送泵、芯片、閥門、管道管件等部件應當可以進行CIP，以確保所有接觸物料的部分均符合LNP生產的GMP要求。微流控包封設備的所有部件（包括芯片）應當能夠滿足高流速制備工藝產生的系統(tǒng)壓力（如≥10MPa的壓力），不宜因承壓不足而限制單個芯片或單組包封系統(tǒng)的混合流速（生產效率）。生產過程中使用的耗材和容器，如一次性儲液袋、移液管路、膜包等，宜具有穩(wěn)定的物理和化學特性，耗材與直接接觸的溶液、生產中間產物等宜有良好的相容性，需結合耗材的材質、使用階段、供應商提供的研究資料等對其評估或研究。b）包封/裝載工藝參數(shù)包封過程中，關鍵工藝參數(shù)包括：各個脂質原材料的摩爾比例、濃度，RNA的濃度，脂質與RNA的投料比例（或氮磷比），緩沖液的鹽離子種類、濃度及pH值的；包封混合過程中的流速、混合壓力、包封前后廢液體積等。采用抗體偶聯(lián)的LNP，宜考慮制劑過程中的參數(shù)與物質對抗體活性的影響。T/FDSAXXXX—202Xc）純化工藝參數(shù)純化過程中，關鍵工藝參數(shù)包括：純化替換緩沖液的鹽離子種類、濃度、pH、跨膜壓、流速、中空纖維柱截留分子量、剪切力、除菌過濾等。5.14納米顆粒質量控制脂質納米顆粒相關的性能指標包括粒徑及分布、電荷、載藥濃度與包封率等，建議結合納米顆粒的制備工藝以及對下游工序與成品的影響程度，對粒徑及分布、Zeta電位、RNA濃度及包封率、各個脂質組分的含量、溶劑殘留等進行分析研究，并考慮是否作為生產過程控制的一部分或中間產物建立質量控制標準。在選擇質量控制方法時，應關注擬表征的質量屬性與擬采用的檢測方法之間的契合度，保證方法的適用性。5.15mRNA-LNP制劑處方以及工藝5.15.1制備工藝整體需求制備工藝需要在符合潔凈要求的生產車間進行。宜明確mRNA-LNP制造工藝各單元操作要求，按照經(jīng)過驗證和批準后的操作規(guī)程的要求進行，并有相關記錄。工藝設備符合計量、確認、驗證等要求。避免出現(xiàn)偏離工藝規(guī)程的偏差，如果出現(xiàn)偏差，宜采取必要措施進行糾正。生產前后宜進行清場和設備的清潔，避免產品間的交叉污染。制備工藝：a）液體制劑：IVT-mRNA原液→mRNA-LNP脂質包封→超濾濃縮/換液→除菌過濾→DP制劑灌裝；b）凍干制劑：IVT-mRNA原液→mRNA-LNP脂質包封→超濾濃縮/換液→除菌過濾→制劑灌裝→凍干→軋蓋。5.15.2mRNA-LNP脂質包封明確脂質組分配比，同時做好各LNP脂質的質量控制工作。包封過程中使用的混合芯片及管路宜使用一次性消耗品，包封設備在使用前后要進行清潔和檢測。5.15.3mRNA-LNP純化mRNA-LNP的純化宜去除包封工藝過程中產生的雜質乙醇，將其殘留控制在合理的范圍之內。mRNA-LNP的純化過程宜建立合理的中間體質量控制程序，檢測和控制LNP的粒徑、包封率、mRNA的質量參數(shù)等。5.15.4mRNA-LNP制劑成品分裝mRNA-LNP制劑成品在無菌條件下進行分裝，分裝精度、規(guī)格、包材宜經(jīng)過確認和驗證。制劑成品分裝宜建立批號管理程序。每批制劑批號唯一，并建立出入庫登記制度。制劑成品宜儲存在經(jīng)驗證和確認過的合適的儲存條件及環(huán)境下。5.15.5circRNA-LNP成品分裝成品制劑需按照《藥品包裝材料與藥物相容性試驗指導原則》《國家藥包材標準》原則T/FDSAXXXX—202X開展包材相容性研究。5.15.6mRNA/cirRNA制劑凍干工藝mRNA/cirRNA制劑在無菌條件下進行灌裝，以半壓塞的形式轉移至凍干機的凍干倉，用已驗證過的凍干工藝對樣本實施凍干處理，其中含水率宜≤3.0%。凍干制劑儲存于經(jīng)驗證和確認的儲存條件和環(huán)境下，儲存溫度宜控制在2℃至8℃。5.15.7mRNA-LNP中間品質量控制宜建立mRNA-LNP中間品質量控制要求，根據(jù)不同的mRNA-LNP制備工藝及研發(fā)側重點選取相應的質量控制指標。.1外觀可參照《中國藥典》通則“0901溶液顏色檢查法”、“0902澄清度檢查法”、“0904可見異物檢查法”進行檢測。.2微生物限度按照《中國藥典》通則“1105非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法”檢測。.3mRNA含量可參照《中國藥典》通則“0401紫外-可見分光光度法”，或選用《美國藥典》“mRNA疫苗質量分析方法-指南草案”RiboGreen熒光檢測法（詳見附錄E或選用“熒光PCR法”、“ddPCR法”進行檢測。.4包封率可參照《中國藥典》指導原則“9014微粒制劑指導原則”，或選用《美國藥典》“mRNA疫苗質量分析方法-指南草案”RiboGreen熒光檢測法（詳見附錄E）進行檢測。.5粒徑、PDI可參照《納米藥物質量控制研究技術指導原則（試行）》選取采用動態(tài)光散射法（DLS）（詳見附錄F），或采用顯微成像技術[如透射電鏡（TEM）、掃描電鏡（SEM）和原子力顯微鏡（AFM）]、納米顆粒跟蹤分析系統(tǒng)（NTA）、小角X射線散射（SAXS）和小角中子散射（SANS）等也可提供納米藥物粒徑大小的信息。其中，SAXS對納米顆粒粒徑的表征方法可參考國際標準化協(xié)會發(fā)布的ISO17867“ParticlesizeanalysisSmallangleX-rayScattering（SAXS）”。.6Zeta電位可參照《納米藥物質量控制研究技術指導原則（試行）》選取采用相分析動態(tài)光散射法（PALS）（詳見附錄F），電泳光散射法（ELS）或可調電阻脈沖感應技術（TRPS）等。質量控制指標匯總見表7。表7mRNA-LNP中間品質量控制指標匯總表T/FDSAXXXX—202X可見異物檢查法（通則0904）動態(tài)光散射法、小角X射線散射標）；）；5.16mRNA-LNP成品質量控制5.16.1mRNA-LNP成品質量控制宜建立mRNA-LNP成品質量控制要求，根據(jù)不同的mRNA-LNP制備工藝及研發(fā)側重點選取相應的質量控制指標。.1外觀、pH、細菌內毒素、無菌按照—檢測。.2粒徑、PDI、Zeta電位按照.5—.6檢測。.3平均粒徑可參考《納米藥物質量控制研究技術指導原則（試行）》選取采用動態(tài)光散射法（DLS按照GB/T29022粒度分析動態(tài)光散射法獲得平均流體動力學粒徑?；騾⒖紘H標準化協(xié)會發(fā)布的ISO17867“ParticlesizeanalysisSmallangleX-rayScattering（SAXS）”。.4mRNA序列可參照《中國藥典》指導原則“9108DNA測序技術指導原則”，或選用sanger法進行檢測。.5mRNA含量可參照《中國藥典》通則“0401紫外-可見分光光度法”，或選用《美國藥典》“mRNA疫苗質量分析方法-指南草案”RiboGreen熒光檢測法（詳見附錄E或選用“熒光PCR法”、“ddPCR法”進行檢測。.6包封率可參照《中國藥典》指導原則“9014微粒制劑指導原則”，或選用《美國藥典》“mRNA疫苗質量分析方法-指南草案”RiboGreen熒光檢測法（詳見附錄E）進行檢測。.7dsRNA殘留量T/FDSAXXXX—202X可參照《中國藥典》通則“3429免疫化學法”，或選用《美國藥典》“mRNA疫苗質量分析方法-指南草案”ELSA法（詳見附錄C）進行檢測。.8加帽率可參照《中國藥典》通則“0542毛細管電泳法”、“0431質譜法”檢測、“0512高效液相色譜法”進行檢測。.9可見異物按照《中國藥典》通則“0904可見異物檢查法”檢測。.10不溶性微粒按照《中國藥典》通則“0903不溶性微粒檢查法”檢測。.11裝量/裝量差異按照《中國藥典》通則“0102注射劑”、“0942最低裝量檢查法”檢測。.12水分（劑型：凍干粉）按照《中國藥典》通則“0832水分測定法-費休氏法”檢測。.13滲透壓摩爾濃度按照《中國藥典》通則“0632滲透壓摩爾濃度測定法”檢測。.14遞送系統(tǒng)組分含量可參照《中國藥典》通則“0512高效液相色譜法”，或參考《美國藥典》“mRNA疫苗質量分析方法-指南草案”使用HPLC-CAD法進行檢測。.15截短序列RNA按照《中國藥典》通則“0542毛細管電泳法”檢測。.16加帽不完全的mRNA可參照《中國藥典》通則“0542毛細管電泳法”、“0431質譜法”進行檢測。.17去磷酸不完全的mRNA按照《中國藥典》通則“0512高效液相色譜法”檢測。.18修飾過度的mRNA按照《中國藥典》通則“0512高效液相色譜法”檢測。.19乙醇殘留按照《中國藥典》通則“0521氣相色譜法”檢測。.20異常毒性按照《中國藥典》通則“1141異常毒性檢查法”檢測。.21蛋白翻譯功能T/FDSAXXXX—202X可參照ELISA、FACS、WesternBlot進行檢測。質量控制指標匯總見表8。表8mRNA-LNP成品質量控制指標匯總表法動態(tài)光散射法、小角X射線散射動態(tài)光散射法、小角X射線散射pH《中國藥典》三部溶液顏色檢查法（通則0901）、澄清度檢查法（通則0902）、可見異物檢查法（通度《中國藥典》四部可見異物檢查法（通則0904）《中國藥典》四部不溶性微粒檢查法（通則0903）《中國藥典》四部注射劑（通則0102）-《中國藥典》三部最低裝量檢查法（通則0942）-）；《中國藥典》三部毛細管電泳法（通則0542）列法《中國藥典》三部高效液相色譜法（通則0512）、T/FDSAXXXX—202X《中國藥典》四部毛細管電泳法（通則0542）《中國藥典》四部質譜法（通則0431）-《中國藥典》四部高效液相色譜法（通則0512）-《中國藥典》三部高效液相色譜法（通則0512）《中國藥典》三部高效液相色譜法（通則0512）《中國藥典》四部氣相色譜法（通則0521）5.16.2circRNA-LNP成品質量控制宜建立circRNA-LNP成品質量控制要求，根據(jù)不同的mRNA-LNP制備工藝及研發(fā)側重點選取相應的質量控制指標。.1外觀、pH、細菌內毒素、無菌按照—檢測。.2粒徑、PDI、Zeta電位按照.5—.6檢測。.3微生物限度按照《中國藥典》通則“1105非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法”檢測。.4滲透壓按照《中國藥典》通則“0632滲透壓摩爾濃度測定法”檢測。.5RNA序列可參照《中國藥典》指導原則“9108DNA測序技術指導原則”，或選用sanger法進行檢測。.6mRNA含量可參照《中國藥典》通則“0401紫外-可見分光光度法”，或選用《美國藥典》“mRNA疫苗質量分析方法-指南草案”RiboGreen熒光檢測法（詳見附錄E或選用“熒光PCR法”、“ddPCR法”進行檢測。.7包封率可參照《中國藥典》指導原則“9014微粒制劑指導原則”，或選用《美國藥典》“mRNA疫苗質量分析方法-指南草案”RiboGreen熒光檢測法（詳見附錄E）進行檢測。.8靶蛋白的表達T/FDSAXXXX—202X可參照《中國藥典》通則“3401免疫印跡法”，或參考《美國藥典》“mRNA疫苗質量分析方法-指南草案”采用基于細胞的實驗，或選用流式細胞法、PCR法進行檢測。.9各個脂質組分的含量可參照《中國藥典》通則“0512高效液相色譜法”，或參考《美國藥典》“mRNA疫苗質量分析方法-指南草案”使用HPLC-CAD法進行檢測。.10RNA濃度按照《中國藥典》通則“0401紫外-可見分光光度法”檢測。.11體內效力動物實驗。質量控制指標匯總見表9。表9circRNA-LNP成品質量控制指標匯總表）；量）；ddPCR法）；動態(tài)光散射法、小角X射線散射pH性流式細胞法、PCR法-T/FDSAXXXX—202X6工程化免疫細胞制備及質量控制6.1供者細胞的獲取、收集與運輸6.1.1應選擇依法取得《醫(yī)療機構執(zhí)業(yè)許可證》資質的醫(yī)療機構進行采集。開展細胞采集人員需有相應經(jīng)驗并獲得《醫(yī)師執(zhí)業(yè)許可證》等資質。6.1.2細胞來源宜符合《中華人民共和國人類遺傳資源管理條例》的要求，且經(jīng)過醫(yī)療機構倫理委員會批準，并建立“知情與保密”管理體系。6.1.3宜根據(jù)產品特點建立供者篩選標準，如供者的基本信息，包括但不限于年齡、性別、既往已知的用藥情況和輻射暴露、既往病史、家族史、病原微生物篩查信息、HLA分型信息、血型、血常規(guī)檢測等。6.1.4病原微生物的篩查宜包括以下幾項：人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒螺旋體等感染、人巨細胞病毒、人EB病毒、人類嗜T淋巴細胞病毒。6.1.5實施采集操作的環(huán)境宜能保證采集細胞的微生物安全性，避免交叉污染或混淆風險。宜優(yōu)先使用基于一次性耗材的全自動細胞采集機進行單采血。6.1.6傳染性病毒陽性患者的細胞采集應該在陽性樣本制備區(qū)進行。6.1.7宜對采集的細胞確定適宜的保存條件、運輸方式和時間，制定相應操作規(guī)范。6.1.8應當建立產品標識和追溯系統(tǒng)，確保在供者材料運輸、接收以及產品生產和使用全過程中，來源于不同供者的產品不會發(fā)生混淆、差錯，確保供者材料或細胞與患者之間的匹配性，且可以追溯。6.2供者細胞收集質量控制6.2.1免疫細胞治療指人自體或異體來源的免疫細胞經(jīng)體外操作后回輸人體，用于疾病預防或治療的臨床研究和臨床應用。宜建立供者細胞收集質量控制要求。外觀細胞懸液清晰透明，細胞分布均勻，無明顯的細胞團聚現(xiàn)象。包裝完整性包裝應當完整無損壞。細胞的數(shù)量及活率熒光計數(shù)法，詳見附錄G。細胞類型及表型流式細胞法，詳見附錄H。無菌可參照《中國藥典》通則“1101無菌檢查法”，或選用快速無菌檢查法如ATP生物發(fā)光T/FDSAXXXX—202X法、固相細胞計數(shù)、呼吸作用進行檢測。支原體可參照《中國藥典》通則“3301支原體檢查法”，或《美國藥典》<63>使用經(jīng)驗證的NAT法（詳見附錄I）或酶學方法作為補充。基因組內整合型病毒（如HHV特定亞型等）按照《中國藥典》通則“3302外源病毒因子檢查法”檢測。6.2.2質量控制指標匯總見表10。表10供者細胞收集質量控制指標匯總表>80%）；）；6.2.3供者細胞收集后處理：a）宜對質量控制后合格的細胞進行凍存或其他后續(xù)處理。b）對于質量控制不合格的細胞，應當重新取樣。6.3T/NK細胞分選與激活6.3.1T/NK細胞分選與激活宜遵循《免疫細胞治療產品藥學研究與評價技術指導原則（試行）》。分選和激活采用的磁珠、包被抗體、磁珠抗體、細胞因子要有明確的來源及批號、要有質量檢定合格報告和無TSE/BSE聲明。6.3.2免疫細胞培養(yǎng)及生產過程宜全程避免使用動物源性材料，盡可能用規(guī)定組成成分的非動物源性試劑替代。a）若必須使用動物來源原材料，需要提供相關的研究資料說明使用的必要性和合理性，并針對原材料的物種來源、生產地區(qū)、生產工藝建立完整的質量控制體系，評估TSE/BSE安全性風險，并對終產品中的動物源材料殘留量進行檢測及開展安全性風險評估。不使用疫病流行區(qū)來源的動物血清及未經(jīng)過安全性驗證的血清非常重要。b）若生產過程使用自體血清或自體血漿，宜說明血清/血漿的生產工藝，并對包裝、存放條件和時間等進行研究。c）若使用同種異體血清，其使用的原則與安全性風險控制要求參考6.3.2a動物來源原材料的要求，使用中重點關注人源外源因子的風險監(jiān)控和不同來源、不同批次血清質量差異可能對產品生產過程產生的影響。T/FDSAXXXX—202Xd）人源性材料（如白蛋白、免疫球蛋白等）可以參考血液制品的質量要求和檢測方法。6.3.3宜根據(jù)工藝要求，對單采血進行分離PBMC，然后再進一步確定是否分選特定T/NK細胞，也可以直接對單采血進行特定T/NK細胞的分選。宜監(jiān)測分選后的特定T/NK細胞的比例，并建立控制標準。6.3.4轉染前宜對T/NK細胞進行激活。激活后宜監(jiān)測活細胞數(shù)、細胞活率、細胞直徑和活化標志物。6.3.5若使用滋養(yǎng)細胞擴增NK的方式，宜對滋養(yǎng)細胞進行殘留研究，并對采用滋養(yǎng)細胞所產NK細胞進行體外成瘤性、體內成瘤性和致瘤性等安全性評價實驗。若使用動物源性滋養(yǎng)層細胞，需進行滋養(yǎng)層細胞相關特定動物源性病毒的全面檢測。6.4mRNA-LNP轉染T/NK細胞及CAR-T/NK細胞擴增6.4.1mRNA-LNP轉染T/NK細胞操作宜遵循《藥品生產質量管理規(guī)范》《免疫細胞治療產品藥學研究與評價技術指導原則（試行）》的基本原則和相關要求，宜特別關注：mRNA-LNP轉染T/NK等免疫細胞的方法和條件、細胞生長特性的變化、細胞的表型和/或基因型的變化、細胞功能的變化、目的細胞群和非目的細胞群的比例變化等進行研究和驗證，并不斷優(yōu)化。6.4.2在采用mRNA-LNP轉染T/NK等免疫細胞時，宜根據(jù)mRNA-LNP成品包封率檢測結果中mRNA濃度(μg/mL），進行不同梯度的mRNA轉染量摸索，同步研究mRNA-LNP轉染前后T/NK等目的細胞群的活率、純度、密度及其擴增倍數(shù)等影響因素，對mRNA-LNP轉染量的選擇及合理性、目的基因的表達/轉染效率等進行研究和驗證，并持續(xù)優(yōu)化。6.4.3不同細胞培養(yǎng)平臺之間的差異可能是多種因素共同作用的結果，包括物理條件、氧氣水平、代謝狀態(tài)、細胞因子使用和刺激條件、自動化程度，以及細胞產品的數(shù)量和質量。這些因素共同決定了最終CAR-T/NK細胞產品的表型、功能和臨床應用潛力。因此CAR-T/NK細胞擴增過程中，宜對CAR-T/NK細胞密度、增殖能力、目的基因的表達時長、培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)基補料等條件進行研究和驗證，為下一步CAR-T/NK細胞收獲工序提供生產決策依據(jù)。6.5CAR-T/NK細胞半成品或中間細胞產物的質量控制建議采用中間樣品質量檢驗