(高清版)GBT 40174-2021 工具酶純度的檢測(cè)方法

ICS07.080國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)IGB/T40174—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由全國(guó)工具酶標(biāo)準(zhǔn)化工作組(SAC/SWG11)提出并歸口。本文件起草單位：福建南生科技有限公司、夏禾(深圳)生物技術(shù)有限公司、蘇州坤琪生物科技有限公司、上海鷹姿生命科技有限公司、雷谷(廈門)生物醫(yī)藥有限公司、福建華燦制藥有限公司、廈門大學(xué)、因科技有限公司。GB/T40174—2021工具酶純度的檢測(cè)方法1范圍本文件適用于工具酶純度的檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法YY/T0087電泳裝置3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。工具酶純度purityofreagentenzymes目標(biāo)工具酶在樣品總蛋白質(zhì)或固含物中所占的質(zhì)量百分比。樣品經(jīng)福林酚法測(cè)定出每毫克或每毫升樣品中的蛋白質(zhì)所占的質(zhì)量。樣品烘干后獲得的無(wú)水固體物質(zhì)在每毫克或每毫升樣品中所占的質(zhì)量。4原理用牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照，對(duì)樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳后的膠帶進(jìn)行掃面，再進(jìn)行灰度值計(jì)算，獲得樣品中目標(biāo)工具酶的質(zhì)量，再采用福林酚法測(cè)定樣品總蛋白質(zhì)的質(zhì)量或用熾灼殘?jiān)鼨z查法測(cè)定樣品固含物含量，從而計(jì)算出工具酶純度。5試劑或材料除非另有規(guī)定，所用的試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的二級(jí)水。5.1堿性銅溶液稱取氫氧化鈉10g,碳酸鈉50g,加水400mL使溶解，作為甲液；取酒石酸鉀0.5g,加水50mL使—2GB/T40174—2021稱取鎢酸鈉100g、鉬酸鈉25g,加水700mL、85%磷酸50mL與鹽酸100mL,置磨口圓底燒瓶5.430%丙烯酰胺溶液-0.8%N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺(Acr-Bis)溶液瓶，宜4℃避光保存。5.50.5mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCI)緩沖液稱取三羥甲基氨基甲烷6.05g,加適量水使溶解，用鹽酸調(diào)pH值至6.8,加水定容至100mL,宜5.61.5mol/L的Tris-HCI緩沖液保存。5.810%過(guò)硫酸銨溶液稱取三羥甲基氨基甲烷0.152g、溴酚藍(lán)1mg、SDS0.4g,甘油2mL,用鹽酸調(diào)pH值至6.8,加水溶解并稀釋至10mL。該緩沖液用于非還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。如用于還原型SDS-聚丙烯稀釋至1000mL。稱取三氯醋酸5g,加水200mL溶解后，加甲醇200mL,再加水定容至500mL。稱取1.0g考馬斯亮藍(lán)R250,加入甲醇200mL、冰醋酸50mL,加水定容至250mL,混勻。3GB/T40174—20215.13脫色液取甲醇400mL、冰醋酸100mL,加水定容至1000mL,混勻。6儀器設(shè)備6.1紫外-可見分光光度計(jì)。6.2電泳裝置，應(yīng)符合YY/T0087的要求。6.3凝膠薄層掃描儀。6.4電子分析天平，分度值為0.0001g。7樣品制備準(zhǔn)確稱取樣品W?(若樣品為液體時(shí)，準(zhǔn)確量取),用合適的溶液溶解制成1mg/mL的樣品溶液，按照附錄A的方法測(cè)得樣品中蛋白質(zhì)含量Cy。8試驗(yàn)步驟8.1電泳樣品緩沖液，100℃煮沸3min,按照附錄B的方法進(jìn)行電泳。8.2掃描取脫色好的膠片，置凝膠薄層掃描儀中，分別對(duì)樣品和牛血清白蛋白電泳膠帶進(jìn)行掃描。8.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制用軟件計(jì)算牛血清、白蛋白電泳膠帶灰度值，以灰度值為橫坐標(biāo)，蛋白質(zhì)含量為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見公式(1): (1)式中：W——蛋白質(zhì)的質(zhì)量，單位為毫克(mg);H——灰度值；9結(jié)果計(jì)算9.1樣品中目標(biāo)工具酶質(zhì)量的計(jì)算用軟件計(jì)算樣品中目標(biāo)工具酶電泳膠帶的灰度值，代入公式(1),計(jì)算出上樣樣品中目標(biāo)工具酶的質(zhì)量(W?)。樣品中目標(biāo)工具酶質(zhì)量按公式(2)計(jì)算：W?=W?×F…………(2)4GB/T40174—2021式中：W?——樣品中目標(biāo)工具酶的質(zhì)量，單位為毫克(mg);W?——上樣樣品中目標(biāo)工具酶的質(zhì)量，單位為毫克(mg);F——稀釋倍數(shù)。9.2樣品總蛋白質(zhì)中工具酶純度的計(jì)算樣品總蛋白質(zhì)中工具酶純度按公式(3)計(jì)算：式中：Cp——樣品總蛋白質(zhì)中工具酶純度；W?———樣品中目標(biāo)工具酶的質(zhì)量，單位為毫克(mg);W?——樣品質(zhì)量或體積，單位為毫克(mg)或毫升(mL);C,——樣品中的蛋白質(zhì)含量，單位為毫克每毫克(mg/mg)或毫克每毫升(mg/mL)。9.3樣品固含物中工具酶純度的計(jì)算樣品固含物中工具酶的純度按公式(4)計(jì)算：式中：C、——樣品固含物中工具酶純度；W?———樣品中目標(biāo)工具酶的質(zhì)量，單位為毫克(mg);W?——樣品質(zhì)量或體積，單位為毫克(mg)或毫升(mL);Ca———樣品中的固含物含量，單位為毫克每毫克(mg/mg)或毫克每毫升(mg/mL)。10質(zhì)量控制在重復(fù)性條件下，獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不大于這兩個(gè)測(cè)定值的算數(shù)平均值5GB/T40174—2021(規(guī)范性)福林酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量A.1原理依據(jù)蛋白質(zhì)分子中含有的肽鍵在堿性溶液中與Cu2+螯合形成蛋白質(zhì)-銅復(fù)合物，此復(fù)合物使酚試劑的磷鉬酸還原，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，同時(shí)在堿性條件下酚試劑易被蛋白質(zhì)中的酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸還原呈藍(lán)色反應(yīng)。在一定范圍內(nèi)其顏色深淺與蛋白質(zhì)的濃度呈正比，以蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品中蛋白質(zhì)的含量。A.2試驗(yàn)步驟A.2.1牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱取適量的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，加水溶解并制成0.2mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。A.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL,分別置于具塞試管中，加水至1.0mL,再分別加入堿性銅溶液(5.1)1.0mL,搖勻，室溫放置10min后，分別加入福林酚溶液(5.2)4.0mL,立即混勻，室溫放置30min后，在650nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與其相對(duì)應(yīng)的吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程見公式(A.1):C=bX+a…………(A.1)式中：C——蛋白質(zhì)含量，單位為毫克每毫升(mg/mL);X——在650nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值；b——斜率。A.2.3樣品測(cè)定將第7章中制備得到的樣品溶液用水稀釋為0.1mg/mL的試樣溶液，準(zhǔn)確量取試樣溶液適量，按A.2.2的操作進(jìn)行測(cè)定。從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出每毫升測(cè)定樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量。A.3結(jié)果計(jì)算按照A.2.3測(cè)出樣品溶液的吸光值，再將吸光值代入公式(A.1),計(jì)算出每毫升測(cè)定樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量(C?)。樣品中的蛋白質(zhì)含量(Cy),按公式(A.2)計(jì)算：式中：…………(A.2)Cy———樣品中的蛋白質(zhì)含量，單位為毫克每毫克(mg/mg)或毫克每毫升(mg/mL);C?———每毫升測(cè)定樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量，單位為毫克每毫升(mg/mL);V——測(cè)定樣品溶液的體積，單位為毫升(mL);F———稀釋倍數(shù)；6GB/T40174—2021(規(guī)范性)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳B.1原理依據(jù)大多數(shù)蛋白質(zhì)都能與陰離子表面活性劑SDS按質(zhì)量比結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)分子所帶的負(fù)電荷遠(yuǎn)超過(guò)天然蛋白質(zhì)分子的凈電荷，消除了蛋白質(zhì)分子的電荷效應(yīng)，使蛋白質(zhì)按相對(duì)分子質(zhì)量大小進(jìn)行分離。B.2試驗(yàn)步驟B.2.1分離膠溶液的制備根據(jù)不同相對(duì)分子質(zhì)量的需要，按表B.1制成分離膠溶液，灌入模具內(nèi)至一定高加水封頂，室溫下聚合。表B.1分離膠和濃縮膠配制比例凝膠種類分離膠濃縮膠凝膠濃度試液體積/mL1.5mol/LTris-HCl(pH8.8)—0.5mol/LTris-HCl(pH6.8)0.63水8.454.70.150.150.150.150.150.150.0510%過(guò)硫酸胺0.150.150.150.150.150.150.05四甲基乙二胺(TEMED)0.0060.0060.0060.0060.0060.0060.005注：“—”為空白。B.2.2濃縮膠溶液的制備待分離膠溶液聚