樹突狀細(xì)胞與腫瘤免疫治療

樹突狀細(xì)胞與腫瘤免疫治療AntigenThcellAntigenprocessingpresentingAPCSpecificimmuneresponseTh1Th2BcellCTLplasmacellAntibodyThecoreofspecificimmuneresponseistheeffectiveactivationoflymphocytesafterantigenrecognition.Thepresentationofantigenisthekeyelementofspecificimmuneresponse.2

1975年美國國立癌癥研究所(NationalCancerInstitute,NCI)Rosenberg等提出生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑(biologicalresponsemodifier,BRM)的概念，開創(chuàng)了腫瘤生物治療的新里程碑。一些研究發(fā)現(xiàn)，滅活的腫瘤細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞裂解物、腫瘤抗原蛋白、腫瘤細(xì)胞DNA，聯(lián)合某些細(xì)胞因子或佐劑能在荷瘤個(gè)體產(chǎn)生一定的治療效果，但療效較為低下，難以達(dá)到完全緩解，延長荷瘤個(gè)體生存。3樹突狀細(xì)胞(dendriticcells,DC)是功能最強(qiáng)的APC，能有效攝取、加工及提呈抗原，刺激初始型T細(xì)胞的增殖和活化，是啟動(dòng)、調(diào)控并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。將DC修飾成為一種“自然”疫苗正成為一種能激發(fā)強(qiáng)大而持久抗腫瘤免疫應(yīng)答新的手段。充分理解DC的生物學(xué)特性則有助于制備更為有效的免疫治療疫苗。4PartIDCBiology51.DC的形態(tài)和表面標(biāo)志若要鑒定所得到的細(xì)胞是否為DC，往往是通過形態(tài)學(xué)、組合性細(xì)胞表面標(biāo)志、MLR中刺激初始型T細(xì)胞增殖三個(gè)方面加以綜合判斷，即具有典型樹突狀形態(tài)、膜表面高表達(dá)MHCⅡ類分子、能夠移行到淋巴器官和刺激初始型T細(xì)胞活化增殖，并具有一些相對(duì)特異性表面標(biāo)志的一類細(xì)胞62.DC的來源及分化成熟DC分為髓系和淋巴系兩大群體人髓系DC是近年來研究和運(yùn)用最被關(guān)注的DC亞群，業(yè)已在腫瘤免疫中得到廣泛應(yīng)用人髓系DC主要包括：從CD34+造血細(xì)胞誘導(dǎo)分化獲得的；從單核細(xì)胞誘導(dǎo)獲得的Mo-DC；存在于皮膚、呼吸道上皮及消化道粘附上皮的郎罕氏細(xì)胞（LC）7髓系DC是具有不同的分化發(fā)育階段的特殊免疫細(xì)胞群，業(yè)已建立了體外對(duì)髓系DC分化發(fā)育階段及其功能研究的模型和方式。據(jù)此可將髓系DC分化發(fā)育分為四個(gè)期：前體期、未成熟期、遷移期、成熟期，各階段DC有不同的功能特點(diǎn)。8未成熟DC成熟DC存在部位非淋巴組織、器官外周淋巴組織表達(dá)MHCⅡ類分子數(shù)量/細(xì)胞~106~7×106表達(dá)共刺激分子、黏附分子－或低＋＋表達(dá)FcR，CR，TLR＋＋－產(chǎn)生的細(xì)胞因子TNF-α,IL-1,IL-6IL-12,IL-4,IL-18表達(dá)趨化因子受體CCR1,2,5CXCR1,2CCR7,CXCR4主要功能攝取、處理抗原提呈抗原未成熟DC和成熟DC的特點(diǎn)9PrecursorPopulationsAnatomicalLocalizationFunctionTheFinalOutcomeofImmuneResponse3.DC的異質(zhì)性104.DC對(duì)抗原的攝取、處理、提呈DC能通過內(nèi)吞、胞飲、胞吞等方式攝取細(xì)菌、壞死細(xì)胞、蛋白質(zhì)以及免疫復(fù)合物。攝取的抗原降解成為抗原多肽，并和MHCI或MHCII類分子結(jié)合，進(jìn)而轉(zhuǎn)運(yùn)至膜表面，為抗原特異性T細(xì)胞識(shí)別。

內(nèi)源性抗原：MHCI類途徑外源性抗原：MHCII類途徑Cross-presentation:外源性抗原通過MHCI類途徑加以提呈，可使DC激發(fā)CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞免疫應(yīng)答，這可為設(shè)計(jì)抗原使其能通過兩種途徑得以提呈提供思路。11EfficientAntigenCapturing12

DC的成熟信號(hào)主要是由病原體成分或機(jī)體炎癥、損傷組織釋放的因子作用（危險(xiǎn)信號(hào)）所介導(dǎo)，

是由一系列因子觸發(fā)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所完成。

機(jī)體產(chǎn)生的炎癥因子包括，sCD40L、TNF-α、IFN-α、IL-1；微生物成分以及損傷組織所釋放的分子則通過Toll-likereceptors(TLR)完成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。5.DC的成熟13

胞吞作用減弱，形成p-MHCI和p-MHCII復(fù)合物能力增強(qiáng)細(xì)胞骨架延伸遷徙至淋巴組織T細(xì)胞區(qū)(CCR1,5,7)

促進(jìn)趨化因子的產(chǎn)生，招募單核細(xì)胞、DC、特定的T細(xì)胞亞群激發(fā)T細(xì)胞能力增強(qiáng)表達(dá)一些特征性膜分子，CD83、DC-LAMP

上調(diào)黏附分子和共刺激分子的表達(dá)，參與免疫突觸的形成介導(dǎo)細(xì)胞因子的分泌，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的進(jìn)程

DC成熟后發(fā)生一系列和功能密切相關(guān)的生物學(xué)改變，如：146.DC的體外培養(yǎng)及應(yīng)用DC在組織中含量甚微，細(xì)胞表面缺乏特征性的標(biāo)志，不易與其它細(xì)胞分離。細(xì)胞來源的困難一度限制了對(duì)DC生物學(xué)特性等方面的深入研究目前用于臨床和實(shí)驗(yàn)研究的DC大多是通過體外分離DC的前體細(xì)胞，在含有有關(guān)細(xì)胞因子的培養(yǎng)體系中誘導(dǎo)獲得15如何在體外獲得大量的功能性DC是DC療法治療腫瘤需要解決的關(guān)鍵環(huán)節(jié)骨髓、臍血、外周血CD34+細(xì)胞或外周血單個(gè)核細(xì)胞均可作為體外培養(yǎng)DC的來源適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子配伍和應(yīng)用順序?qū)C的培養(yǎng)具有重要作用16PartIIManipulationofDCforCancerImmunotherapy17樹突狀細(xì)胞療法是具有潛在應(yīng)用前景

的腫瘤免疫治療手段DC治療前DC治療后18手術(shù)復(fù)發(fā)DC治療腫瘤消失再次復(fù)發(fā)樹突狀細(xì)胞療法是具有潛在應(yīng)用前景的腫瘤免疫治療手段19國外早在1995年已開展了DC治療腫瘤的Ⅰ期臨床試驗(yàn),國內(nèi)直到2006年開展了應(yīng)用DC腫瘤疫苗進(jìn)行腫瘤治療的臨床試驗(yàn)；綜合近年來對(duì)不同腫瘤的Ⅰ/Ⅱ臨床試驗(yàn)結(jié)果，總的說來，多數(shù)能夠產(chǎn)生一定的治療效果。尤其表現(xiàn)在前列腺癌和惡性黑色素瘤，目前已經(jīng)進(jìn)行到Ⅱ/Ⅲ期的臨床治療方案，臨床緩解率基本上可以達(dá)到30％。其他腫瘤，包括結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌、多發(fā)性骨髓瘤、B細(xì)胞淋巴瘤、腦膠質(zhì)瘤、腎細(xì)胞癌等也已經(jīng)開始了DC的臨床應(yīng)用，其療效因腫瘤的不同而各異。

20DC抗腫瘤免疫治療的主要機(jī)制腫瘤特異性抗原的有效遞呈誘導(dǎo)產(chǎn)生大量效應(yīng)T細(xì)胞啟動(dòng)效應(yīng)T細(xì)胞遷移到腫瘤部位保持效應(yīng)T細(xì)胞在腫瘤部位的長期存在抑制腫瘤血管的生成主要目的是誘導(dǎo)患者機(jī)體產(chǎn)生腫瘤特異性的、持久的免疫應(yīng)答21DC與腫瘤免疫逃逸DC能否與已存在的腫瘤接觸從而攝取并加工腫瘤抗原，有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，某些腫瘤細(xì)胞低表達(dá)GM-CSF，抑制DC向腫瘤部位遷移；腫瘤細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子抑制DC向淋巴結(jié)遷移；早期的腫瘤細(xì)胞不產(chǎn)生LPS、TNF-α等細(xì)胞因子，當(dāng)腫瘤細(xì)胞的增殖到達(dá)一定程度，細(xì)胞出現(xiàn)壞死、凋亡或周圍組織有炎性浸潤時(shí)，DC才被激活，而此時(shí)腫瘤已無法為免疫系統(tǒng)所控制；腫瘤細(xì)胞分泌的IL-10、TGF-β、VEGF等抑制DC的分化發(fā)育和功能22****23

CD34+造血干細(xì)胞來源的DC

單核細(xì)胞來源的DC

患者外周血中分離獲得的DC

腫瘤細(xì)胞來源的DC1.DC的來源24——CD34+造血干細(xì)胞來源的DC骨髓、臍帶血中含有相對(duì)較多的CD34+細(xì)胞，在GM-CSF和TNF-

的微環(huán)境中誘導(dǎo)2周后，能夠分化為CD1a+CD83+HLA-DR++的成熟DC，加入IL-4可以增加DC細(xì)胞的純度，但不能夠擴(kuò)增產(chǎn)量，但FL、SCF或IL-3能夠大大提高收獲的DC細(xì)胞量；CD34-DC可能比Mo-DC具有更強(qiáng)的抗原提呈能力

誘導(dǎo)往往需要兩步法，需要大量的細(xì)胞因子，花費(fèi)較高。此外適合患者HLA配型的骨髓與臍帶血的獲得也有一定的難度

25——單核細(xì)胞來源的DCGM-CSF和IL-4（或IL-13）可以誘導(dǎo)CD14+的單核細(xì)胞向DC分化，加入TNF-

、CD40L或單核培養(yǎng)基可以促進(jìn)DC成熟在數(shù)量上Mo向DC分化沒有擴(kuò)增效應(yīng)，但外周血中含有大量的Mo并且可以通過其貼壁特性而分離，經(jīng)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的DC可以避免腫瘤微環(huán)境的抑制作用，所以為多數(shù)臨床試驗(yàn)采用。用GM-CSF動(dòng)員后的外周血中單核細(xì)胞的比例更高，并且含有一定數(shù)量的前體細(xì)胞，能夠獲得增殖DC可由外周血單個(gè)核細(xì)胞直接誘導(dǎo)而來，和貼壁細(xì)胞來源的DCs相比，PBMC來源的DCs表達(dá)更高的共刺激分子CD86、CD40和MHC-П類分子26——患者外周血中分離獲得的DC

從外周血中直接分離DC，簡單快速，可以不經(jīng)過體外長期培養(yǎng)的過程直接獲得，并且具有較強(qiáng)的同種刺激T細(xì)胞增殖的活性但DC在外周血中的比例很低（在未經(jīng)動(dòng)員的情況下，只占到PBMC的0.15%~0.7%，或(3~17)×106DC/L血液），不能夠獲得足夠的細(xì)胞量限制了其使用；某些腫瘤患者來源的血液DC，可能存在數(shù)量上的減少和功能上的缺陷27——腫瘤細(xì)胞來源的DC白血病細(xì)胞來源的DC282.DC的抗原負(fù)載291）采用TAA多肽負(fù)載DCs

優(yōu)點(diǎn)可簡化臨床過程，省去從每個(gè)患者中分離腫瘤抗原的程序，無需取得腫瘤組織或細(xì)胞，安全性好，易于檢測(cè)所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答；抗原純度高，可以增強(qiáng)疫苗的免疫效率；所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)具有腫瘤抗原表位特異性，沒有無關(guān)抗原的存在，有效避免了非特異性免疫應(yīng)答對(duì)正常組織的損傷，進(jìn)一步減少了針對(duì)自身組織的自身免疫反應(yīng)30不足之處1)大多數(shù)腫瘤尚未明確TAA；2)針對(duì)CD8+CTL識(shí)別表位的抗原多肽不能誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性CD4+Th，后者在持續(xù)性CTL激發(fā)中起到重要作用；3)應(yīng)用受到MHC配型限制，而且同種腫瘤的不同患者對(duì)某種TAA多肽的反應(yīng)存在差異性；4)已知的TAA只有一部分屬于腫瘤排斥抗原，并不一定能誘導(dǎo)最佳的抗腫瘤免疫反應(yīng)；選用單一腫瘤抗原可能會(huì)由于抗原突變，出現(xiàn)腫瘤逃逸的風(fēng)險(xiǎn)1）采用TAA多肽負(fù)載DCs

312）采用腫瘤全細(xì)胞抗原負(fù)載DC

可以不必明確和制備腫瘤細(xì)胞的TSA或TAA，節(jié)省病人花費(fèi)，并且可以有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生多克隆的CD4+Th和CD8+CTL目前采用的腫瘤全細(xì)胞抗原主要包括腫瘤細(xì)胞裂解物、酸洗脫腫瘤細(xì)胞表面的蛋白分子，凋亡腫瘤細(xì)胞及其釋放的凋亡小體等粗提物

能夠提供MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ兩類途徑的抗原表位，減少了抗原突變所致腫瘤逃逸的風(fēng)險(xiǎn)322）采用腫瘤全細(xì)胞抗原負(fù)載DC

需要足夠的腫瘤組織，這對(duì)于微小腫瘤及難以手術(shù)切除腫瘤的的患者來說，具有一定的限制應(yīng)用粗提物由于其中含有正常組織的成分，可能會(huì)引起自身免疫反應(yīng)由于腫瘤特異抗原的濃度不足，粗提物DC疫苗誘導(dǎo)腫瘤特異性免疫應(yīng)答的效率會(huì)比較低332）采用腫瘤全細(xì)胞抗原負(fù)載DC

需要足夠的腫瘤組織，這對(duì)于微小腫瘤及難以手術(shù)切除腫瘤的的患者來說，具有一定的限制應(yīng)用粗提物由于其中含有正常組織的成分，可能會(huì)引起自身免疫反應(yīng)由于腫瘤特異抗原的濃度不足，粗提物DC疫苗誘導(dǎo)腫瘤特異性免疫應(yīng)答的效率會(huì)比較低343）采用腫瘤抗原核酸負(fù)載DC

利用已知的腫瘤特異抗原核酸序列轉(zhuǎn)染DC，可以獲得持續(xù)表達(dá)腫瘤抗原的DC疫苗，節(jié)省了需要大量提純或合成腫瘤抗原的程序采用目的DNA轉(zhuǎn)染DC，制備DNA腫瘤抗原DC疫苗，可以使DC內(nèi)源性地表達(dá)腫瘤抗原分子，并以DC自身內(nèi)源表達(dá)蛋白相似的途徑遞呈MHCⅠ類分子限制性抗原35采用腫瘤細(xì)胞RNA負(fù)載DC可以從很少量的腫瘤細(xì)胞中通過體外擴(kuò)增和轉(zhuǎn)錄獲取足量RNA不需要對(duì)腫瘤抗原作具體的鑒定，可以通過差異削減雜交尋找并富集到腫瘤限制性RNA，從而可以避免誘導(dǎo)針對(duì)自身抗原的自身免疫反應(yīng)。RNA半衰期短，不會(huì)整合到基因中，提高了臨床應(yīng)用的安全性RNA容易降解，對(duì)操作技術(shù)要求很高36非病毒載體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染的DC應(yīng)用安全性高，但轉(zhuǎn)染效率不高，并且對(duì)細(xì)胞具有較強(qiáng)的毒性病毒載體存在安全隱患，載體表達(dá)的病毒蛋白可能影響DC活性及誘發(fā)非腫瘤特異性免疫應(yīng)答，以及存在病毒基因與DC基因隨機(jī)重組的可能性374）采用DC與腫瘤細(xì)胞的融合體

腫瘤細(xì)胞與DC融合，可獲得既具有獨(dú)特腫瘤特異性抗原又具有DC協(xié)同刺激作用的雜合體，這種雜合體細(xì)胞表達(dá)腫瘤特異性抗原、MHCⅠ、Ⅱ類抗原和協(xié)同刺激分子，既具有腫瘤細(xì)胞的全套抗原成分，又具有DC強(qiáng)大的抗原提呈能力

384）采用DC與腫瘤細(xì)胞的融合體

但是腫瘤細(xì)胞-DC融合細(xì)胞的制備類似雜交瘤細(xì)胞系建株，方法繁瑣，雜合細(xì)胞生物學(xué)特性的不確定性以及有一定風(fēng)險(xiǎn)，限制了臨床應(yīng)用395）MHC-限制性抗原肽可通過分子改建增強(qiáng)針對(duì)低免疫原性抗原的免疫應(yīng)答、增強(qiáng)抗原提呈以及增加TCR親和力；不足之處在于需HLA配型、p-MHC復(fù)合物半衰期短、高親和力表位對(duì)低親和力表位的競爭抑制作用40目前認(rèn)為采用全蛋白、滅活腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞裂解物作為抗原產(chǎn)生的臨床療效最為顯著，這可能由于這些外來抗原可以通過交互致敏的方式同時(shí)激發(fā)CD4+T細(xì)胞CD8+T細(xì)胞。

Timmerman等采用腫瘤特異性獨(dú)特型免疫球蛋白負(fù)載DC，在10例濾泡淋巴瘤患者獲得了2例CR，1例PR。

Holtl等采用腫瘤裂解物沖擊DC，并每月回輸一次，對(duì)35例轉(zhuǎn)移性腎癌患者進(jìn)行療效觀察，在觀察的27例患者中，2例CR，1例PR，7例病情穩(wěn)定。

O’Rourke等報(bào)道，17例轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者在接受放射滅活的腫瘤細(xì)胞負(fù)載的DC治療，完成全部療程的12例患者中3例CR，3例PR，并且長期的DC疫苗治療可能更有助于更好的控制病情。在難治性皮膚T細(xì)胞淋巴瘤患者經(jīng)過腫瘤裂解物沖擊的DC治療也取得了令人鼓舞的療效。413.DC的劑量選擇目前公認(rèn)的劑量約為106～107，在不低于105

的情況下均可行。靜脈途徑需要的數(shù)量較高，而皮下或皮內(nèi)途徑只需很少的DC但是最近也有研究表明注射劑量和效應(yīng)之間并無明顯的相關(guān)性，相反，注射部位的選擇更加重要。424.DC的輸注途徑和時(shí)間

淋巴結(jié)內(nèi)注射(i.n)皮內(nèi)注射(i.d)

靜脈注射(i.v)瘤體內(nèi)注射43皮下免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物DC腫瘤疫苗，能夠按照預(yù)期的目的進(jìn)入引流淋巴結(jié)。但人體的研究發(fā)現(xiàn)皮內(nèi)注射只有0.1%~0.4%的標(biāo)記細(xì)胞出現(xiàn)在淋巴結(jié)靜脈注射，DC首先聚集在肺臟、然后是肝臟、脾臟，表明它們不能有效地進(jìn)入淋巴結(jié)44淋巴結(jié)內(nèi)注射、瘤體內(nèi)多點(diǎn)注射是高效的免疫途徑，而且DC的絕對(duì)數(shù)只需要(1~2)

106即可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答，但這種操作方法需要一定的技術(shù)45相同劑量的DC采用不同部位注射，其結(jié)果有很大差別：皮內(nèi)注射DC約有1%到達(dá)外周淋巴結(jié)，靜脈注射DC則停留在肺、肝和脾中免疫途徑對(duì)免疫應(yīng)答的類型具有深刻的影響:

皮內(nèi)注射傾向于產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答，而靜脈注射傾向于Th2型免疫應(yīng)答

46DC疫苗注射時(shí)間

目前尚無統(tǒng)一的時(shí)間，一般根據(jù)動(dòng)物模型和人的某些疫苗的接種經(jīng)驗(yàn)，采用每周一次或每月一次47伴隨的細(xì)胞因子或佐劑GM-CSFFLCD40LIL-2,IL-4485.DC疫苗的副作用過敏免疫耐受采用黑色素瘤細(xì)胞裂解物作為抗原負(fù)載的DC，在輸入患者體內(nèi)后，有約43%的患者出現(xiàn)了不同程度的白癜風(fēng)；小鼠經(jīng)有效的DC治療后有可能導(dǎo)致糖尿病496.患者的免疫狀態(tài)

目前的臨床試驗(yàn)，受試對(duì)象多數(shù)為處于進(jìn)展期的腫瘤患者，他們的免疫系統(tǒng)在一定程度上受到抑制。采用生物治療的最佳候選其實(shí)是具有一定免疫功能的患者，因化療或放療而使免疫系統(tǒng)遭到深度損傷的患者常常喪失了生物治療的最佳時(shí)機(jī)DC瘤苗可能在腫瘤患者發(fā)生瘤體消退但仍具有復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的情況下具有更重要的應(yīng)用價(jià)值507.DC疫苗特異性免疫效果的評(píng)價(jià)特異性CTL的增殖水平以及殺傷活性；反映特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答的Th1和Th2細(xì)胞因子的相對(duì)水平（IFN-

、IL-4、IL-10）或抗輔助蛋白的IgG亞型；對(duì)腫瘤抗原或輔助蛋白的遲發(fā)超敏反應(yīng)51SomeunansweredquestionsWhichDCshouldbeused?HowshouldtheDCbematured?Whatarethebestantigentouse?HowshouldDCbeloadedwithantigen?Shouldanadjuvantbeused,ifsowhat?WhatistheoptimumrouteandscheduleofdeliveryofDC?

52Whatarethebestteststopredictclinicalresponse?Whatclinicalandimmunologicaloutcomeshouldbemeasured?Whatstrategiesmaybeusedtoovercomethehostiletumorenvironment?Onceestablished,howcananeffectiveCTLresponsebestbemaintained?

Someunansweredquestions53以DC為物質(zhì)基礎(chǔ)的免疫治療仍存在著一些亟待解決的問題體外進(jìn)一步優(yōu)化誘導(dǎo)DC成熟的方案并尋找有效的伴隨的細(xì)胞因子佐劑；尋找最佳的抗原負(fù)載的方式；DC必須在趨化因子和其它信號(hào)的作用下遷移到淋巴組織，從而與T細(xì)胞相互作用并啟動(dòng)T細(xì)胞免疫應(yīng)答，