茶用酶的分離純化技術(shù)

茶用酶的分離純化技術(shù)

第一節(jié)酶的純化方法第二節(jié)酶的純度和產(chǎn)量第三節(jié)酶的劑型與保存第一節(jié)酶的純化方法一、選擇酶分離純化方法的依據(jù)蛋白在物理、化學(xué)等方面的差異：

a、溶解度；

b、分子大小、形狀；

c、解離電學(xué)性質(zhì)（酸堿性、極性、電荷）；

d、穩(wěn)定性；

e、對(duì)其他分子的親和性（基于酶和底物、輔助因子以及抑制劑間具有專(zhuān)一的親和作用的特點(diǎn)）。二、酶分離純化的基本流程選材→預(yù)處理→破碎→抽提→分離及純化→保存酶的分離純化常包括：濃縮：把酶制劑從很大體積濃縮到比較小的體積去雜蛋白：把酶制劑中大量的雜質(zhì)蛋白和其他大分子物質(zhì)分離出去。三、酶分離純化技術(shù)

1、選材選擇酶含量豐富的新鮮生物材料，過(guò)去多用動(dòng)物或植物的器官組織作為酶的來(lái)源，近年來(lái)則主要采用微生物作材料。

三、酶分離純化技術(shù)

2、預(yù)處理

不管什么原料，通常需先進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理如：動(dòng)物材料要剔除結(jié)締組織、脂肪組織油質(zhì)種子最好先用乙醚等脫脂種子研磨前應(yīng)去殼，以免丹寧等物質(zhì)著色污染微生物材料則應(yīng)將菌體和發(fā)酵介質(zhì)分離預(yù)處理后酶的提取工作須盡可能以非常新鮮的狀態(tài)直接提取，否則應(yīng)在低溫下保存，－20～－70℃為宜，或?qū)⑸锝M織做成丙酮粉保存。三、酶分離純化技術(shù)

3、破碎1）動(dòng)物材料動(dòng)物組織細(xì)胞較易破碎，通過(guò)一般的研磨器、勻漿器、高速組織搗碎機(jī)就可達(dá)到目的。高速搗碎器操作簡(jiǎn)便、破碎效果好，但易引起局部溫度過(guò)高，導(dǎo)致酶失效，故必須考慮酶的特點(diǎn)謹(jǐn)慎使用。高速振動(dòng)球磨機(jī)

三、酶分離純化技術(shù)3、破碎2）植物材料植物細(xì)胞壁較厚，需要用超聲波、細(xì)菌磨、凍融、溶菌酶或用某些化學(xué)溶劑如甲苯、去氧膽酸鈉、去垢劑等處理加以破碎，制成組織勻漿。在上述機(jī)械處理后，為了有利于下一步抽提，還可進(jìn)一步作成丙酮干粉。三、酶分離純化技術(shù)

3、破碎3）微生物材料霉菌：比較容易，可通過(guò)機(jī)械剪切、研磨或加細(xì)胞壁溶解酶解決。細(xì)菌：少量材料常用超聲波破碎器和溶菌酶等處理；大量材料通常采用丙酮干粉法，或采用自溶法酵母：細(xì)胞壁厚較難破碎，過(guò)去多用自溶法，現(xiàn)可采用的辦法有：細(xì)胞壁溶解酶處理法、冷熱破壁法。三、酶分離純化技術(shù)3、破碎

2種常用破碎方法4）丙酮干粉法

一般是先將材料粉碎或分散，然后在0℃以下的低溫條件下,

加入5-10倍的15～20℃的丙酮，迅速攪拌均勻，隨即過(guò)濾，最后低溫干燥,

研磨過(guò)篩。三、酶分離純化技術(shù)

3、破碎4）丙酮干粉法優(yōu)點(diǎn)：丙酮處理一方面能有效地破壞細(xì)胞壁（膜）能有利于除去大量脂類(lèi)物質(zhì)能使某些結(jié)合酶易于溶解丙酮干粉含水量低，易于保存缺點(diǎn)：丙酮可能引起某些酶變性失效三、酶分離純化技術(shù)

3、破碎5）自溶法操作：在適當(dāng)?shù)臏囟取H條件下，將濃的菌體懸浮直接保溫，或加甲苯、乙酸乙酯或其它溶劑一起保溫一定時(shí)間，使菌體自溶液化。缺點(diǎn)：第一，自溶液中成份十分復(fù)雜。第二，有破壞待分離酶的危險(xiǎn)。三、酶分離純化技術(shù)

4、抽提

兩種基本抽提方式：

“普遍”性抽提：在低溫下，以水或低鹽緩沖液，從組織勻漿中抽提酶，得到酶的粗提液。選擇性抽提：先后用不同溶劑進(jìn)行。將盡可能多的酶、盡量少的雜質(zhì)提取出來(lái)三、酶分離純化技術(shù)

4、抽提1）抽提條件的選擇大多數(shù)酶屬于球蛋白類(lèi)，一般可用稀鹽、稀酸或稀堿的水溶液進(jìn)行抽提。但抽提液的具體組成和抽提條件的選擇取決于酶的溶解性、穩(wěn)定性以及有利于切斷酶和其它物質(zhì)的聯(lián)系。需要考慮的因素有：

a.pH；

b.鹽；

c.溫度；

d.其它。三、酶分離純化技術(shù)

4、抽提1）抽提條件的選擇

a.pH

先應(yīng)考慮酶的酸堿穩(wěn)定性，遠(yuǎn)離酶的等電點(diǎn)。以選用pH4-6為佳一般，酸性蛋白質(zhì)（pI>7）宜用堿性溶液抽提堿性蛋白質(zhì)（pI<7）宜用酸性溶液抽提

例如，肌肉甘油醛-3-磷酸脫氫酶以稀堿抽提時(shí)產(chǎn)量較高，胰蛋白酶選用0.125mol/L硫酸。

三、酶分離純化技術(shù)

4、抽提1）抽提條件的選擇

b.鹽

大多數(shù)蛋白質(zhì)在低濃度的鹽溶液中有較大的溶解度，所以抽提液一般采用等滲鹽溶液。最普通的加0.020－0.050mol/L的磷酸緩沖液、0.15mol/L

NaCl等。焦磷酸鈉和檸檬酸鈉的緩沖有助于切斷酶和其它物質(zhì)的聯(lián)系，并有絡(luò)合某些金屬的作用，因此用得也很多。少數(shù)情況用水抽提效果亦佳，如霉菌脂肪酶的抽提。三、酶分離純化技術(shù)

4、抽提1）抽提條件的選擇

c.溫度

一般要求在低溫抽提三、酶分離純化技術(shù)

4、抽提1）抽提條件的選擇

d.其它抽提液的用量通常采用原料量的1-5倍，有時(shí)要反復(fù)抽提，液量可能大些。防止蛋白酶水解：加入苯甲基磺酰氟；防止氧化等：加入半胱氨酸、惰性蛋白、DDT等；防止污染微生物：加入疊氮化鈉等。

三、酶分離純化技術(shù)

4、抽提2）固體成份除去

抽提后的細(xì)胞殘?jiān)虬l(fā)酵液的固體成份多可用離心法或壓濾法除去。植物原料的抽提液在冷室中放置過(guò)夜往往就會(huì)自動(dòng)澄清。在抽提液離心時(shí)加入氫氧化鋁凝膠或磷酸鈣膠等物質(zhì),有助于除去懸浮的膠體物質(zhì)。三、酶分離純化技術(shù)

5、濃縮抽提液和發(fā)酵液中酶的濃度一般都很低，所以在進(jìn)行純化前須先加以濃縮。常用的濃縮方法有：

1）蒸發(fā)；

2）超過(guò)濾；

3）膠過(guò)濾；

4）冰凍濃縮；

5）其它。三、酶分離純化技術(shù)

5、濃縮

1）蒸發(fā)減壓蒸發(fā)蒸發(fā)濃縮除了效率低、費(fèi)時(shí)外，有時(shí)還要加熱，同時(shí)也可能產(chǎn)生泡沫，因此對(duì)穩(wěn)定性差的酶不適宜。另外蒸發(fā)過(guò)程可能產(chǎn)生增色現(xiàn)象，會(huì)影響產(chǎn)品質(zhì)量。三、酶分離純化技術(shù)

5、濃縮

1）蒸發(fā)薄膜蒸發(fā)濃縮法現(xiàn)多采用，使待濃縮的酶溶液在高度真空條件下變成極薄的液膜，同時(shí)使之與大面積熱空氣接觸，其中水分就能瞬時(shí)蒸發(fā)而達(dá)到濃縮的目的。由于水分蒸發(fā)時(shí)能帶走部分熱量，所以只要真空條件好，酶在濃縮過(guò)程中實(shí)際受到的熱作用并不太強(qiáng)，可用于熱敏性酶類(lèi)的濃縮，但也會(huì)帶來(lái)增色現(xiàn)象。薄膜蒸發(fā)濃縮器有三種形式：升膜、降膜和刮板三、酶分離純化技術(shù)

5、濃縮

2）超過(guò)濾在加壓情況下，將待濃縮溶液通過(guò)一層只容許水分子和小分子選擇性地透過(guò)的微孔超濾膜，而酶等大分子被滯留，從而達(dá)到濃縮目的的一種有效方法。

離心過(guò)濾管三、酶分離純化技術(shù)

5、濃縮

2）超過(guò)濾優(yōu)點(diǎn)：沒(méi)有熱破壞，沒(méi)有相變化，保持原來(lái)的離子強(qiáng)度和pH。只要膜選擇適當(dāng)，濃縮過(guò)程還可能同時(shí)進(jìn)行粗分,此外成本也不高，已漸漸為人們所采用。超過(guò)濾可用于小量樣品,也可用于工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模。注意：超濾膜有干型和濕型兩種，后者必須保持于溶液中三、酶分離純化技術(shù)

5、濃縮

3）膠吸水

利用葡聚糖凝膠SephdexG-25或G-50等能吸水膨潤(rùn)、而酶等大分子被排阻于膠外的原理進(jìn)行的濃縮

通常采用“靜態(tài)”方式，即將干膠直接加入樣品溶液（干膠用量可根據(jù)膠的吸水量計(jì)算），膠吸水膨潤(rùn)一定時(shí)間后，再借助過(guò)濾或離心等辦法分離濃縮的酶液。膠過(guò)濾濃縮法的優(yōu)點(diǎn)是，條件溫和，操作簡(jiǎn)便，也沒(méi)有pH與離子強(qiáng)度等的改變。三、酶分離純化技術(shù)

5、濃縮

4）冰凍濃縮原理：溶液相對(duì)純水的融點(diǎn)升高，冰點(diǎn)降低

a、先將溶液凍成冰塊。然后使之緩緩融解，這樣幾乎不含蛋白質(zhì)和酶的冰塊就浮于液面,而酶等則融解并集中于下層溶液(約為原體積的1／4);b、讓酶溶液緩緩凍凝，爾后移去水形成的冰塊.

缺點(diǎn)：濃縮過(guò)程可能會(huì)發(fā)生離子強(qiáng)度與pH的變化，從而導(dǎo)致酶失效；其次是需要大功率的致冷設(shè)備三、酶分離純化技術(shù)

5、濃縮

5）其它還有聚乙二醇、蔗糖等濃縮法，一般只適用小量樣品，而且往往成本很高。三、酶分離純化技術(shù)

6、分離及純化小分子雜質(zhì)一般會(huì)在純化中自然除去，易解決；大分子物質(zhì)包括核酸、粘多糖和其它蛋白質(zhì)往往干擾以后的純化，最好設(shè)法預(yù)先除去。核酸：可加硫酸鏈霉素、聚乙烯亞胺、色精蛋白或MnCl2等使之沉淀移去，必要時(shí)也可使用核酸酶。粘多糖：則常用醋酸鉛、乙醇、丹寧酸和離子型表面活性劑等處理解決，有時(shí)也可用酶。三、酶分離純化技術(shù)

6、分離及純化

操作條件要溫和，一般在0～5℃間進(jìn)行初分：用分離蛋白質(zhì)的方法，如鹽析、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑分級(jí)、選擇性熱變性等方法可從酶粗提液中初步分離酶。細(xì)分：再采用吸附層析、離子交換層析、凝膠過(guò)濾、親和層析、疏水層析及高效液相色譜法等層析技術(shù)或各種制備電泳技術(shù)進(jìn)一步純化酶，以得到純的酶制品。三、酶分離純化技術(shù)

6、分離及純化

1）純化方法的選擇第一，工作前應(yīng)對(duì)所要純化的酶的理化性質(zhì)（溶解度、分子大小和解離特性）以及酶的穩(wěn)定性等有一個(gè)較全面的了解，這樣就可知道應(yīng)選擇哪些辦法與條件。第二，判斷選擇的方法與條件是否適當(dāng)，始終應(yīng)以活力測(cè)定為準(zhǔn)則。一個(gè)好的步驟應(yīng)該是比活力（純度）提高多，總活力回收高（回收率高），而且重現(xiàn)性好。三、酶分離純化技術(shù)

6、分離及純化

1）純化方法的選擇第三，要嚴(yán)格控制操作條件，特別是隨著酶逐漸純凈、雜蛋白逐漸移除、總的蛋白量下降，蛋白質(zhì)間的相互保護(hù)作用隨之減小，酶的穩(wěn)定性亦越小，就更應(yīng)注意防止變性。三、酶分離純化技術(shù)

6、分離及純化

2）判斷分離提純方法好壞的指標(biāo)一是總活力的回收表示提純過(guò)程中酶的損失情況

總活力=（活力單位數(shù)／ml酶液）×總體積（ml）

總活力用于計(jì)算某一抽提或純化步驟后酶的得率或回收率(y)三、酶分離純化技術(shù)

6、分離及純化

2）判斷分離提純方法好壞的指標(biāo)二是比活力提高的倍數(shù)比活力：每mg蛋白質(zhì)所含的酶活力單位數(shù)愈大，表示酶純化的純度愈高。比活力=（總）活力單位數(shù)／mg（總）蛋白（氮）有時(shí)以U/g或U/ml來(lái)表示比活力用于計(jì)算某一純化步驟的純化效果，即純度的提高（純化倍數(shù)）(e)。三、酶分離純化技術(shù)

6、分離及純化

3）根據(jù)溶解度建立的純化方法

a.鹽析法;b.有機(jī)溶劑沉淀法;c.共沉淀法;d.選擇性沉淀法;e.等電點(diǎn)沉淀法三、酶分離純化技術(shù)

6、分離及純化

3）根據(jù)溶解度建立的純化方法

a.鹽析法優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、安全、重現(xiàn)性好缺點(diǎn)：分辨率低，純度提高不顯著，需要脫鹽鹽溶：球蛋白類(lèi)在低的鹽濃度溶液中，它的溶解度隨鹽的離子強(qiáng)度升高而增大，表現(xiàn)“鹽溶”特性。鹽析：但是當(dāng)鹽濃度繼續(xù)升高，超過(guò)某一上限值時(shí)，其溶解度又會(huì)以不同速度下降，分別沉淀析出。6、分離及純化3）根據(jù)溶解度建立的純化方法

a.鹽析法應(yīng)考慮pH、鹽、溫度、蛋白質(zhì)濃度

(1)pH控制pH可以提高純化效果鹽析的適宜pH接近于待純化酶的等電點(diǎn)。6、分離及純化3）根據(jù)溶解度建立的純化方法

a.鹽析法

(2)鹽就陽(yáng)離子來(lái)說(shuō)，一價(jià)鹽通常比二價(jià)鹽有效；而陰離子則相反，二價(jià)鹽比一價(jià)鹽好。符合這種條件的鹽有硫酸銨、硫酸鈉等。硫酸銨最常用，它的最大優(yōu)點(diǎn)是溶解度大，溶解的溫度系數(shù)小(0℃，706克／升；25℃，767克／升)即使在低溫下的溶解度范圍內(nèi)，幾乎所有蛋白質(zhì)都能鹽析出來(lái)。6、分離及純化3）根據(jù)溶解度建立的純化方法

a.鹽析法

(3)溫度從酶的穩(wěn)定性和溶解度看，鹽析溫度一般以控制在30℃左右為宜。6、分離及純化3）根據(jù)溶解度建立的純化方法

a.鹽析法

(4)蛋白質(zhì)濃度影響鹽析效果的重現(xiàn)性蛋白濃度不同，分級(jí)分離的范圍也往往會(huì)發(fā)生變動(dòng)

在100μg/ml以下，鹽析因難，甚至不能形成沉淀在200μg-1mg／ml，沉淀能生成，耗時(shí)，回收率低在1mg／ml以上，鹽析效果才較好6、分離及純化3）根據(jù)溶解度建立的純化方法

a.鹽析法

(5)其它鹽析沉淀通常至少要近一小時(shí)才能完成，沉淀可通過(guò)離心或壓濾和母液分離。鹽濃度低時(shí)，離心比較容易，而過(guò)濾較難；鹽濃度高時(shí)，需要高速離心，但過(guò)濾較易。6、分離及純化3）根據(jù)溶解度建立的純化方法

b.等電點(diǎn)沉淀法原理：蛋白質(zhì)的溶解度隨分子間引力增大而變小，當(dāng)其它條件相同時(shí)，分子間的引力以蛋白質(zhì)處于等電點(diǎn)狀態(tài)最大，因而容易析出沉淀。不過(guò)由于蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)仍有一定的溶解度，故沉淀往往不完全，一般很少單獨(dú)使用，更多的是作為其它沉淀法中的一個(gè)組合條件。6、分離及純化4）根據(jù)分子大小的建立純化方法

a.膠過(guò)濾(層析)法分子篩介質(zhì)是具有一定孔徑的球狀凝膠物質(zhì)，在適當(dāng)?shù)娜軇┗蚓彌_液中大于凝膠孔徑的分子不能進(jìn)入膠粒內(nèi)，移動(dòng)速度較快；反之，小于凝膠孔徑的分子能自由進(jìn)出膠粒內(nèi)外，下移速度較慢。待純化樣品通過(guò)一定長(zhǎng)度的層析柱后，不同大小的分子就將按先后顧序依次流出，彼此分開(kāi)。應(yīng)考慮的因素:膠的選擇與用量、柱層析的過(guò)程與要求等6、分離及純化4）根據(jù)分子大小的建立純化方法

a.膠過(guò)濾(層析)法（1）膠種類(lèi)的選擇作為分子篩的凝膠是由親水的線(xiàn)狀聚合物通過(guò)交聯(lián)劑交聯(lián)、或通過(guò)聚合物自身締合組成具有網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)的膠粒物質(zhì)。網(wǎng)眼孔徑大小由交聯(lián)程度或聚合物的濃度決定。最常用的凝膠有:(i)葡聚糖凝膠

(ii)聚丙烯酰胺凝膠

(iii)瓊脂糖凝膠

6、分離及純化4）根據(jù)分子大小的建立純化方法

a.膠過(guò)濾(層析)法（1）膠的選擇葡聚糖凝膠葡聚糖通過(guò)環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)而成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì),可用于分離分子量1-500kDa的分子。以商品SephdexG-為例，G-以后的數(shù)字為膠膨潤(rùn)時(shí)吸水量的10倍，如Ｇ-25就表示該膠物質(zhì)每1g能吸水2.5m1，數(shù)字越大說(shuō)明吸水量越高，孔徑也越大。還有SephdexLH-，是兼具親脂性和親水性的凝膠，可用于脂類(lèi)化合物的分離；SephacylS-可用于水溶液和有機(jī)溶劑系統(tǒng)，或高濃度氫鍵解離試劑存在的系統(tǒng)．各種葡聚糖凝膠G6、分離及純化4）根據(jù)分子大小的建立純化方法

a.膠過(guò)濾(層析)法(2)柱層析的基本過(guò)程與要求

基本過(guò)程：層析介質(zhì)活化→裝柱→平衡→加樣→洗滌→洗脫→檢測(cè)→分部收集6、分離及純化4）根據(jù)分子大小的建立純化方法

a.膠過(guò)濾(層析)法(2)柱層析的基本過(guò)程與要求

分離效果的標(biāo)準(zhǔn)：分辨率高，回收率高；稀釋度小和速度快。分辨率可用Rs權(quán)衡,Rs＝兩峰帶間距離／峰帶寬，當(dāng)Rs＝1.2時(shí)，通常認(rèn)為基本上達(dá)到了分離要求。6、分離及純化4）根據(jù)分子大小的建立純化方法

a.膠過(guò)濾(層析)法

(3)膠過(guò)濾中膠的用量（與樣品體積有關(guān)）上樣體積嚴(yán)格限制在柱體積的5％，過(guò)多影響分離效果。

(4)其它有關(guān)問(wèn)題(樣品，洗脫液，膠的再生與保存）分子大小相近的無(wú)法有效分開(kāi)洗脫流速過(guò)快過(guò)慢均不利于不同分子分開(kāi)，條件一定時(shí)以適當(dāng)慢些有利于分離。為減少非特異性吸附，洗脫液中適當(dāng)增加離子強(qiáng)度。柱長(zhǎng)度增加有利于提高分離效果6、分離及純化4）根據(jù)分子大小的建立純化方法

a.膠過(guò)濾(層析)法膠過(guò)濾法的特點(diǎn):

不受pH、鹽和溫度等的影響，操作條件溫和、簡(jiǎn)便，勿需特殊的再生處理，適于各種分子的分離。6、分離及純化4）根據(jù)分子大小的建立純化方法

b.篩膜分離法原理:篩膜分離法也即超過(guò)濾分離法，它是利用微孔超濾膜僅能選擇性地透過(guò)一定大小的分子而達(dá)到分離目的一類(lèi)方法。特點(diǎn):它操作比較簡(jiǎn)單，條件也溫和，但是只能達(dá)到粗分的要求。6、分離及純化4）根據(jù)分子大小的建立純化方法

c.超離心分離法原理:這是利用樣品中不同大小的分子在相對(duì)離心力場(chǎng)達(dá)80，000一250，000g的條件下分布不同而進(jìn)行分離純化的一種方法。應(yīng)用:此法主要用于病毒、細(xì)胞顆粒體等的制備，對(duì)分子量較小的酶或蛋白質(zhì)分離效果一般不佳，分辨率不高而且費(fèi)時(shí)。6、分離及純化5）根據(jù)解離電學(xué)性質(zhì)的特點(diǎn)建立的純化方法（1）吸附交換(層析)法;

（2）電泳法;

（3）聚焦層析法。6、分離及純化5）根據(jù)解離電學(xué)性質(zhì)的特點(diǎn)建立的純化方法

（1）吸附交換(層析)法最常用的一類(lèi)純化方法原理:利用待純化樣品中不同的分子和吸附劑間的吸附與解吸性質(zhì)的不同而達(dá)到分離。這類(lèi)分離或以靜態(tài)吸附方式進(jìn)行，或以層析吸附方式進(jìn)行。過(guò)程:有三個(gè)主要環(huán)節(jié)：加樣吸附、洗滌和洗脫。實(shí)際上每一個(gè)環(huán)節(jié)都包含目的酶和雜蛋白的分離，因此是一種十分有效的純化方法。吸附交換分離法原理示意6、分離及純化5）根據(jù)解離電學(xué)性質(zhì)的特點(diǎn)建立的純化方法

（1）吸附交換(層析)法吸附劑根據(jù)吸附機(jī)制的不同可分為三種類(lèi)型：

a.“傳統(tǒng)”的物理吸附劑：白土、氧化鋁和磷酸鈣膠等

b.羥基磷灰石;c.離子交換吸附劑。6、分離及純化5）根據(jù)解離電學(xué)性質(zhì)的特點(diǎn)建立的純化方法

（1）吸附交換(層析)法

離子交換吸附原理：這類(lèi)吸附是在蛋白質(zhì)的解離基團(tuán)與離子交換劑的解離基團(tuán)之間的解離交換過(guò)程中進(jìn)行的。由于各種蛋白質(zhì)和離子交換劑在不同條件下有相應(yīng)不同的解離狀態(tài)，因此通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)慕粨Q劑、控制交換和洗脫條件，就可將酶和雜蛋白分離開(kāi)來(lái)。6、分離及純化5）根據(jù)解離電學(xué)性質(zhì)的特點(diǎn)建立的純化方法

（1）吸附交換(層析)法

離子交換吸附按離子交換基團(tuán)分類(lèi)陰離子交換劑：帶陽(yáng)電荷解離基的交換劑在離子交換過(guò)程中能吸附陰電荷的離子陽(yáng)離子交換劑：帶陰電荷解離基的交換劑可對(duì)付陽(yáng)電荷離子6、分離及純化5）根據(jù)解離電學(xué)性質(zhì)的特點(diǎn)建立的純化方法

（1）吸附交換(層析)法

離子交換吸附離子交換劑的選擇依據(jù)：首先是待分離酶（或蛋白）的穩(wěn)定性；其次是強(qiáng)型和弱型交換劑的選擇；第三是交換容量；第四是流速，纖維素柱的流速一般低于凝膠。6、分離及純化5）根據(jù)解離電學(xué)性質(zhì)的特點(diǎn)建立的純化方法

（1）吸附交換(層析)法

離子交換吸附待分離酶(或蛋白)的穩(wěn)定性的選擇

(i)如果待分離的酶在低于其pI的pH條件下穩(wěn)定，則可選用陽(yáng)離子交換劑;(ii)如果待分離的酶在高于其pI的pH條件下穩(wěn)定，則采用陰離子交換劑;(iii)如果待分離的酶在高于和低于其pI的pH條件下都穩(wěn)定，則兩種交換劑都可以考慮。6、分離及純化5）根據(jù)解離電學(xué)性質(zhì)的特點(diǎn)建立的純化方法

（1）吸附交換(層析)法

離子交換吸附優(yōu)點(diǎn)：是目前僅次于鹽析的一種常用的純化方法適用面廣，幾乎所有的蛋白都可用此法分離其次是它具有很高的分辨率和回收率。6、分離及純化5）根據(jù)解離電學(xué)性質(zhì)的特點(diǎn)建立的純化方法

（2）電泳分離法原理：這是根據(jù)各種蛋白質(zhì)解離、電學(xué)性質(zhì)上的差異，利用它們?cè)陔妶?chǎng)中的遷移方向與遷移速度不同而進(jìn)行純化的一類(lèi)方法。特點(diǎn)：這類(lèi)方法可以達(dá)到很高的分辨效果，但在實(shí)驗(yàn)放大和樣品回收方面有一定困難，因此目前主要用于蛋白質(zhì)的分析和小規(guī)模制備。聚丙烯酰胺凝膠電泳6、分離及純化5）根據(jù)解離電學(xué)性質(zhì)的特點(diǎn)建立的純化方法

（2）電泳分離法原理：這是根據(jù)各種蛋白質(zhì)解離、電學(xué)性質(zhì)上的差異，利用它們?cè)陔妶?chǎng)中的遷移方向與遷移速度不同而進(jìn)行純化的一類(lèi)方法。特點(diǎn)：這類(lèi)方法可以達(dá)到很高的分辨效果，但在實(shí)驗(yàn)放大和樣品回收方面有一定困難，因此目前主要用于蛋白質(zhì)的分析和小規(guī)模制備。聚丙烯酰胺凝膠電泳1234116kD66kD45kD35kD25kD18.4kD14.4kD98.8kDSDS6、分離及純化5）根據(jù)解離電學(xué)性質(zhì)的特點(diǎn)建立的純化方法

（3）等電聚焦電泳這是利用兩性電解質(zhì)載體--一種多乙烯多胺與丙烯酸加合反應(yīng)得到的同系多異構(gòu)體混合物，它們具有相近的pK值與pI值，在電場(chǎng)作用下能形成連續(xù)平滑的pH梯度，待分離樣品中各組份在電泳過(guò)程中，又能按照各自的等電點(diǎn)聚焦到相應(yīng)的pH梯度位置上從而達(dá)到分離目的。等電聚焦圖譜6、分離及純化6）根據(jù)專(zhuān)一的親和作用建立的純化方法親和層析法、親和電泳法。（1）親和層析法親和層析法是據(jù)生物分子間某種特有的親和力而建立的一種新型純化方法。原理：酶和它的底物(包括輔助因子)、底物類(lèi)似物或競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑通常都具有較高的親和力，能專(zhuān)一而可逆地形成酶—配基絡(luò)合物。因此，如果將這類(lèi)配基偶聯(lián)固定于樣品中，那么就能迅速而有選擇性地將相應(yīng)的酶分子從溶液中分離出來(lái)，達(dá)到和其它雜蛋白分離的目的，這就是親和吸附。6、分離及純化6）根據(jù)專(zhuān)一的親和作用建立的純化方法親和層析法、親和電泳法。（2）親和電泳法親和電泳法是將親和層析和聚丙烯酰胺膠電泳結(jié)合在一起的高分子分離分析方法。原理：當(dāng)相應(yīng)的親和配基共價(jià)偶聯(lián)于電泳膠(即載體，通常多用聚丙烯酰胺)上以后，由于具有親和作用的待分離分析成份和配基具有結(jié)合力，在電泳過(guò)程中不會(huì)移動(dòng)，不具親和性的成份將按各自的電泳速度而分離開(kāi)來(lái)

6、分離及純化7）結(jié)晶所謂結(jié)晶，是指分子通過(guò)氫鍵、離子鍵或分子間力，按規(guī)則且周期性排列的一種固體形式。

由于各種分子形成結(jié)晶的條件不同，也由于變性的蛋白質(zhì)和酶不能形成結(jié)晶，因此，結(jié)晶既是一種酶是否純凈的標(biāo)志，也是一種酶和雜蛋白分離純化的手段。酶的結(jié)晶過(guò)程進(jìn)行得很慢，需要數(shù)天或數(shù)星期。6、分離及純化7）結(jié)晶結(jié)晶方法：(1)鹽析結(jié)晶(2)有機(jī)溶劑結(jié)晶(3)透析平衡結(jié)晶(4)等電點(diǎn)結(jié)晶6、分離及純化7）結(jié)晶為了獲得純凈、粒大、收得率高的結(jié)晶應(yīng)注意：

(1)酶溶液應(yīng)該達(dá)到相當(dāng)?shù)募兌瘸松贁?shù)例外，不純的溶液是不能得到結(jié)晶的。

(2)酶的濃度要恰到好處一般以1-5％為宜，不宜小于0.2％，濃度高雖然較易結(jié)晶，但如果過(guò)于飽和，只能獲得大量微晶，難以形成大晶體。三、酶分離純化技術(shù)7、脫鹽(1)分子篩(2)透析(3)超濾三、酶分離純化技術(shù)8、濃縮與干燥濃縮真空濃縮(2)干燥方法真空干燥冷凍干燥噴霧干燥氣流干燥三、酶分離純化技術(shù)9、保存通常將純化后的酶溶液經(jīng)透析除鹽后冷凍干燥得到酶粉，低溫下可較長(zhǎng)時(shí)期保存。也可將酶溶液制成25％甘油或50％甘油分別貯于-25℃或-50℃冰箱中保存。注意：酶蛋白濃度過(guò)稀和過(guò)濃，均不利于蛋白穩(wěn)定，應(yīng)保持在一定的蛋白濃度范圍為好。四、酶分離和純化的注意事項(xiàng)

1.在過(guò)濾或攪拌等操作過(guò)程中，要防止泡沫的生成，以避免酶蛋白在溶液的表面變性。

2.重金屬離子對(duì)某些酶的破壞作用，在提取液中加入少量金屬鏊合劑EDTA。

3.有些含巰基的酶在分離時(shí)，往往需要加入某種巰基試劑，如巰基乙醇、二硫蘇糖醇(DTT)等，可防止酶的巰基在制備過(guò)程中被氧化。

4.為了防止內(nèi)源蛋白酶對(duì)酶的水解，在提取液加入少量蛋白酶抑制劑。四、酶分離和純化的注意事項(xiàng)

5.大多數(shù)酶在pH<4或pH>10的情況下不穩(wěn)定，分離純化系統(tǒng)不能過(guò)酸過(guò)堿；同時(shí)要避免在調(diào)整pH時(shí)產(chǎn)生局部酸堿過(guò)量的現(xiàn)象。

6.防止酶變性失活，尤其是在純化的后期；理論上說(shuō)，凡是用于蛋白質(zhì)分離純化的一切方法都同樣適用于酶。

7.通過(guò)檢測(cè)酶活性可以跟蹤酶的去向，為酶的分離純化提供依據(jù)。

8.在酶的制備過(guò)程中，每一步驟都應(yīng)測(cè)定留用以及準(zhǔn)備棄去部分中所含酶的總活力和比活力，了解每一步酶的回收率，純化倍數(shù)，從而決定這一步的取舍。第二節(jié)酶的純度和產(chǎn)量一、酶活力測(cè)定1．酶活力酶活力是指酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的能力。酶活力的大小可以用在一定條件下所催化的某一化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速率來(lái)表示：酶催化的反應(yīng)速率愈大，酶的活力愈高；反應(yīng)速率愈小，酶的活力就愈低,兩者呈線(xiàn)性關(guān)系。測(cè)定酶的活力就是測(cè)定酶促反應(yīng)的速率第二節(jié)酶的純度和產(chǎn)量一、酶活力測(cè)定1．酶活力酶催化的反應(yīng)速率可用單位時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來(lái)表示。在實(shí)際酶活測(cè)定中一般以測(cè)定產(chǎn)物的增加量為準(zhǔn)。

V=[p]/t[p]=vt第二節(jié)酶的純度和產(chǎn)量一、酶活力測(cè)定1．酶活力引起酶促反應(yīng)速率降低的原因(1)底物濃度的降低(2)產(chǎn)物濃度增加加速了逆反應(yīng)的進(jìn)行(3)產(chǎn)物對(duì)酶的抑制或激活作用(4)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)引起酶本身部分分子失活等因此測(cè)定酶活力，應(yīng)測(cè)定酶促反應(yīng)的初速率，反應(yīng)初速率與酶量呈線(xiàn)性關(guān)系，因此可以用初速率來(lái)測(cè)定制劑中酶的含量。第二節(jié)酶的純度和產(chǎn)量一、酶活力測(cè)定2．酶的活力單位(U，activityunit)

國(guó)際酶活力單位

1961年國(guó)際生物化學(xué)協(xié)會(huì)酶學(xué)委員會(huì)提出采用統(tǒng)一的“國(guó)際單位”(IU)來(lái)表示酶活力，規(guī)定為：在最適反應(yīng)條件(溫度25℃)下，每分鐘內(nèi)催化1微摩爾(μmo1)底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量，定為一個(gè)酶活力單位，即

1IU=1μmol／min第二節(jié)酶的純度和產(chǎn)量一、酶活力測(cè)定2．酶的活力單位(U，activityunit)1972年國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)又推薦一種新的酶活力國(guó)際單位，即Katal(簡(jiǎn)稱(chēng)Kat)單位，規(guī)定為：在最適條件下，每秒鐘能催化1摩爾(mo1)底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量，定為1Kat單位(1Kat=1mol·s-1)。

Kat單位與IU單位之間的換算關(guān)系如下：

1Kat=60×106IU1IU=1／60μKat=16.7nKat第二節(jié)酶的純度和產(chǎn)量一、酶活力測(cè)定2．酶的活力單位(U，activityunit)

酶的活力通常采用國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)規(guī)定的單位表示，但是在純化工作中，為了方便，也可采用自行規(guī)定的單位，如直接以光密度值表示。第二節(jié)酶的純度和產(chǎn)量一、酶活力測(cè)定

3．酶活力的測(cè)定方法測(cè)定酶活力就是測(cè)定產(chǎn)物增加量或底物減少量，主要根據(jù)產(chǎn)物或底物的物理或化學(xué)特性來(lái)決定具體酶促反應(yīng)的測(cè)定方法，最常用的方法介紹如下：

(1)分光光度法

(2)熒光法

(3)同位素測(cè)定方法

(4)電化學(xué)法第二節(jié)酶的純度和產(chǎn)量一、酶活力測(cè)定

3．酶活力的測(cè)定方法電化學(xué)法（electrochemical）pH測(cè)定法：用高靈敏度的pH計(jì)，跟蹤反應(yīng)過(guò)程中H+變化的情況，用pH的變化來(lái)測(cè)定酶的反應(yīng)速率。離子選擇電極法：測(cè)定某些酶的酶活力，用氧電極可以測(cè)定一些耗氧的酶反應(yīng)，如葡糖氧化酶的活力就可用這個(gè)方法很方便地測(cè)定。第二節(jié)酶的純度和產(chǎn)量一、酶活力測(cè)定

4.如何進(jìn)行酶的活力測(cè)定

(1)如果待分離的酶已有報(bào)導(dǎo)，可參考它所采用的測(cè)定方法和條件；

(2)如果需要另建新的測(cè)定系統(tǒng)，那么就得先對(duì)該酶的作用、動(dòng)力學(xué)性質(zhì)等有所了解，據(jù)此來(lái)選擇合適的底物和底物濃度、以及最適的反應(yīng)pH和溫度等，同時(shí)確定一種相應(yīng)的測(cè)定方法。第二節(jié)酶的純度和產(chǎn)量一、酶活力測(cè)定

5．測(cè)酶活時(shí)的注意事項(xiàng)一是測(cè)定用的酶反應(yīng)時(shí)間應(yīng)選擇在酶反應(yīng)的初速度范圍內(nèi)；二是測(cè)定用的酶量必須和測(cè)得的活性有線(xiàn)性關(guān)系。第二節(jié)酶的純度和產(chǎn)量一、酶活力測(cè)定

6．測(cè)蛋白含量常用的方法

(1)紫外吸收法，此法簡(jiǎn)便快速，不損耗樣品，但干擾因素很多；c(mg/mL)=1.55A280-0.76A260

(2)雙縮脲法,較簡(jiǎn)單；

(3)酚試劑法,較復(fù)雜，但靈敏度、準(zhǔn)確度都比較高；

(4)凱氏定氮法；

(5)考馬斯亮藍(lán)比色法。第二節(jié)酶的純度和產(chǎn)量二、純化方法與條件的比較標(biāo)準(zhǔn)

總活力－－－酶的得率或回收率（y）比活力－－－純度的提高倍數(shù)（e）如有多種方法可供選擇時(shí)，一般采用下式進(jìn)行權(quán)衡：

loge＝logE·logy／logYe和y分別表示用某種方法或條件進(jìn)行一次純化后純度的提高與回收率；G和Y分別表示用上述方法或條件重復(fù)多次后總的純度提高與總的回收率，這兩項(xiàng)是推算出來(lái)的。第二節(jié)酶的純度和產(chǎn)量三、純度的標(biāo)準(zhǔn)了解所獲得的酶蛋白是否均一純凈需進(jìn)行純度鑒定。有以下幾種方法:1.溶解度法這是老方法，由于所需樣品量較大，已很少采用

2.電泳法常用的有醋酸纖維素薄膜電泳、聚丙烯酰胺不連續(xù)膠電泳和聚焦膠電泳，特別是后二者有極高的分辨力。第二節(jié)酶的純度和產(chǎn)量三、純度的標(biāo)準(zhǔn)

3.超離心法在高達(dá)65，000rpm的離心力場(chǎng)情況下觀測(cè)離心譜帶，根據(jù)沉降峰帶是否分裂、是否有“肩”、是否對(duì)稱(chēng)等可以作出均一與否的判斷。

4.免疫學(xué)法純化的酶樣品在瓊脂膠上與相應(yīng)的抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，根據(jù)得到的沉降線(xiàn)可以判斷樣品的純度。如果此法以免疫電泳的方式進(jìn)行，則更為靈敏。第三節(jié)酶的劑型與保存

為適應(yīng)各種需要，并考慮到經(jīng)濟(jì)和應(yīng)用效果，酶制劑常以四種劑型供應(yīng)：

1.液體酶制劑；

2.固體粗酶制劑；

3.純酶制劑；

4.固定化酶制劑第三節(jié)酶的劑型與保存一、液體酶制劑制備：這包括