飼料及飼料原料中T-2毒素的快速篩查 膠體金快速定量法

飼料及飼料原料中T-2毒素的快速篩查膠體金快速定量法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用膠體金免疫層析法快速篩查測(cè)定飼料及飼料原料中T-2毒素，為定量篩查方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于大麥，玉米，玉米蛋白粉，燕麥，高粱，大豆粉，小麥等原料及飼料中T-2毒素的快速定量篩查。檢測(cè)限為50μg/kg(ppb)，檢測(cè)范圍為50μg/kg(ppb)-10000μg/kg(ppb)。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T20195動(dòng)物飼料試樣的制備GB/T27404實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)原理本方法應(yīng)用了免疫層析原理。試樣提取液中的T-2毒素與檢測(cè)條中膠體金微粒發(fā)生反應(yīng)，T-2毒素與膠體金微粒的結(jié)合物以及膠體金微粒在側(cè)流作用下移動(dòng)，當(dāng)?shù)竭_(dá)檢測(cè)線(xiàn)時(shí)，檢測(cè)上包被的抗原與膠體金微粒結(jié)合發(fā)生呈色反應(yīng)，顏色深淺與試樣中T-2毒素含量相關(guān)。用讀數(shù)儀測(cè)定檢測(cè)條上檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)顏色深淺，根據(jù)顏色深淺和讀數(shù)儀內(nèi)置曲線(xiàn)計(jì)算出試樣中T-2毒素含量。試劑和材料除非另有說(shuō)明，本法所用試劑均為分析純，水為去離子水，符合GB/T6682二級(jí)水的規(guī)定。膠體金免疫層析快速篩查組件（參見(jiàn)附錄A）。T-2毒素檢測(cè)試紙條：符合附錄A規(guī)定的檢測(cè)條產(chǎn)品，技術(shù)要求參考GB/T27404，按說(shuō)明書(shū)要求冷藏保存。稀釋緩沖液：與膠體金檢測(cè)條配套提供，或按照其說(shuō)明書(shū)配制。提取液：70%（v/v）甲醇溶液或膠體金檢測(cè)條配套的提取液。儀器和設(shè)備天平:分度值0.01g。粉碎機(jī)：可使試樣粉碎后全部通過(guò)20目篩。離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于4000r/min。渦旋振蕩器。孵育器：可調(diào)節(jié)時(shí)間、溫度,控溫精度±1℃。讀數(shù)儀：可測(cè)定并顯示膠體金定量檢測(cè)條的測(cè)定結(jié)果。試樣制備與保存試樣制備按GB/T20195要求制備試樣。試樣保存將試樣于-10℃～-20℃下避光保存。分析步驟樣品提取取有代表性的樣品500g，粉碎機(jī)（5.2）粉碎至全部通過(guò)20目篩,混勻。準(zhǔn)確稱(chēng)取10.00g試樣于100mL具塞錐形瓶中，加入20.0mL試樣提取液（4.2），密閉，用渦旋振蕩器（5.4）振蕩1min～2min，靜置后用濾紙過(guò)濾，或取1mL～1.5mL混合液于離心管中，用離心機(jī)（4000r/min）（5.3）離心至少10秒。取濾液或離心后上清液100μL于另一離心管中，加入1.0mL稀釋緩沖液（4.1.2），充分混勻待測(cè)。不同廠家的T-2毒素膠體金快速定量條所用的樣品制備方法不同，如提供T-2毒素膠體金快速定量檢測(cè)條使用說(shuō)明，則按照使用說(shuō)明中規(guī)定的方法進(jìn)行操作。樣品測(cè)定將T-2毒素膠體金檢測(cè)條（4.1.1）從冷藏狀態(tài)（2℃-8℃）取出放置至室溫。將孵育器（5.5）預(yù)熱至孵育溫度45℃。將檢測(cè)條（5.7）平放在孵育器（5.5）凹槽中，打開(kāi)加樣槽。準(zhǔn)確移取300μL待測(cè)溶液（7.1.2），加入檢測(cè)條加樣孔中，關(guān)閉孵育器（5.5）蓋。孵育10min后，取出檢測(cè)條（4.1.1）觀察質(zhì)控線(xiàn)和檢測(cè)線(xiàn)顯色情況，必須出現(xiàn)清晰齊整的質(zhì)控線(xiàn)即C線(xiàn)。若出現(xiàn)下述情況，視為檢測(cè)條無(wú)效：C線(xiàn)（質(zhì)控線(xiàn)）不出現(xiàn)、彌散或嚴(yán)重不均勻；T1或T2線(xiàn)（檢測(cè)線(xiàn)）嚴(yán)重不均勻；待測(cè)溶液掩蓋或模糊了T1、T2線(xiàn)或C線(xiàn)；膠體金顯色微粒沒(méi)有通過(guò)T1、T2線(xiàn)或C線(xiàn)。無(wú)效的檢測(cè)條（4.1.1）不要放入讀數(shù)儀（5.6）進(jìn)行測(cè)定。選取讀數(shù)儀（5.6）T-2毒素檢測(cè)頻道中“基質(zhì)00”（MATRIX00）樣品測(cè)定類(lèi)型進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定需在2min內(nèi)完成，讀數(shù)儀（5.6）顯示樣品中T-2毒素的含量。若讀數(shù)儀（5.6）顯示“+250”，需將樣品稀釋后，讀數(shù)儀（5.6）設(shè)定為“基質(zhì)01”（MATRIX01）樣品測(cè)定類(lèi)型重新進(jìn)行測(cè)定。稀釋方法為：移取100μL稀釋提取液（7.1.2）于離心管中，加入1.0mL稀釋緩沖液后混勻，按7.2.1-7.2.4重新測(cè)定。結(jié)果表述T-2毒素含量以微克每千克（μg/kg，等同于ppb）表示，由讀數(shù)儀直接顯示和讀取。重復(fù)性在同一實(shí)驗(yàn)室，由同一操作者使用相同儀器，按相同的測(cè)定方法，并在短時(shí)間內(nèi)對(duì)同一被測(cè)試對(duì)象相互獨(dú)立進(jìn)行測(cè)試獲得的兩次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值大于算術(shù)平均值20%的情況不超過(guò)5%。

（資料性附錄）

膠體金免疫層析快速篩查組件試劑配制與技術(shù)要求樣本稀釋液配制（根據(jù)說(shuō)明書(shū)填寫(xiě)）磷酸二氫鉀0.2g十二水合磷酸氫二鈉2.9g氯化鈉8.0g氯化鉀0.2gTween-200.5mL加水定容至1000mL?；疽蠊ぷ鳝h(huán)境要求氣溫：23℃～25℃?？乖骉-2毒素半抗原與載體蛋白進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)，能夠達(dá)到包被要求?？贵w要求用T-2毒素抗原免疫小鼠，制備針對(duì)T-2的特異性單克隆抗體，能夠達(dá)到檢測(cè)要求。原材料要求樣品墊：玻璃纖維或無(wú)紡布。金釋放墊：玻璃纖維片，免疫金釋放時(shí)間小于10min，釋放效率大于90%。反應(yīng)膜：硝酸纖維素膜，孔徑為0.45μm，4cm浸潤(rùn)時(shí)間不小于140s。吸水紙。塑料卡盒：丙烯腈、丁二烯和苯乙烯的三元共聚物。準(zhǔn)確度采用100μg/kg（100ppb）、500μg/kg（500ppb）和1000μg/kg（1000ppb）三個(gè)濃度水平的陽(yáng)性樣品，每個(gè)濃度水平測(cè)定不低于6次，通過(guò)偏差來(lái)表達(dá)，3個(gè)濃度水平的偏差均應(yīng)控制在-20%～+20%之間。精密度采用100μg/kg（100ppb）濃度水平的實(shí)際樣品，測(cè)定不低于6次，通過(guò)批內(nèi)變異系數(shù)來(lái)表達(dá)，變異系數(shù)應(yīng)≤20%。檢測(cè)限計(jì)算20份陰性樣品測(cè)定均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差，其結(jié)果應(yīng)小于或等于產(chǎn)品靈敏度標(biāo)示值。批間穩(wěn)定性采用100μg/kg（100ppb）左右濃度水平的陽(yáng)性樣品，不得低于6個(gè)批次，每個(gè)批次測(cè)定不低于2次，批內(nèi)測(cè)定