醫(yī)用供體豬基因鑒定通則

1DBXX/TXXXX—XXXX醫(yī)用供體豬基因鑒定通則本文件規(guī)定了醫(yī)用供體豬基因鑒定的總體原則及鑒定方法。本文件適用于醫(yī)用供體豬的生產(chǎn)、引種、交付過(guò)程中基因鑒定?；蛐揎梽?dòng)物的基因鑒定可參考本文件。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T19495.4-2004轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)核酸定性PCR檢測(cè)方法GB/T19495.7轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)抽樣和制樣GB/T30989高通量基因測(cè)序技術(shù)規(guī)程GB/T33681.1高通量基因測(cè)序樣本預(yù)處理方法第1部分：動(dòng)物組織樣本預(yù)處理GB/T35537高通量基因測(cè)序結(jié)果評(píng)價(jià)要求GB/T38477基因表達(dá)的測(cè)定蛋白印跡法3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1醫(yī)用供體豬medicaldonorpigs通過(guò)生物工程技術(shù)獲得，用于提供醫(yī)療用途的活器官或生物材料制備的低免疫原性豬及其群體。3.2基因修飾geneticmodification利用生物化學(xué)方法修改生物遺傳物質(zhì)，使生物產(chǎn)生新性狀，修飾方式主要包括轉(zhuǎn)基因、基因編輯介導(dǎo)的基因定點(diǎn)插入和基因敲除3種。注：醫(yī)用供體豬常見(jiàn)基因修飾名稱及種類(lèi)見(jiàn)附錄A。3.3基因整合geneintegration將特定基因片段導(dǎo)入宿主基因組內(nèi)的基因修飾方法，包括轉(zhuǎn)基因和基因定點(diǎn)插入。3.4基因敲除knockout將特定基因片段從基因組中去除的基因修飾方式。3.5基因修飾穩(wěn)定性檢測(cè)geneticmodificationstabilitytest通過(guò)連續(xù)檢測(cè)不同代數(shù)基因修飾動(dòng)物基因型、基因表達(dá)情況來(lái)評(píng)估基因修飾在動(dòng)物群體中遺傳穩(wěn)定、及表達(dá)穩(wěn)定的手段。2DBXX/TXXXX—XXXX3.6基因組結(jié)構(gòu)變異structuralvariants；SVs在醫(yī)用供體豬獲得過(guò)程中，基因組上發(fā)生長(zhǎng)片段（>50bp）的序列變化和位置關(guān)系變化。注：基因組結(jié)構(gòu)變異包括長(zhǎng)片段序列插入或刪除、串3.7脫靶off-target與靶標(biāo)不同的基因組位置和/或核酸序列。[來(lái)源：ISO5058:1-2021，3.1.4]3.8高通量測(cè)序high-throughputsequencing以一次并行幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條核酸分子序列測(cè)定和一般讀長(zhǎng)較短等為標(biāo)志，適用于DNA的測(cè)序技術(shù)。[來(lái)源：35890-2018，3.1]4總體原則基因鑒定是醫(yī)用供體豬制備過(guò)程中重要組成環(huán)節(jié)，醫(yī)用供體豬制備、篩選、交付等過(guò)程應(yīng)對(duì)其進(jìn)行基因鑒定。因其用途的特殊性，醫(yī)用供體豬基因鑒定應(yīng)同時(shí)考慮安全性和有效性，降低因基因修飾技術(shù)引入的不可控因素。安全性和有效性評(píng)價(jià)應(yīng)結(jié)合設(shè)計(jì)預(yù)期、基因修飾類(lèi)型進(jìn)行綜合評(píng)估，鑒定項(xiàng)目可參考表1。表1醫(yī)用供體豬基因鑒定評(píng)價(jià)項(xiàng)目123455鑒定項(xiàng)目及方法5.1有效性評(píng)價(jià)5.1.1基因型鑒定鑒定方法樣本DNA提取可選用符合要求的商業(yè)化試劑盒進(jìn)行提取，也可由實(shí)驗(yàn)室自建方法提取。引物設(shè)計(jì)應(yīng)在目標(biāo)基因（擬整合基因/敲除基因靶位）上下游設(shè)計(jì)引物，參考序列可在NCBI上獲取。樣本DNA提取后，進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，符合質(zhì)量要求的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，觀察目標(biāo)條帶判定是否符合3DBXX/TXXXX—XXXX預(yù)期。判定基因整合見(jiàn)a）。判定目標(biāo)基因的是否敲除，應(yīng)將符合預(yù)期的條帶回收，進(jìn)行Sanger測(cè)序（見(jiàn)b。注：基因整合鑒定示例見(jiàn)附錄BLEA29Y基因有效性檢測(cè)方法基因型鑒定部分結(jié)果判定a)出現(xiàn)目標(biāo)條帶，則判定基因整合有效。b)目標(biāo)片段測(cè)序結(jié)果和參考序列比對(duì)，靶位產(chǎn)生不為3的倍數(shù)堿基的插入和缺失,則判定基因敲除有效。5.1.2基因表達(dá)檢測(cè)方法選取與目標(biāo)蛋白相結(jié)合的特異抗體對(duì)醫(yī)用供體豬組織、細(xì)胞水平進(jìn)行蛋白檢測(cè)?？刹捎玫鞍酌庖哂≯E法、免疫組化/免疫熒光、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)等方法進(jìn)行檢測(cè)。建議根據(jù)不同生產(chǎn)工藝選擇合適的檢測(cè)方法，蛋白免疫印跡法可作為基礎(chǔ)方法選用，蛋白免疫印跡法檢測(cè)及判定方法可參考GB/T38477。蛋白免疫印跡、免疫組化（熒光）、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)檢測(cè)示例見(jiàn)附錄BLEA29Y基因有效性檢測(cè)方法基因表達(dá)鑒定部分。流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)檢測(cè)示例見(jiàn)附錄CGGTA1有效性檢測(cè)基因表達(dá)鑒定部分。蛋白免疫印跡法結(jié)果判定a)成像圖片本底干凈，能觀察到轉(zhuǎn)印膜均勻的輕微背景輪廓，目標(biāo)條帶清晰且不過(guò)曝，即可判定目標(biāo)蛋白表達(dá)。b)基因整合類(lèi)應(yīng)有目標(biāo)基因蛋白表達(dá)，敲除類(lèi)應(yīng)無(wú)目標(biāo)基因蛋白表達(dá)。5.2遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)5.2.1通用要求醫(yī)用供體豬自然繁育進(jìn)行擴(kuò)大化培養(yǎng)時(shí)應(yīng)符合封閉群或近交系的育種方式，同時(shí)應(yīng)檢測(cè)基因遺傳穩(wěn)定性。5.2.2檢測(cè)方法醫(yī)用供體豬群體每代個(gè)體均應(yīng)進(jìn)行基因型鑒定和基因表達(dá)檢測(cè)，方法見(jiàn)5.1，應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)3代以上。5.2.3結(jié)果分析醫(yī)用供體豬基因型鑒定及基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果符合基因分離定律和自由組合定律，則認(rèn)為具有遺傳穩(wěn)定性。5.3安全性評(píng)價(jià)5.3.1染色體結(jié)構(gòu)變異和脫靶檢測(cè)在基因修飾過(guò)程中，存在染色體結(jié)構(gòu)變異和基因修飾脫靶的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)對(duì)原代個(gè)體進(jìn)行染色體結(jié)構(gòu)變異和脫靶檢測(cè)，評(píng)價(jià)安全性。4DBXX/TXXXX—XXXX采集醫(yī)用供體豬基因修飾前后的血液或組織進(jìn)行高通量測(cè)序，獲取醫(yī)用供體豬基因組序列信息，進(jìn)行生物信息學(xué)分析。樣本處理參照GB/T33681.1的要求執(zhí)行，測(cè)序方法參照GB/T30989進(jìn)行，測(cè)序質(zhì)量控制參照GB/T35537執(zhí)行。5.3.2結(jié)果分析a)染色體結(jié)構(gòu)變異基因修飾前后，除基因修飾位點(diǎn)外，染色體其他區(qū)域基因序列無(wú)差異，醫(yī)用供體豬基因組未發(fā)生非預(yù)期基因片段插入、序列缺失、倒置、異位，則認(rèn)為在醫(yī)用供體豬制備過(guò)程中未引入基因安全風(fēng)險(xiǎn)。b)脫靶檢測(cè)使用Cas-OFFinder（CRISPRRGENTools()）或類(lèi)似算法模型工具，在豬基因組參考序列內(nèi)匹配脫靶風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)，允許sgRNA的靶標(biāo)序列存在1個(gè)～4個(gè)錯(cuò)配，醫(yī)用供體豬脫靶各風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)序列信息和基因組參考序列一致，則認(rèn)為沒(méi)有脫靶，反之則存在脫靶風(fēng)險(xiǎn)。5DBXX/TXXXX—XXXX（資料性）醫(yī)用供體豬常見(jiàn)基因名及修飾類(lèi)型humandominant-negativehumanectonucleosidetriphosphate[來(lái)源：ReichartB,CooperDKC,L?nginM,T?njesRR,PiersonRN,WolfE.Cardiacxenotransplantation:fromconcepttoclinic.CardiovascRes.2023Feb3;118(18):3499-3516.doi:10.1093/cvr/cvac180.PMID:36461918;PMCID:PMC9897693.]6DBXX/TXXXX—XXXX（資料性）LEA29Y基因整合有效性檢測(cè)方法B.1LEA29Y基因型鑒定B.1.1原理以LEA29Y基因?yàn)榘形稽c(diǎn)，設(shè)計(jì)上下游引物，進(jìn)行PCR檢測(cè)。B.1.2樣品準(zhǔn)備B.1.2.1樣品種類(lèi)豬耳組織、血液等B.1.2.2樣品采集耳樣采集：在豬出生后盡快采集豬只耳樣，以便及時(shí)獲得新生豬基因型信息。采集耳樣前，采樣工具及采樣部位做好消毒，使用耳標(biāo)鉗在豬耳朵上剪下耳組織，將耳組織放入1.5mL離心管中用于下一步基因組提取。血液采集：使用紫色采血管，采集豬全血3-5mL，采樣前將豬只保定好，行豬頸靜脈采血術(shù)。B.1.2.3樣品處理使用基因組DNA提取試劑盒（簡(jiǎn)石生物，TD468），提取樣品總DNA。用于下一步的PCR實(shí)驗(yàn)。對(duì)于耳組織樣品，提取總DNA前應(yīng)對(duì)其進(jìn)行研磨處理，已獲得更高的濃度的基因組DNA。對(duì)于全血樣本，應(yīng)首先進(jìn)行破紅處理，去除全血中無(wú)核的紅細(xì)胞后，提取白細(xì)胞總DNA，以提高基因組DNA質(zhì)量。B.1.3PCR反應(yīng)B.1.3.1引物設(shè)計(jì)針對(duì)LEA29Y基因序列，使用引物設(shè)計(jì)軟件或者網(wǎng)站設(shè)計(jì)特異性引物。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)引物序列如下：上游引物：5’-GTACCCACCGCCATACTACG-3’；下游引物：5’-GCGATGTCGCTGGGATAGAA-3’上下游引物位置及擴(kuò)增片段序列如下：7DBXX/TXXXX—XXXXB.1.3.2PCR反應(yīng)體系和程序表B.1PCR反應(yīng)體系組分名稱組分用量酶緩沖液KODBuffer2×上游引物0.5μL下游引物0.5μL酶KOD0.25μL模板100ng-500ngddH2O添加到20μL表B.2PCR反應(yīng)程序步驟溫度時(shí)間循環(huán)194℃2min1298℃10s；60℃30s；68℃30s；31按照表B.1配置PCR反應(yīng)體系，按照表B.2進(jìn)行PCR反應(yīng)程序。B.1.3.3PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定使用1%的瓊脂糖，電壓120V，電泳15-20分鐘，在凝膠成像系統(tǒng)中檢測(cè)。B.1.4結(jié)果判定如果泳道中出現(xiàn)573bp的條帶，則說(shuō)明PCR結(jié)果陽(yáng)性，LEA29Y基因整合到了改豬基因組上。如圖B.1所示，LEA29Y實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)573bp的條帶，而野生型對(duì)照組沒(méi)有出現(xiàn)573bp的條帶，說(shuō)明LEA29Y在DNA水平上整合成功。圖B.1LEA29YPCR鑒定結(jié)果B.2LEA29Y基因型表達(dá)鑒定B.2.1原理使用WesternBlot、免疫組化和免疫熒光等免疫學(xué)方法，利用LEA29Y蛋白與LEA29Y抗體的特異性結(jié)合，檢測(cè)抗體酶標(biāo)物或標(biāo)記熒光來(lái)間接鑒定LEA29Y的表達(dá)。B.2.2WesternBlot方法基因表達(dá)鑒定。8DBXX/TXXXX—XXXXB.2.2.1樣品準(zhǔn)備取適量豬胰腺組織樣品，加入100μlRIPA裂解液，冰上裂解30min。獲得胰腺組織蛋白液。用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)胰腺蛋白濃度。B.2.2.2WesternBlot實(shí)驗(yàn)按照如下步驟進(jìn)行WesternBlot實(shí)驗(yàn)：（1）蛋白上樣量為30ug，5根SDSloadingbuffer蛋白變性上樣緩沖液為蛋白樣品體積的1/4，100氣，10min使蛋白變性；（2）制備SDS分離膠和濃縮膠；（3）統(tǒng)一上樣30ug，將樣品加入SDS膠齒中。（4）恒壓60V電泳45min，后120V電泳1.5h；（5）PVDF膜用甲醇浸泡2min，ddH2O浸泡3min，1根TransferBuffe浸泡30min，濾紙和海綿直接置于1根TransferBuffe浸泡30min（6）將海綿、濾紙、凝膠、PVDF膜按順序放好，恒流200A電泳1.5h。（7）將膜取出于TBST緩沖液中清洗后，加入5%脫脂奶粉，室溫下?lián)u床上封閉2h;TBST緩沖液漂洗三次，每次5min;于5%脫脂奶粉稀釋的一抗溶液(1:1000)中4。C過(guò)夜;TBST緩沖液洗脫三次，每次5min;加入TBST稀釋的二抗(1:1500)室溫?fù)u床孵育1h;TBST緩沖液漂洗一次，每次5min。（8）辣根過(guò)氧化物顯色液2m1于膜上，Tanon5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀顯影。B.2.2.3結(jié)果判定圖B.2WesternBlot檢測(cè)結(jié)果示例圖如圖B.2所示，如果實(shí)驗(yàn)組在預(yù)期蛋白大小的位置出現(xiàn)了明顯條帶，而野生型對(duì)照組在該位置無(wú)條帶，則說(shuō)明改豬LEA29Y基因成功表達(dá)。B.2.3免疫組化和免疫熒光方法基因表達(dá)鑒定B.2.3.1試劑LEA29Y一抗，兔抗人IgG（Abcam，ab6759，USA)；胰島素一抗，鼠抗豬胰島素抗體（Abcam，ab7760，USA)；山羊抗兔鼠通用二抗(DA-KO,Denmark)；羊抗兔IgG(FITC)(Abcam，ab6717，USA)；羊抗鼠IgG(AlexaFluor勇594)(Abcam，ab150160，USA)；OCT包埋劑（ElectronMicroscopySciences，USA)B.2.3.2樣品準(zhǔn)備將采集的轉(zhuǎn)基因豬的胰腺組織在OCT（ElectronMicroscopySciences，Hatfield，PA，USA）中包埋并冷凍，并儲(chǔ)存在-70氣。用冰凍切片機(jī)作冷凍切片（6μm）用于免疫組化和免疫熒光染色。B.2.3.3免疫組化實(shí)驗(yàn)9DBXX/TXXXX—XXXX（1）固定:取出切片，室溫放置5mins。用4%的多聚甲醛PBS溶液室溫固定15mins，PBS沖洗次(沖洗可以采用側(cè)斜淋洗，也可至于平皿中搖晃)。打孔:如果是需要染細(xì)胞內(nèi)的蛋白，用曲拉通(TritonX-100)打孔:組織樣品浸于含0.25%TritonX-100的PBS中10mins，之后用PBS洗3次，每次5mins。如果是染膜蛋白的，不需要曲拉通打孔。（2）封閉:將組織置于含1%BSA的PBST溶液中30mins，封閉非特異性粘合的抗體。對(duì)于多聚甲醛固定并進(jìn)行免疫熒光的樣本，在封閉緩沖液中加入03mol/L的甘氨酸。（3）孵化:組織樣本浸于一抗(用含1%BSA的PBST稀釋)，放于濕盒中，室溫1h或4C過(guò)夜用PBS洗3次每次5mins。浸入二抗(1%BSA的PBST溶液)，室溫1h。PBS洗3次，每次5mins。（4）染色:漫入0.1-lug/mL的DAPI或Hoechst中，染色1min，PBS淋洗三次。（5）封片:用蓋玻片封片，指甲油固定，保存與4或-20C。B.2.3.4免疫熒光實(shí)驗(yàn)（1）冰凍切片取出，室溫放置使其干燥后，用冷丙酮于4℃固定10分鐘；（2）切片用0.01MPBS清洗后加入1.2%雙氧水作用30分鐘，以除去非特異染色；（3）0.01MPBS清洗，洗3次每次10分鐘；（4）0.3%TritonX-100作用30分鐘；（5）加入以抗體稀釋液(含1%BSA的0.01MPBS，pH7.4)稀釋至作濃度的一抗，4過(guò)夜；（6）0.01MPBS清洗，洗3次，每次10分鐘；（7）加入熒光抗體IgG(AlexaFluor?594)(1:100)或FITC-IgG(1:100)，室溫育2小時(shí)；（8）0.01MPBS清洗，3次10分鐘；（9）緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察B.2.3.5結(jié)果判定圖B.3免疫組化結(jié)果示例圖如圖B.3所示，如果實(shí)驗(yàn)組視野中出現(xiàn)如圖所示結(jié)果，則判斷為L(zhǎng)EA29Y基因表達(dá)鑒定免疫組化陽(yáng)性。DBXX/TXXXX—XXXX圖B.4免疫熒光結(jié)果示例圖如圖B.4所示，如果實(shí)驗(yàn)組視野中出現(xiàn)如圖所示結(jié)果（LEA29Y標(biāo)記的是綠色熒光，胰島細(xì)胞標(biāo)記的紅色熒光），則判斷為L(zhǎng)EA29Y基因表達(dá)鑒定免疫熒光陽(yáng)性。B.2.4ELISA方法鑒定基因表達(dá)B.2.4.1試劑耗材10mL注射器，促凝采血管、1.5mL離心管、人淋巴毒性相關(guān)抗原4（CTLA4）ELISA檢測(cè)試劑盒B.2.4.2樣品準(zhǔn)備隨機(jī)挑選4頭LEA29Y轉(zhuǎn)基因豬（編號(hào)77、221、266、269）和月齡相近的5頭野生型豬，禁食16h，清醒狀態(tài)下用10mL注射器從巴馬豬的前腔靜脈采集8mL全血。取6ml保存在促凝采血管內(nèi)，低速離心10min后吸取上清分離血清，分裝到1.5ml離心管中，用于下一步ELISA實(shí)驗(yàn)B.2.4.3ELISA實(shí)驗(yàn)步驟檢測(cè)方法如下：1)按說(shuō)明書(shū)，倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，其稀釋后標(biāo)準(zhǔn)品終濃度依次為：1ng/ml、0.5ng/ml、0.25ng/ml、0.125ng/ml、0.0625ng/ml、0ng/ml；2)上樣：分設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔（依次加入稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品50μL，不加酶標(biāo)抗體、其余各環(huán)節(jié)同待測(cè)樣品孔）、空白孔（不加樣品、酶標(biāo)抗體、酶標(biāo)試劑，其余各環(huán)節(jié)同待測(cè)樣品孔）、待測(cè)樣品孔。向待測(cè)樣品孔內(nèi)加入待測(cè)血清（4頭轉(zhuǎn)基因豬血清及5頭野生型豬血清）樣品40μL，再加10μLCTLA4酶標(biāo)抗體。上樣時(shí)避免觸及孔壁，輕搖混勻。3)溫育：封板膜封好微孔板，在恒溫箱內(nèi)37℃溫育0.5h。4)洗滌：揭掉封板膜，棄掉液體，甩干，加入洗滌液，靜止30s棄掉液體，重復(fù)5次，拍干。5)加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μL，空白孔除外。6)溫育：操作同3）。7)洗滌：操作同4）。8)顯色：向孔內(nèi)先后加入顯色試劑A和B各50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光15min。9)終止：每孔加入50μL終止液，終止反應(yīng)。10)測(cè)定：用空白孔校0，450nm波長(zhǎng)依次測(cè)量各孔的OD值B.2.4.4檢測(cè)結(jié)果計(jì)算DBXX/TXXXX—XXXX根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由樣品的OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線及兩種豬檢測(cè)結(jié)果如圖B.5所示，結(jié)果顯示用ELISA對(duì)采集血樣檢測(cè)，在胰島特異表達(dá)LEA29Y轉(zhuǎn)基因豬和野生型豬血液內(nèi)均檢測(cè)到LEA29Y，但轉(zhuǎn)基因豬中檢測(cè)到的值高于野生型豬，差異顯著圖B.5ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線及豬血清樣品檢測(cè)結(jié)果DBXX/TXXXX—XXXX（資料性）GGTA1基因敲除及表達(dá)有效性檢測(cè)方法C.1GGTA1基因型鑒定C.1.1原理以GGTA1基因?yàn)榘行蛄?，建立PCR檢測(cè)方法,并結(jié)合PCR產(chǎn)物sanger測(cè)序結(jié)果，判斷GGTA1基因敲除類(lèi)C.1.2樣品準(zhǔn)備C.1.2.1樣品種類(lèi)豬耳組織、血液等C.1.2.2樣品采集耳樣采集：在豬出生后盡快采集豬只耳樣，以便及時(shí)獲得新生豬基因型信息。采集耳樣前，采樣工具及采樣部位做好消毒，使用耳標(biāo)鉗在豬耳朵上剪下耳組織，將耳組織放入1.5mL離心管中用于下一步基因組提取。血液采集：使用紫色采血管，采集豬全血3-5mL，采樣前將豬只保定好，行豬頸靜脈采血術(shù)。C.1.2.3樣品處理使用基因組DNA提取試劑盒（簡(jiǎn)石生物，TD468），提取樣品總DNA。用于下一步的PCR實(shí)驗(yàn)。對(duì)于耳組織樣品，提取總DNA前應(yīng)對(duì)其進(jìn)行研磨處理，已獲得更高的濃度的基因組DNA。對(duì)于全血樣本，應(yīng)首先進(jìn)行破紅處理，去除全血中無(wú)核的紅細(xì)胞后，提取白細(xì)胞總DNA，以提高基因組DNA質(zhì)量。C.1.3PCR反應(yīng)C.1.3.1引物設(shè)計(jì)針對(duì)GGTA1基因編輯位點(diǎn)序列，使用引物設(shè)計(jì)軟件或者網(wǎng)站設(shè)計(jì)特異性引物。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)引物序列如下：上游引物：5’-AGGGACAGTAGACCTAGGAAAC-3’；下游引物：5’-GATCCTAATTGGGTTTGCTGCC-3’引物在GGTA1基因所在的位置如圖B.6所示。圖B.6GGTA1編輯位點(diǎn)處基因序列DBXX/TXXXX—XXXXC.1.3.2PCR反應(yīng)體系和程序表B.3PCR反應(yīng)體系組分名稱組分用量酶緩沖液KODBuffer2×上游引物0.5μL下游引物0.5μL酶KOD0.25μL模板100ng-500ngddH2O添加到20μL表B.4PCR反應(yīng)程序步驟溫度時(shí)間循環(huán)194℃2min1298℃10s；60℃30s；68℃30s；31按照表B.3配置PCR反應(yīng)體系，按照表B.4進(jìn)行PCR反應(yīng)程序。C.1.3.3PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定使用1%的瓊脂糖，電壓120V，電泳15-20分鐘，在凝膠成像系統(tǒng)中檢測(cè)。C.1.3.4PCR產(chǎn)物sang