耶爾森菌病診斷

2耶爾森菌病診斷本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了耶爾森菌病的診斷依據(jù)、診斷原則、診斷和鑒別診斷。本標(biāo)準(zhǔn)適用于全國各級醫(yī)療機構(gòu)和疾病預(yù)防控制機構(gòu)工作人員對耶爾森菌病的病原學(xué)檢測、診斷和報告。2術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。2.1耶爾森菌Yersinia腸桿菌科耶爾森菌屬的細(xì)菌，目前已發(fā)現(xiàn)了18個種，其中對人致病的種包括小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、假結(jié)核耶爾森菌與鼠疫耶爾森菌。2.2耶爾森菌病Yersiniosis主要由小腸結(jié)腸炎耶爾森菌感染造成，少數(shù)由假結(jié)核耶爾森菌感染造成，是一種人獸共患病、食源性疾病，以腹瀉為主要臨床表現(xiàn)的胃腸道傳染病，少數(shù)可出現(xiàn)結(jié)節(jié)性紅斑、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎，甚至是膿毒癥等腸外并發(fā)癥。3診斷依據(jù)3.1流行病學(xué)史全年都可發(fā)病，寒冷季節(jié)高發(fā)。豬和犬是最主要的傳染源。病人發(fā)病前多曾攝入不潔食品、水，尤其是經(jīng)冰箱冷藏保存的食物；或與耶爾森菌病患者、病原攜帶者、帶菌動物接觸。接受小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、假結(jié)核耶爾森菌感染者或病原攜帶者捐獻(xiàn)的血液輸血，也可造成耶爾森菌病血源性傳播。由于冰箱內(nèi)保存食品是重要的傳染來源，因此該病又被稱為“冰箱病”。詳細(xì)流行病學(xué)特征見附錄A。33.2臨床表現(xiàn)耶爾森菌病的臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，可分為胃腸炎型、類闌尾炎型（末端回腸炎型）、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎型、結(jié)節(jié)性紅斑型和膿毒癥型等。胃腸炎型：最常見，主要表現(xiàn)為急性腹瀉，腹瀉頻率，少則3次～5次/d，多者達(dá)10余次/日，部分伴有發(fā)熱和腹痛。糞便有性狀改變，可出現(xiàn)稀便、黏液便、膿血便。類闌尾炎型：即末端回腸炎型，表現(xiàn)為明顯的右下腹痛，部分在臨床上被診斷為闌尾炎。少部分患者還可發(fā)展為腸外并發(fā)癥，主要包括：反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎型：最常見的腸外耶爾森菌病型別，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、腫脹和關(guān)節(jié)囊液滲出。結(jié)節(jié)性紅斑型：部分患者發(fā)生胃腸炎后1周～2周出現(xiàn)結(jié)節(jié)性紅斑或多形性紅斑。膿毒癥型：血源性感染或免疫功能缺陷的患者可發(fā)展到膿毒癥，比較罕見，但病死率較詳細(xì)臨床表現(xiàn)見附錄B。3.3實驗室檢測3.3.1糞便常規(guī)檢查糞便性狀改變，主要表現(xiàn)為水樣便或稀便，亦可見黏液便，少數(shù)可見便中帶血或膿血。多數(shù)病人糞便鏡檢可見白細(xì)胞，其中部分亦可見紅細(xì)胞。3.3.2樣本快速檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森菌或假結(jié)核耶爾森菌特異性抗體標(biāo)記的膠體金快速檢測試劑可直接檢測患者新鮮糞便，和/或檢測糞便、肛拭子、血液（全血或血塊）、組織樣本（腸系膜淋巴結(jié)、切除的闌尾、內(nèi)鏡取得的腸道內(nèi)壁等）的增菌液陽性。詳細(xì)操作方法見附錄C。3.3.3樣本核酸檢測從患者的糞便、肛拭子、血液（全血或血塊）、組織樣本（腸系膜淋巴結(jié)、切除的闌尾、內(nèi)鏡取得的腸道內(nèi)壁等）等任一種樣本中檢測到小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的鐵草胺菌素受體基因（foxA）、黏附侵襲位點基因（ail）以及假結(jié)核耶爾森菌的侵襲素基因（inv）中一個或多個基因陽性。詳細(xì)操作方法見附錄C。3.3.4病原分離培養(yǎng)從患者的糞便、肛拭子、血液（全血或血塊）、組織樣本（腸系膜淋巴結(jié)、切除的闌尾、內(nèi)鏡取得的腸道內(nèi)壁等）等任一種樣本中分離到小腸結(jié)腸炎耶爾森菌或假結(jié)核耶爾森菌，詳細(xì)操作方法見附錄C。44診斷原則根據(jù)流行病學(xué)史、臨床表現(xiàn)和實驗室檢測進(jìn)行診斷。5診斷5.1臨床診斷病例符合以下一種情況者，為臨床診斷病例：a）符合3.2、3.3.1和3.3.2，3.1供參考；b）符合3.2、3.3.1和3.3.3，3.1供參考。5.2確診病例符合以下一種情況者，為確診病例：a）符合3.2、3.3.1和3.3.4。b）符合3.2、3.3.1和3.3.3，且目的基因foxA、ail、inv一個或多個基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴增產(chǎn)物經(jīng)測序，與Genbank等核酸序列數(shù)據(jù)庫中的參考序列比對一致。6鑒別診斷6.1耶爾森菌病胃腸炎型應(yīng)與細(xì)菌性痢疾、腸侵襲性大腸埃希菌腹瀉、沙門菌腹瀉等相鑒6.2耶爾森菌病類闌尾炎型（末端回腸炎型）應(yīng)與急慢性闌尾炎相鑒別。6.3耶爾森菌病反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎型應(yīng)與鏈球菌、葡萄球菌等其他細(xì)菌感染所致化膿性關(guān)節(jié)炎相鑒別。6.4耶爾森菌病結(jié)節(jié)性紅斑型應(yīng)與藥物性、過敏性結(jié)節(jié)性紅斑等相鑒別。6.5耶爾森菌病膿毒癥型應(yīng)與其他細(xì)菌感染所致膿毒癥相鑒別。5附錄A(資料性附錄)耶爾森菌病流行病學(xué)A.1流行特征耶爾森菌病是一種全球性疾病，各大洲均有分布。歐洲是小腸結(jié)腸炎耶爾森菌感染率較高地區(qū)，菌株的主要流行型別為4/O:3型。尤其比利時、芬蘭、瑞典等國家的病例數(shù)較多，最近一次報道是2018年上半年在瑞典發(fā)生的由于食用豬腸引起的一起暴發(fā)。我國曾在20世紀(jì)80年代報道過兩次暴發(fā)，大約有500人感染。2010～2015年的調(diào)查顯示，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌在我國人群中的感染率約為0.59%，并不低于其他國家調(diào)查結(jié)果，菌株以3/O:3型為主要流行型別，與歐洲主要流行型別不同。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在我國臨床上部分小腸結(jié)腸炎耶爾森菌感染導(dǎo)致的腹瀉常被診斷為細(xì)菌性痢疾，因此我國實際人群中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的流行水平可能被低估。假結(jié)核耶爾森菌的感染率一般都稍低于小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，多分布于北半球，南半球主要見于澳大利亞和新西蘭，南美州（除巴西外）與非洲則罕有報道。芬蘭與日本是報告假結(jié)核耶爾森菌感染最多的國家。耶爾森菌病一年四季均可發(fā)生，由于耶爾森菌的嗜冷性，在寒冷季節(jié)多發(fā)。A.2傳染源小腸結(jié)腸炎耶爾森菌和假結(jié)核耶爾森菌都為人獸共患病原體，具有廣泛的動物宿主，在人類以及所有溫血的野生或家養(yǎng)動物中均能發(fā)現(xiàn)。豬和犬是小腸結(jié)腸炎耶爾森菌最主要的宿主和傳染源，在爬行動物、魚和甲殼水生動物體內(nèi)也偶有發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)證實蒼蠅、蟑螂等昆蟲帶菌，也可分離自外環(huán)境。生豬或未完全熟制豬肉、豬內(nèi)臟制品是人類感染耶爾森菌病的最主要來源。2008～2010年在我國11個省市的調(diào)查顯示，生豬中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的平均攜帶率為19.53%（878/4,495）。通過分子流行病學(xué)調(diào)查已經(jīng)證實，犬也是人群感染小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的一個主要來源。其他家養(yǎng)動物、嚙齒動物、鳥類以及其他野生動物等也都可能帶菌。假結(jié)核耶爾森菌分布更為廣泛，在鳥類中的感染率通常大大高于小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，候鳥的遷徙則對于假結(jié)核耶爾森菌在世界范圍內(nèi)不同大陸之間的廣泛傳播起到很大作用。A.3傳播途徑小腸結(jié)腸炎耶爾森菌與假結(jié)核耶爾森菌主要通過糞—口途徑傳播。人的感染尤其是暴發(fā)流行，最主要的途徑是攝入被污染的食物和水。接觸患者的糞便等也可引起人與人之間的6相互傳播。人通過直接接觸帶菌動物的排泄物也會造成感染。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌與假結(jié)核耶爾森菌是食源性病原菌，可通過冰箱儲存的受污染的食物傳播。該菌的污染可能發(fā)生在食物的制造、加工，以及無封閉包裝食品的切割、分裝、搬運、售賣等各個過程。目前已從各種生熟肉食、蔬菜、奶及奶制品、果汁飲料等食物中分離出小腸結(jié)腸炎耶爾森菌。由于細(xì)菌本身的嗜冷性，可以在冰箱冷藏保存的食品中長期存活和繁殖，冰箱低溫儲存的被污染食品是耶爾森菌病的重要來源。水源或土源傳播造成的疫情多是由于水和土壤遭到了被感染牲畜糞便的污染。輸入受到小腸結(jié)腸炎耶爾森菌或假結(jié)核耶爾森菌污染的紅細(xì)胞是引起輸血相關(guān)感染的原因之一，由于該菌能夠在冷藏溫度下繁殖，因此它也可能會通過冷藏保存的血液使受血者感染。耶爾森菌病的血源性傳播雖然比較罕見，但由于通常會直接導(dǎo)致患者發(fā)生膿毒癥，病死率高，仍然需要得到重視。A.4易感人群人群普遍易感，發(fā)病者多見于嬰幼兒。嬰幼兒發(fā)病多為腹瀉型病例，其他臨床型病例的發(fā)病率則低于成人，較大年齡兒童和青少年多為類闌尾炎型。人類白細(xì)胞抗原HLA-B27等位基因攜帶者、肝病、糖尿病、血液病、器官移植術(shù)后、人類免疫缺陷病毒（HIV）攜帶者等免疫缺陷者更容易發(fā)生反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎等腸外并發(fā)癥。嚴(yán)重感染一般發(fā)生在使用免疫抑制劑、具有免疫缺陷或鐵過載的人群中。7(資料性附錄)耶爾森菌病臨床表現(xiàn)B.1概述耶爾森菌進(jìn)入人體腸道后通過腸黏膜進(jìn)入下層淋巴組織派氏結(jié)（Peyer’s結(jié)在腸道和腸淋巴組織中生長繁殖，導(dǎo)致大量多核白細(xì)胞增生，引起急性炎癥。極少數(shù)病人病原體經(jīng)血流播散，由于耶爾森菌的嗜淋巴特征，有可能通過淋巴管播散，到達(dá)關(guān)節(jié)和其他組織，引起腸外耶爾森菌病。耶爾森菌病潛伏期1d～10d。該病患者可長期排菌，潛伏期跨度較長。由于菌型不同以及個體的健康狀況、反應(yīng)性、免疫水平不同，臨床表現(xiàn)也不同：腹瀉多見于嬰幼兒；結(jié)節(jié)性紅斑多見于40歲以上的成人；腸系膜淋巴結(jié)炎多發(fā)生在青少年及年長兒童；自身免疫現(xiàn)象常見于婦女；HLA-B27病人易發(fā)生關(guān)節(jié)炎；在鐵過載的患者中，較常發(fā)生全身性感染。B.2臨床分期B.2.1急性期此期以急性炎癥為主，臨床表現(xiàn)因感染器官而異，通常可從受侵害部位分離出病原體。主要表現(xiàn)有胃腸炎、淋巴結(jié)炎、末端回腸炎（類闌尾炎）、肺炎、膿毒癥等。其中以胃腸炎最常見，可發(fā)生在任何年齡組，但5歲以下嬰幼兒發(fā)病率最高。B.2.2并發(fā)癥期主要表現(xiàn)為反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)性紅斑、心肌炎等。此期于急性期后1周～3周出現(xiàn)，大部分合并癥比較嚴(yán)重，常需住院治療。B.2.3再發(fā)期主要疾病有多發(fā)性肌炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、結(jié)節(jié)性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎等自身免疫病。B.3臨床類型B.3.1胃腸炎型急性胃腸炎是耶爾森菌病最常見的臨床表現(xiàn)，典型癥狀為腹瀉和發(fā)熱，嬰幼兒所占比例8較高，病情輕重不一；腹瀉為水樣便、黏液便、重者可出現(xiàn)血便，每日腹瀉次數(shù)不等，少則3次～5次/d，多者達(dá)10余次/d，便常規(guī)檢驗可見白細(xì)胞和/或紅細(xì)胞。目前我國臨床上部分耶爾森菌導(dǎo)致的腹瀉常被診斷為細(xì)菌性痢疾。B.3.2類闌尾炎型（末端回腸炎型）某些病例表現(xiàn)右下腹1/3處疼痛，形成臨床上的一種急癥，常被診斷為闌尾炎，但通過闌尾手術(shù)后發(fā)現(xiàn)闌尾多正常，而且常觀察到末端回腸、闌尾、腸系膜淋巴結(jié)腫大。B.3.3反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎型反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎型是最常見的腸外耶爾森菌病型別，以成人為主，女性居多。關(guān)節(jié)局部癥狀主要表現(xiàn)為疼痛、腫脹和關(guān)節(jié)囊液滲出。B.3.4結(jié)節(jié)性紅斑型結(jié)節(jié)性紅斑型也是腸外耶爾森菌病的一種。部分成人耶爾森菌病會在胃腸炎后1周～2周出現(xiàn)結(jié)節(jié)性紅斑或多形性紅斑，但也有調(diào)查顯示40%的病例缺乏胃腸癥狀。B.3.5膿毒癥型不常見，但癥狀嚴(yán)重，病死率接近50%。具有肝硬化、糖尿病、惡性腫瘤、嚴(yán)重貧血和血液病等病史的感染者可發(fā)展為膿毒癥，少數(shù)的一般感染者也會發(fā)生。9(規(guī)范性附錄)耶爾森菌病實驗室檢測C.1樣本采集、轉(zhuǎn)運與保存患者的糞便、肛拭子、血液（全血或血塊）、組織（腸系膜淋巴結(jié)、切除的闌尾、腸道內(nèi)壁等）樣本等都可用于耶爾森菌的分離培養(yǎng)。腹瀉病人糞便樣本采集著重選取性狀改變或膿液、黏液部位。樣本采集后立即分為兩份，一份置于無菌容器內(nèi)4℃迅速轉(zhuǎn)運到病原學(xué)實驗室按照C.3的方法進(jìn)行核酸檢測；一份立即按照C.4的方法接種到增菌液中或選擇性培養(yǎng)基上，按照增菌和培養(yǎng)的相應(yīng)溫度24h內(nèi)轉(zhuǎn)運到病原學(xué)實驗室進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。如現(xiàn)場無法直接接種增菌液或培養(yǎng)基，可將5mL或5g以上樣本暫時置于Carry-Blair轉(zhuǎn)運培養(yǎng)基中，4℃冷藏條件下，24h～48h之內(nèi)運輸?shù)讲≡瓕W(xué)實驗室后進(jìn)行核酸檢測或菌株分離培養(yǎng)。如樣本不能及時檢測需要存放較長時間，則建議將樣本置于25%～30%滅菌甘油肉湯中，立即-20℃或更低溫度冷凍，保存和轉(zhuǎn)運溫度全程需要保持在-20℃或以下，樣本保存3個月~6個月后仍可分離到菌株，但分離效率可能受到影響，核酸檢測效率不會受到較大影響。C.2樣本快速檢測C.2.1樣本快速檢測液取少量待測糞便，肛拭子，血液（全血或血塊腸系膜淋巴結(jié)、切除的闌尾或內(nèi)鏡取得的腸道內(nèi)壁等組織樣本于1mL生理鹽水充分震蕩混勻，待自然沉降后取上清液作為樣品快速檢測液；增菌樣品將增菌管顛倒混勻，待自然沉降后取上清液作為樣品快速檢測液。C.2.2檢測方法準(zhǔn)備好樣本快速檢測液后，打開膠體金快速檢測試劑，吸取樣品快速檢測液，滴加1滴～2滴（約100μL～150μL）于檢測卡上的樣品孔內(nèi)，需確保操作過程中沒有氣泡產(chǎn)生。設(shè)置好計時器，于加樣后15min～20min內(nèi)判讀結(jié)果。C.2.3結(jié)果判讀C.2.3.1陽性結(jié)果質(zhì)控線與檢測線都出現(xiàn)，提示檢測到特異抗原。C.2.3.2陰性結(jié)果質(zhì)控線出現(xiàn)，檢測線未出現(xiàn)，提示未檢測到特異抗原。C.2.3.3無效結(jié)果質(zhì)控線未出現(xiàn)，則無論檢測線是否出現(xiàn)，均為無效，應(yīng)重新進(jìn)行檢測。C.2.4方法的局限性C.2.4.1假陽性結(jié)果當(dāng)陽性結(jié)果與臨床表現(xiàn)不一致時，需通過其他方法進(jìn)一步確證。C.2.4.2假陰性結(jié)果當(dāng)樣本中抗原濃度低于檢測下限，則出現(xiàn)假陰性結(jié)果。當(dāng)陰性結(jié)果與臨床表現(xiàn)不一致時，需通過其他方法進(jìn)一步確證。C.3樣本核酸檢測將糞便、肛拭子、血液或組織樣本按照相應(yīng)試劑盒提取程序提取獲得DNA，使用普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）或?qū)崟r熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）分別擴增小腸結(jié)腸炎耶爾森菌特異性基因foxA、ail和假結(jié)核耶爾森菌特異性基因inv。所有反應(yīng)均需設(shè)立陽性和陰性對照。C.3.1檢測方法C.3.1.1qPCR法采用20μL體系：10μL商業(yè)化Premix，7.2μL超純水，0.2μLROX，上下游引物、探針（濃度均為100nmol/L）各0.2μL，樣本DNA2μL。引物、探針序列見表C.1。擴增程序為：95℃預(yù)變性10s；95℃5s，60℃30s，共40個循環(huán)。表C.1ail與foxA基因qPCR用引物與探針ailprobeFAM-CTGCCCCGTATGCCATTGACGTCTfoxA-FfoxA-RfoxAprobeFAM-ACCTTCCTTGATGGGCTGCGCTTACHEX-AGAGCGAGGTATGTAGGCGG-C.3.1.2普通PCR法采用20μL體系：10μL商業(yè)化Premix，8μL超純水，上下游引物（濃度均為10μmol/L）各0.5μL，樣本DNA1μL。引物序列見表C.2。擴增程序為：95℃預(yù)變性5min；95℃15s，退火30s，72℃30s，25個循環(huán)；72℃延伸5min。表C.2ail、foxA、inv基因普通PCR用引物foxA-FfoxA-RPCR完成后1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶。靶基因序列測定：對上述ail、foxA、inv基因PCR產(chǎn)物送商業(yè)化測序公司進(jìn)行雙向序列測定。C.3.2結(jié)果判讀樣本核酸檢測判讀見表C.3：foxA和ail都陽性，表示樣本中含有致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌；僅foxA基因陽性者，表示樣本中含有非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌；inv基因陽性者，表示樣本中含有假結(jié)核耶爾森菌。表C.3樣本核酸檢測結(jié)果判斷foxAail++-+----+C.4樣本細(xì)菌分離培養(yǎng)根據(jù)病原學(xué)檢測目的不同，分別采用直接分離或長期冷增菌策略，臨床急性期病例樣本或疫情樣本為節(jié)省時間，可直接接種選擇性平板后分離菌株；日常監(jiān)測或回顧性檢測樣本則可采用長時間冷增菌的策略從而提高分離率。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌與假結(jié)核耶爾森菌使用相同的分離培養(yǎng)流程，通過菌株形態(tài)、生化反應(yīng)特征的差異進(jìn)行鑒別。C.4.1樣本細(xì)菌分離培養(yǎng)流程糞便、肛拭子、全血直接接種平板或接種選擇性增菌液；組織樣本、血塊則無菌研磨后接種平板或接種選擇性增菌液，按照以下程序進(jìn)行耶爾森菌分離培養(yǎng)（圖C.1）。C.4.2樣本冷增菌若選擇直接分離策略，則直接跳至C.4.4步驟。若選擇長時間冷增菌策略，則將樣本按照不低于1:10的比例接種于商品化的蛋白胨—山梨醇—膽鹽肉湯（PeptoneSorbitolBileBroth，PSB）增菌液或商品化的改良磷酸鹽緩沖液（改良PBS）增菌液中，增菌液總體積需要至少6mL以上，充分搖勻。立即置于4℃進(jìn)行2周的冷增菌。C.4.3增菌液的分子生物學(xué)初篩增菌2周后，提取增菌液DNA，按照C.3所述方法進(jìn)行耶爾森菌的分子生物學(xué)初篩。foxA、ail與inv任一基因陽性的樣本都接種選擇性平板進(jìn)行下一步分離培養(yǎng)，三個基因檢測都陰性的樣本判斷為不含有小腸結(jié)腸炎耶爾森菌或假結(jié)核耶爾森菌，一般情況下不再進(jìn)行菌株分離。圖C.1小腸結(jié)腸炎耶爾森菌與假結(jié)核耶爾森菌分離培養(yǎng)流程圖C.4.4接種選擇性平板將選擇直接分離策略的樣本或增菌初篩陽性的樣本接種于耶爾森菌選擇性培養(yǎng)基（Yersiniaselectiveagar，CIN平板）或麥康凱平板（MAC平板劃線分離。接種后立即置于25℃培養(yǎng)。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌與假結(jié)核耶爾森菌在各種腸道選擇性培養(yǎng)基上都可生長。在需氧或厭氧條件下均可生長，生長溫度范圍較寬，0℃~45℃都可生長，最佳生長溫度為25℃~28℃。一般增殖傳代培養(yǎng)，使用普通LB平板或腦心浸液平板。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌培養(yǎng)18h～24h，假結(jié)核耶爾森菌生長速度較慢，需要24h～48h。兩種耶爾森菌的菌落形態(tài)類似，假結(jié)核耶爾森菌菌落更為細(xì)小。25℃培養(yǎng)24h，呈細(xì)小濕潤的奶白色菌落，腦心浸液平板上菌落稍大顏色稍深，在肉湯中呈均勻混濁生長，一般不形成菌膜。樣本首次接種建議培養(yǎng)48h。在耶爾森菌選擇性平板上，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌形成較小的濕潤菌落，直徑約1mm～2mm，中心呈深玫瑰紅色，凸起較尖銳，周圍有較窄的半透明環(huán)，稱“公牛眼”狀菌落。假結(jié)核耶爾森菌在耶爾森菌選擇性平板上形態(tài)與小腸結(jié)腸炎耶爾森菌相似，但菌落更小，中心玫瑰色更深，周圍透明環(huán)更窄。麥康凱平板25℃培養(yǎng)24h～48h，形成直徑約0.5mm～1mm的小菌落，圓形、光滑、濕潤的半透明菌落，中央有極淡的粉色。C.4.5生化特征篩選——尿素分解試驗從每塊選擇性培養(yǎng)基上至少挑取5個可疑菌落進(jìn)行生化鑒定，分別接種于尿素液體培養(yǎng)基，震蕩均勻，25℃培養(yǎng)，尿素培養(yǎng)基變紅色為分解尿素，接種2h開始即可陸續(xù)觀察到，觀察至24h結(jié)束。C.4.6系統(tǒng)生化鑒定對分解尿素的可疑菌株重新在腦心浸液肉湯平板或LB平板上25℃~28℃?zhèn)鞔鲋澈筮M(jìn)行系統(tǒng)生化鑒定，可使用手工生化鑒定條、系統(tǒng)生化鑒定儀以及質(zhì)譜鑒定儀，從而最終確定細(xì)菌種屬。需要注意的是，由于耶爾森菌最優(yōu)培養(yǎng)溫度為25℃~28℃,系統(tǒng)生化鑒定儀37℃培養(yǎng)可能使部分生化反應(yīng)結(jié)果發(fā)生變化，出現(xiàn)鑒定錯誤或無法鑒定的情況。質(zhì)譜鑒定儀由于目前數(shù)據(jù)庫所限，可能存在漏檢或誤檢。目前生物梅里埃手工生化鑒定試劑條（API20E）是耶爾森菌屬生化鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)。此外，可能會出現(xiàn)部分生化反應(yīng)異常的情況，如：鳥氨酸脫羧酶、枸櫞酸等反應(yīng)。當(dāng)菌落形態(tài)相似，其他生化反應(yīng)較為符合的情況下，可用單管手動生化反應(yīng)進(jìn)行復(fù)核，以免漏掉陽性菌株。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌與假結(jié)核耶爾森菌的主要生化反應(yīng)差異見表C.4。表C.4小腸結(jié)腸炎耶爾森菌與假結(jié)核耶爾森菌生化反應(yīng)比較+/-+/---++++--+---+-v--vvv-v++-+VP25℃/37℃v/--+--vV---v-+-++--Vv--V+C.5菌種的保存與運輸小腸結(jié)腸炎耶爾森菌與假結(jié)核耶爾森菌在普通平板或斜面上可以存活2個星期以上。在0.5%腦心浸液半固體培養(yǎng)基上至少可以保存3個月至半年，可以作為短期保存或運輸。長期保存菌株使用20%～30%甘油肉湯凍存，-80℃凍存，可保存十年以上，接種菌量大有利于菌種的保存。不建議使用瓷珠進(jìn)行菌株短期保存運輸或長期保存，可能會出現(xiàn)菌株無法復(fù)蘇的情況。C.6菌株病原學(xué)特征鑒定從樣本中分離到的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌或假結(jié)核耶爾森菌可依照以下方法進(jìn)行進(jìn)一步病原學(xué)特征的鑒定。C.6.1血清分型C.6.1.1小腸結(jié)腸炎耶爾森菌小腸結(jié)腸炎耶爾森菌根據(jù)“O”抗原目前至少可以分為70個以上的血清型，但目前全球的商業(yè)化分型抗血清（或單克隆抗體）僅限于常見致病性菌株的血清型，包括O:1,2、O:3、O:5、O:8與O:9血清型。使用致病性菌株常見血清型的特異性單克隆抗體或分型抗血清進(jìn)行玻片凝集，同時用生理鹽水做對照。在生理鹽水中自凝者為粗糙型菌株，不能分型。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌同一株菌可能具有多種“O”抗原因子，如：O:5,27、O:1,2a,3等。用活菌抗原做凝集試驗，必須與各型血清都做檢測，才能判定型別。僅與少數(shù)得到的血清作試驗，有時會漏掉其他抗原因子。某些“O”抗原同其他細(xì)菌有共同性，如O:9與布魯菌有交叉反應(yīng)。通過玻片凝集進(jìn)行血清分型，典型的凝集陽性結(jié)果為：形成大的凝集顆粒，液體完全變清亮。有時凝集結(jié)果不夠典型：液體仍有混濁，但凝集顆粒已形成，顆粒稍小，可以判定為陽性結(jié)果。單克隆抗體的凝集與血清凝集結(jié)果不同，呈細(xì)沙狀。兔免疫分型診斷血清由于是多克隆抗體，因此會存在非特異凝集，在啟用一個批次診斷血清前，需要做好質(zhì)量評價。C.6.1.2假結(jié)核耶爾森菌目前一共發(fā)現(xiàn)了15個血清型，6個血清亞型：O:1a、O:1b、O:1c、O:2a、O:2b、O:2c、O:3、O:4a、O:4b、O:5a、O:5b、O:6、O:7、O:8、O:9、O:10、O:11、O:12、O:13、O:14、O:15。假結(jié)核耶爾森菌各個血清型都發(fā)現(xiàn)了致病性菌株，同一血清型，既有致病性菌株，也有非致病性菌株。從目前世界各地分離到的菌株來看，O:1～O:5血清型菌株大多數(shù)都是致病性菌株。由于分型血清的局限性，目前使用PCR方法進(jìn)行血清分型。使用普通PCR方法擴增表C.5各個基因，根據(jù)各個基因的組合判斷血清型。表C.5假結(jié)核耶爾森菌血清分型判別gmd-fclwbyHwbyKwzz-gsk++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++引物序列見表C.6：表C.6假結(jié)核耶爾森菌血清分型引物序列g(shù)md-fclwbyHwbyKwzz-gsk擴增體系與擴增程序參照C.3.1.2。C.6.2生物分型C.6.2.1小腸結(jié)腸炎耶爾森菌生化反應(yīng)不僅是小腸結(jié)腸炎耶爾森菌鑒定的主要依據(jù)，還作為生物分型依據(jù)。根據(jù)表C.7生化反應(yīng)，25℃培養(yǎng)48h后小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的生物型可分為生物1A、1B、2、3、4和5共6個生物型。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的生物分型在臨床上很有意義，大多數(shù)生物1A型是非致病性菌株，生物1B、2、3、4和5型則大部分為致病性菌株。表C.7小腸結(jié)腸炎耶爾森菌生物分型指標(biāo)2345++----+-----+-----++---++++-d+++++-+++++-----++d-----+-----+-----C.6.2.2假結(jié)核耶爾森菌通過棉子糖、蜜二糖、枸櫞酸利用試驗可分為4個生物型（表C.8表C.8假結(jié)核耶爾森菌生物分型---++--+--+-C.6.3毒力基因鑒定C.6.3.1小腸結(jié)腸炎耶爾森菌主要進(jìn)行以下5個基因的普通PCR檢測，所有反應(yīng)均設(shè)立陽性和陰性對照：位于染色體上的ail（粘附侵襲位點基因）、ystA（小腸結(jié)腸炎耶爾森菌耐熱性腸毒素A基因）和ystB（小腸結(jié)腸炎耶爾森菌耐熱性腸毒素B基因位于毒力質(zhì)粒（pYV）的yadA（黏附素基因）和virF（Yop調(diào)節(jié)子轉(zhuǎn)錄活化因子基因）。擴增體系與擴增程序參照C.3.1.2，擴增引物見表C.9：表C.9小腸結(jié)腸炎耶爾森菌毒力基因PCR擴增引物序列ystA-FystA-RystB-FystB-RyadA-FyadA-R傳統(tǒng)上根據(jù)染色體和毒力質(zhì)粒攜帶毒力基因的情況可