輪狀病毒及其胃腸炎研究進展

輪狀病毒及其胃腸炎研究進展 前言

小兒腹瀉病是世界性的公共衛(wèi)生問題,是引起小兒死亡的主要原因,世界衛(wèi)生組織把腹瀉病的控制列為全球性戰(zhàn)略。

輪狀病毒（Rotavirus,RV）是小兒腹瀉病最常見的病因之一。

1973年澳大利亞首次在腹瀉病患兒中發(fā)現(xiàn)了輪狀病毒我國1978年,云南省979年腹瀉病患兒中發(fā)現(xiàn)該病毒前言 嬰幼兒輪狀病毒（HumanRotavirus,HRV）是引起世界范圍內(nèi)嬰幼兒重癥腹瀉的最主要病因。發(fā)達國家和發(fā)展中國家20%-70%5歲以下的嬰幼兒都感染過輪狀病毒,發(fā)展中國家每年大約有800,000患兒死于輪狀病毒腹瀉。前言營養(yǎng)狀況對HRV發(fā)病危險影響不大,改善衛(wèi)生條件對輪狀病毒的預防并不十分有效。對于HRV引起的腹瀉,國內(nèi)外尚未報道有特效治療方法。目前,發(fā)展HRV疫苗控制HRV腹瀉受到一致的重視。前言但輪狀病毒流行株呈現(xiàn)多樣性,隨不同年份、不同地區(qū)可有所改變。由此,HRV流行的趨勢及疫苗研究等受到了廣泛的關注。RV的分子結構HRV流行的趨勢NSP4研究進展發(fā)病機制治療診斷臨床表現(xiàn)輪狀病毒及其胃腸炎研究進展疫苗的研制免疫機制一輪狀病毒的分子結構 輪狀病毒（Rotavirus）歸類于呼腸孤病毒科(Reoviridae)輪狀病毒屬(Rotavirus),病毒體呈圓球形,有三層衣殼,每層衣殼呈二十面體對稱。內(nèi)衣殼的殼微粒沿著病毒體邊緣呈放射狀排列，形同車輪輻條。注：輪狀病毒（Rotavirus，在拉丁語中“Rota”的意思是車輪）在電鏡下呈球形，其直徑為65-75nm的20面體。輪狀病毒為三層蛋白質衣殼結構，包括核心、內(nèi)衣殼、外衣殼。由內(nèi)、外衣殼沿病毒邊緣排列，包繞形成典型的車輪輻條結構。核心內(nèi)衣殼外衣殼分子結構完整病毒大小約70～75nm，無外衣殼的粗糙型顆粒為50～60nm。具雙層衣殼的病毒體有傳染性。病毒體的核心為雙股RNA，由11個不連續(xù)的節(jié)段組成。RNA節(jié)段平均長度為660～3300個堿基對，各編碼一種蛋白質，即6種結構蛋白和5種

非結構蛋白。分子結構分子結構6種結構蛋白：VP1VP2VP3VP4VP6VP7分子結構5種非結構蛋白（nonstructureproteinNSP）：NSP1NSP2NSP3NSP4NSP5分組感染對象感染特點A人和動物嬰幼兒腹瀉的主要病原體B人和動物水源暴發(fā)流行,主要感染青壯年C人和動物青少年中偶有流行D動物E動物F動物G動物分子結構 根據(jù)病毒主蛋白VP6抗原性的差異，可將輪狀病毒分為A～G組。根據(jù)病毒糖蛋白VP4、VP7抗原性

的差異,又可將

輪狀病毒分為

P血清型和G血清型。

HRV血清型是由病毒外殼蛋白VP4和VP7的抗原性不同區(qū)分的。VP7蛋白是由RV基因組的第7、第8或第9基因所編碼的病毒外殼蛋白,其分子量為34kD,占毒粒蛋白總量的30%,僅次于VP6蛋白。VP7蛋白是高價免疫血清能檢測到的主要中和抗原,因此決定病毒的G血清型(因為它是一種糖蛋

白Glycoprotein)。分子結構分子結構至今根據(jù)VP7蛋白中和抗原與高價免疫血清反應的差異發(fā)現(xiàn)了14個VP7蛋白血清型（G1-G14）。通過對這14個血清型VP7基因序列的測定及比較分析由這些核苷酸序列推斷的氨基酸序列表明：同一血清型中的不同毒株間,氨基酸的同源性很高(91%-100%);

不同血清型的毒株之間,其VP7蛋白氨基酸序列的同源性則低得多(往往低于85%)。

因此,用中和試驗和核酸序列測定方法來確定輪狀病毒血清型的相關性是一個比較準確的

方法。分子結構VP7蛋白上有9個高變區(qū),在同一血清型毒株之間這些區(qū)域高度保守,而不同型別的毒株之間差異較大。根據(jù)這一特點利用高變區(qū)的序列設計引物進行RT-PCR,再根據(jù)PCR產(chǎn)物的不同而判定毒株

的G型別（即VP7基因型）。分子結構 VP4蛋白由第4基因編碼,以棘突形式分布于病毒外殼上,由于VP4蛋白能誘導產(chǎn)生中和抗體,而且這種抗體與VP7蛋白誘導的中和抗體無關,所以近年來又建立了VP4蛋白的血清分型系統(tǒng)（P血清型，

Proteasesenstive）。分子結構近年來,HRV命名工作組(RotavirusNomenclatureWorkingGroup)將基因型和血清型之間的不同型別一致起來,建議基因型寫在血清型后方,并用括號表示(如Wa株為PIA[8]),若血清型沒有確定,則為P[]。分子結構血清型[基因型]二嬰幼兒輪狀病毒流行的趨勢交叉中和試驗14個G血清型（G1-G14）20個P血清型（P1-P20）感染人10個G血清型:G1.G2.G3.G4.G5.G6.G8.G9.G10.G12

8

個P血清型:P1A.P1B.P2A.P3.P3B.P4.P5.P8G1-G4是世界范圍內(nèi)嬰幼兒腹瀉的主要病因

全球不同地區(qū)流行病學調(diào)查表明：P1A[8]G1、P1B[4]G2、P1A[8]G3、P1A[8]G4是人類最常見的優(yōu)勢株。但近年輪狀病毒流行呈現(xiàn)出新的趨勢，即輪狀病毒流行呈多樣性(表現(xiàn)為不同年度流行優(yōu)勢株轉變、異常毒株的出現(xiàn)、混合感染比例增加)

和G9型毒株在全球流行。流行趨勢1輪狀病毒流行的多樣性2G9型毒株全球流行情況3基因突變、基因重配及基因重組在輪狀病毒毒株多樣性中的作用4輪狀病毒血清型與其臨床表現(xiàn)和輪狀病毒腹瀉暴發(fā)流行的關系流行趨勢（一）輪狀病毒流行的多樣性

大量輪狀病毒流行研究顯示：除了在世界范圍內(nèi)流行優(yōu)勢株(G1-G4)外,其它不常見的血清型在不同時區(qū)有報道。此外,在同一地區(qū)不同的年

度RV血清型可發(fā)生變化。流行趨勢國家(地區(qū))時間(年)流行株意大利1981-1992G1為主（未能分型毒株占27%）1990-1994P[8]G4為主,其次為P[8]G1型西非幾內(nèi)亞1996-1997G2P[6]為主1998G1為主，出現(xiàn)了一些不常見的毒株如P[9]、G3,混合感染較為突出，16%不能分型芬蘭1988-1990G1到G4血清型的轉變?nèi)毡緰|京1991年以前主要為G2、G3和G41991年以后G1為主中國重慶1998-1999G1為主1999-2000G3為主孟加拉國1999G4為主,其次為G1和G2,混合感染顯著。流行趨勢國家(地區(qū))時間(年)流行株尼日利亞1993-1995南部地區(qū)：G3為主，北部地區(qū)：混合感染較為突出,G2、G4、G8未檢測出。巴西1997-1998P[4]G2為主,但不常見的毒株P[8]G9、P[6]G9、P[4]G9比例增加。英國1995-1999主要是P[8]G1、P[4]G2、P[8]G3、P[8]G4,不常見的毒株出現(xiàn)P[8]G2、P[6]G9、P[8]G9。阿根廷1996-1998出現(xiàn)不常見的RV株G1P[4],混合感染較前增多愛爾蘭1995-1997主要為P[8]G1、P[4]G2、P[8]G4，P[4]G4為不常見株，混合感染占18.8%。流行趨勢國家(地區(qū))時間(年)流行株馬拉維1997.7-1998.1P[6]G8為主，2%混合感染，9%不能分型。非洲1975-1992G1為主，未能分型達26%，提示出現(xiàn)了除G1-G4外的毒株。美國1996-1997依次為：P[8]G1(66.4%)、P[4]G2(8.3%)、P[8]G3(6.9%)、P[8]G4(1.4%),9.2%為不常見毒株：P[6]G9(5.5%)、P[8]G9(1.7%)、P[6]G1(1.4%)、P[4]G1(0.3%)、P[8]G2(0.3),5.5%未能分型,2.3%為混合感染。東印度1998-2000出現(xiàn)了不尋常的毒株：P[1]G4、P[8]G2、P[6]G2、P[4]G4、P[6]G4,且有78%不能分型。流行趨勢國家(地區(qū))時間(年)流行株中國1998-2000年依次為：G1(占72.6%)、G3(14.2%)、G2(12.1%)、G4(2.9%)、G9(0.9%)及未能確定其血清型(0.7%)，除了一些常見的RV株P[8]G1、P[4]G2、P[8]G3、P[8]G4外出現(xiàn)了新的RV株P[6]G9、P[6]G3、P[6]G1、P[9]G1、P[4]G3、P[4]G4、P[8]G2。昆明地區(qū)2002-2004G血清型主要是G3、G1型2002以G1型為主2003以G3型為主2004均為G3型流行趨勢（二）G9型毒株全球流行情況 自1983年美國在世界范圍內(nèi)首次報道G9型HRV感染人以來,在1992年-1998年期間,在泰國、孟加拉國、馬拉維、印度、巴西、意大利、

法國、澳大利亞發(fā)現(xiàn)了G9型HRV株。流行趨勢國家(地區(qū))時間(年)流行株日本1987-1996G1-G4型1995起開始出現(xiàn)G9型毒株泰國1996-1997出現(xiàn)G9型毒株,有逐年增加的趨勢。加納1999P[6]G2、P[6]G8為主要的RV流行株,但出現(xiàn)了過去不常見的G9型毒株尼日利亞1998.1-1999春流行的HRV株為G9、G8型,而G2、G4減少印度1996-1999G9型較為流行,可能成為常見的RV流行株韓國新加坡1998-1999G9是首居第一位的血清型，分別具有52.9%和71.4%的檢出率。流行趨勢目前，世界各地輪狀病毒流行研究表明G9型有可能成為第五個常見的流行優(yōu)勢株。國家(地區(qū))時間(年)流行株我國1994錢淵等首次報道我國有1例G9型HRV感染腹瀉患兒,表明我國可能有G9型HRV存在。1999-2000方肇寅等的研究顯示1999-2000年G9型HRV呈顯著增長趨勢,P-G結合關系鑒定為P[6]G9(92%)和P[8]G9(8%)。流行趨勢

輪狀病毒基因組為包含11個基因片段的雙股RNA（dsRNA），由于其基因片段分節(jié)段，故在不同的毒株間易發(fā)生:基因突變（genemutation）

基因重配（genereassortment）

基因重組(generearrangement)（三）基因突變、基因重配及基因重組在

輪狀病毒毒株多樣性中的作用流行趨勢

基因突變、基因重配和基因重組被認為是輪狀病毒毒株變異性較高的三個重要因素。基因突變通常是引起輪狀病毒基因多態(tài)性的主要原因。輪狀病毒與其它的RNA病毒一樣,基因組具有較高的突變率,因為RNA復制中會出現(xiàn)錯配,基因突變的結果最終導致進化中的輪狀

病毒發(fā)生變異。流行趨勢簡單的基因片段插入;可以改變輪狀病毒的表現(xiàn)型;以基因重配介導的蛋白質的相互作用將會影響其血清型;將會引起新的輪狀病毒抗原的出現(xiàn)。流行趨勢基因重配在輪狀病毒毒株多樣性中起了關鍵性的作用,尤其是在混合感染的情況下。

基因重組主要也與輪狀病毒的演變和新的毒株的出現(xiàn)有關，基因重組將導致RV蛋白質的某一區(qū)域結構發(fā)生改變，發(fā)生改變的蛋白質結構區(qū)域可通

過基因突變發(fā)揮作用。流行趨勢

研究發(fā)現(xiàn)臺灣10年來流行的輪狀病毒株的VP1和VP7基因發(fā)生了較大變化，他們認為這是輪狀病毒株之間基因重配的表現(xiàn)。流行趨勢

研究表明英國1995-1999年流行毒株呈多樣性表現(xiàn)，這主要是流

行度毒株之間發(fā)生了基因重配。Iturriza等Zao等巴西1996年P[8]G5型毒株的出現(xiàn)是Wa株和豬輪狀病毒株基因重配的結果。流行趨勢Ramachandran等

研究顯示G9型HRV之間的較

大變化來自基因重組可能大于基因內(nèi)自然突變積累作用，新發(fā)生的G9型HRV可能起源于不同國家，他們通過與當?shù)豀RV混合感染基因重組

和基因突變多年積累而產(chǎn)生的。

綜上所述，基因突變、基因重配及基因重組在輪狀病毒毒株多樣性中起到了一定作用，尤其是基因重配。流行趨勢（四）輪狀病毒血清型與其臨床表現(xiàn)和

輪狀病毒腹瀉暴發(fā)流行的關系

輪狀病毒腹瀉的嚴重程度與輪狀病毒血清型的相關性研究一直是一個熱點。Bern等及Yolken等人發(fā)現(xiàn)感染G2型的患兒的癥狀比感染其它型別毒株的患兒嚴重，但并沒有對此進行

系統(tǒng)的統(tǒng)計學比較。流行趨勢對Palermo地區(qū)401名急性輪狀病毒性腸炎患兒進行了相關研究,結果研究發(fā)現(xiàn)電泳短型(亞組Ⅱ)HRV株引起的臨床癥狀要比電泳長型(亞組Ⅰ)HRV株嚴重,即G2型HRV株引起的臨床癥狀較其

它型別嚴重。輪狀病毒胃腸炎患兒的臨床的嚴重程度HRV毒株的毒力血清型(G或P型)可能有關可能相關流行趨勢Cascio等假設昆明的研究結果發(fā)現(xiàn)

電泳長型（亞組Ⅰ）和短型（亞組Ⅱ）對胃腸道的影響有差異，電泳長型RV胃腸炎住院患兒多于短型，電泳長型的癥狀更為嚴重。流行趨勢

認為這主要與新的毒株(G2型)的出現(xiàn)有關，在此10年之前Palermo地區(qū)幾乎沒有發(fā)

現(xiàn)G2型毒株，G2型毒株的出現(xiàn)使得Palermo地區(qū)

嬰幼兒對此毫無免疫力。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)新出現(xiàn)的HRV流行株可引起嬰幼兒腹瀉暴發(fā),其臨床癥狀嚴重。流行趨勢Cascio等

報道

1999年在荷蘭P[6]G9型HRV導致一起醫(yī)院嬰幼兒腹瀉暴發(fā)。此次腹瀉暴發(fā)持續(xù)5個月,臨床表現(xiàn)為急性水樣便,明顯脫水癥狀。該暴發(fā)

提示嬰幼兒可能缺乏相應的免疫保護。流行趨勢Marc-AlainWiddowson等

1998年引發(fā)倫敦一家醫(yī)院暴發(fā)腹瀉的HRV被鑒定為P[6]G9株。以往研究表明：引起新生兒隱性感染的輪狀病毒無論其VP7型別是1、2、3或是4,其VP4型別都屬于P2型,因此認為P2型的輪狀病毒是自然減毒株,已考慮用其作為疫苗株(代表株為M37)。流行趨勢

1997年首次報道在北京醫(yī)院產(chǎn)科母嬰同室病房P2型HRV株引發(fā)了一起新生兒嚴重腹瀉的暴發(fā)流行,18例患兒中5例重度脫水,重癥患兒每日大

便濕重可達120-150g。流行趨勢錢淵等

發(fā)現(xiàn)G3P2毒株可引起少數(shù)新生兒較嚴重的腹瀉,核苷酸分析表明：病毒基因在編碼VP4、VP7、NSP4等蛋白時出現(xiàn)特殊的氨基酸差異,這些氨基酸差異特別穩(wěn)定,可影響輪狀病毒的毒力,致使新生兒和嬰幼兒感染這些毒株后出現(xiàn)

不同的臨床表現(xiàn)。流行趨勢Kirkwood等

的研究由于無法解釋電泳長型(亞組Ⅰ)感染引起的臨床癥狀嚴重程度的不同,他們推測可能還與HRV毒株本身內(nèi)在的因素有關,如RV的毒力肽段NSP4有關。流行趨勢Cascio等

綜上所述，輪狀病毒腹瀉的臨床表現(xiàn)的嚴重程度可能與新出現(xiàn)的輪狀病毒血清型有關，尤其是輪狀病毒腹瀉的暴發(fā)流行，但同時可能還與其它的因素有關?？傊?，輪狀病毒血清型及其臨床癥狀的嚴重程度是否有直接關聯(lián)需進一步研究。流行趨勢三輪狀病毒非結構蛋白NSP4研究進展

傳統(tǒng)的發(fā)病機制認為RV感染后破壞小腸絨毛上皮細胞的絨毛結構,從而引發(fā)滲透性腹瀉和水、鹽分泌及吸收失調(diào)性腹瀉。然而,腹瀉可發(fā)生在絨毛脫落之前,這提示早期腹瀉與其它的因素相關。

1996年首次提出輪狀病毒非結構蛋白NSP4可能是一種腸毒素，并認為NSP4在RV的致病機理有著重要的作用。近年來，NSP4與RV的致病性的研究已成為世界范圍內(nèi)的一個熱點。NSP4研究進展Ball等（一）NSP4的分子結構

NSP4蛋白是輪狀病毒的一個非結構蛋白,NSP4由RV基因組中的第十基因片段編碼,初始產(chǎn)物含175個氨基酸,分子量為20kD,在氨基端糖基化后的分子量為28kD(糖基化后成為穿越內(nèi)質網(wǎng)的穿膜蛋白)。NSP4研究進展

NSP4的氨基端含三個疏水表位，兩個N型糖基化位點在第一個疏水表位，對這些糖基化的表位的生化合成研究證實，該蛋白具有一個不可切割的信號序列。NSP4的拓撲成像學研究證明，其氨基末端固定在內(nèi)質網(wǎng)膜內(nèi)，而其羧基端延伸至感染細胞的細胞漿內(nèi)。病毒顆粒是通過向內(nèi)質網(wǎng)膜出芽而成熟

的，而NSP4介導了這一病毒的成熟過程。NSP4研究進展

證實NSP4是一種跨內(nèi)質網(wǎng)膜(endoplasmicreticulum,ER)的糖蛋白,其氨基末端固定在內(nèi)質網(wǎng)膜內(nèi),而其羧基端延伸至感染細胞的胞漿內(nèi),可作為胞漿中的RV內(nèi)層顆粒(innercapsidparticle,ICP)的細胞內(nèi)受體,它能通過VP6蛋白結合病毒顆粒ICP,并將這些亞病毒顆粒通過出芽的方

式運至內(nèi)質網(wǎng)膜內(nèi)并獲得暫時性包膜。NSP4研究進展Taylor等的研究的研究也證實了這一點,同時發(fā)現(xiàn)NSP4親水區(qū)第114至135位氨基酸組成的肽段(NSP4114-135)具有腸毒素活性。NSP4研究進展認為NSP4親水區(qū)第114至140位氨基酸組成的肽段具有腸毒素功能。Ball等Zhang等

目前利用缺失突變和單克隆抗體技術已確認了NSP4的兩個功能區(qū)：一個是ICP結合區(qū)，另一個是VP4結合區(qū)，分別位于161-175位及132-148位

氨基酸。

NSP4研究進展NSP4研究進展O`Brien等Taylor等

采用圓二色譜法也證實該區(qū)域存在隨機構型,可能與結合ICP有關。

通過有限蛋白水解(limitedproteolysis)及質譜分光測定法(massspectrometry)研究ＲVSA11株NSP4的胞漿區(qū)結構,發(fā)現(xiàn)C端存在28個氨基酸的蛋白敏感區(qū)。（二）NSP4與RV的致病性NSP4蛋白質在輪狀病毒形態(tài)發(fā)生中的作用1NSP4與Ca2+轉運在RV致病中的作用2NSP4與Na+離子和右旋葡萄糖同向轉運在RV致病中的作用3NSP4與宿主細胞之間的作用4NSP4基因突變與RV毒力的關系5NSP4研究進展1、NSP4蛋白質在輪狀病毒形態(tài)發(fā)生中的作用 輪狀病毒的形態(tài)發(fā)生是一個獨特的過程,細胞質中不成熟的病毒雙層顆粒(DLPS)在穿越內(nèi)質網(wǎng)時,內(nèi)質網(wǎng)上定位的病毒蛋白NSP4、VP7包裝到雙層顆粒。NSP4研究進展V4結合結構域結合V4蛋白V2、V6結合結構域結合雙層顆粒病毒粒子形成暫時的三層包膜顆粒進入內(nèi)質網(wǎng)腔外層的暫時性脂膜和NSP4蛋白脫落，V4、V7蛋白重排形成三層膜的病毒顆粒內(nèi)質網(wǎng)腔

細胞質內(nèi)

NSP4研究進展

VP7蛋白表達的阻遏，不影響病毒蛋白的表達和分配，但病毒顆粒積累在內(nèi)質網(wǎng)腔中，不能形成完整的病毒粒子。用RNAi技術沉寂了NSP4或VP7蛋白的表達使子代病毒顆粒數(shù)目減少了75%～80%Tomas等NSP4蛋白表達的阻遏影響了病毒蛋白在細胞內(nèi)的表達和病毒蛋白在細胞中的定位，從而使病毒雙層顆?；蛉龑宇w粒很少形成。NSP4蛋白質是一個內(nèi)質網(wǎng)定位蛋白，作為雙層顆粒（DLPS）受體，驅動DLPS進入內(nèi)質網(wǎng)VP7使病毒顆粒脫去暫時性的包膜，形成完整的三層包膜病毒粒子推測推測NSP4研究進展RV形態(tài)成熟的過程及對細胞的溶解作用RV侵入細胞2、NSP4與Ca2+轉運在RV致病中的作用 鈣離子（Ca2+）在RV的復制和致病中發(fā)揮著重要的作用。

病毒轉錄的激活病毒顆粒的釋放Ca2+參與NSP4研究進展在細胞外介質中，Ca2+對RV外殼蛋白結構具有穩(wěn)定作用,當病毒侵入細胞后,細胞內(nèi)較低的Ca2+濃度即可使病毒外衣殼蛋白發(fā)生溶解及轉錄酶激活。RV蛋白的合成對Ca2+的穩(wěn)態(tài)具有調(diào)節(jié)作用,而Ca2+的穩(wěn)態(tài)則可促進RV形態(tài)的成熟,同時在誘導細胞死亡中也起了一定的作用。NSP4研究進展

NSP4與Ca2+轉運的研究最早開始于90年代初。NSP4研究進展Tian等在昆蟲細胞中表達NSP4的研究中發(fā)現(xiàn)NSP4除了對細胞具有細胞毒作用外，還可升高細胞內(nèi)Ca2+（[Ca2+]i）濃度。

Tian等對此現(xiàn)象進一步的研究：用純化的NSP4作用于昆蟲細胞表面時,細胞內(nèi)的Ca2+濃度顯著升高,且這種調(diào)節(jié)作用可被磷酯酶C(phospholipaseC,

PLC)抑制劑所阻斷,但未對此現(xiàn)象的產(chǎn)生機制進行深入的闡述,故在當時NSP4對Ca2+轉運的作用未引起人們的關注。NSP4研究進展

1996年Ball等在NSP4引發(fā)新生鼠腹瀉的研究中首次提出了NSP4對Ca2+轉運的調(diào)節(jié)作用的機理：NSP4是通過啟動一個信號轉導途徑引起細胞內(nèi)鈣離子濃度升高,Cl-離子分泌增加,最終產(chǎn)生腹瀉。繼此之后的大量相關研究一致認為NSP4通過信號轉導途徑調(diào)節(jié)Ca2+轉運。NSP4研究進展Ball等

1nmol的外源性NSP4即可使鈣離子從細胞內(nèi)鈣庫釋放并伴隨細胞外Ca2+內(nèi)流進入細胞,從而使細胞內(nèi)Ca2+濃度升高。當NSP4的量為4.6±0.8nmol時,

NSP4對鈣離子轉運的調(diào)節(jié)作用最強,這提示NSP4對鈣離子轉運的調(diào)節(jié)作用與劑量大小有關。NSP4研究進展Dong等的研究顯示

然而,細胞內(nèi)鈣離子升高的同時,Na+離子的濃度不受影響,表明NSP4是選擇性的使細胞外鈣離子進入細胞。若先用磷酯酶C的抑制劑、胰蛋白酶或糜蛋白酶作用于RV感染的細胞,NSP4升高細胞內(nèi)Ca2+濃度的作用被中和。此外,NSP4能快速導致1,4,5-三磷酸肌醇（1,4,5-IP3）短暫升高。NSP4研究進展

由此，Dong等認為是通過激活磷酯酶C和增加IP3的生成這一信號轉導途徑來調(diào)節(jié)Ca2+轉運，而且細胞外無鈣離子溶液對NSP4反應無明顯影響，因此細胞內(nèi)鈣離子濃度升高主要為細胞內(nèi)鈣庫釋放造成。NSP4研究進展增加內(nèi)質網(wǎng)膜的基礎通透性

關于內(nèi)源性NSP4對鈣離子轉運的調(diào)節(jié)作用，各研究組一致認為內(nèi)源性NSP4是通過增加內(nèi)質網(wǎng)膜的基礎通透性而使細胞內(nèi)Ca2+濃度升高。

激活磷酯酶C和增加IP3的生成,細胞內(nèi)鈣庫釋放Ca2+濃度↑選擇性的使細胞外鈣離子進入細胞外源性NSP4內(nèi)源性NSP4NSP4研究進展3、NSP4與Na+離子和右旋葡萄糖同向轉運在

RV致病中的作用 有關NSP4與Na+離子轉運的相關研究甚少,且部分研究一致認為NSP4對Na+離子轉運無影響。最近Halaihel等在體外實驗中首次發(fā)現(xiàn)NSP4對兔腸道上皮細胞刷狀緣膜上的Na+離子和右旋葡萄糖同向轉運(Na+-D-glucosesymporter,SGLT1)有抑制作用。NSP4研究進展

而且該抑制作用具有特異性和非競爭性。在Na+離子和右旋葡萄糖轉運單位上有三個與NSP4肽段結合的位點。Halaihel的發(fā)現(xiàn)提示體內(nèi)RV感染的過程中,NSP4有可能同樣對SGLT1產(chǎn)生抑制作用，

從而導致水的重吸收障礙,NSP4研究進展

由此推測NSP4對SGLT1的抑制在RV感染所致腹瀉的發(fā)病機理中起了一定的作用。該研究是RV發(fā)病機制的又一突破,但目前仍無定論,尚需進一步研究。NSP4研究進展4、NSP4與宿主細胞之間的作用 RV感染的過程是RV與宿主細胞相互作用的復雜過程。Tian等最早注意到NSP4對細胞膜具有破壞作用。Newton等在猴腎上皮細胞中表達重組RV疫苗株NSP4時也發(fā)現(xiàn)腎上皮細胞的胞漿膜的完整性受到損害及細胞的超微結構變化提示細胞死亡,且NSP4對腎上皮細胞的細胞毒作用與其劑量有關。NSP4研究進展

發(fā)現(xiàn)純化的NSP4或NSP4114-135肽段可改變腸上皮細胞的細胞膜的形態(tài)，且NSP4的第114位氨基酸至135位氨基酸是與細胞膜結合的功能區(qū)域。NSP4與細胞膜的結合具有選擇性，即NSP4僅與彎曲度較大而面積較小的單層囊泡膜發(fā)生作用，卻不與彎曲度較小而面積較大的單層囊

泡膜發(fā)生作用。NSP4研究進展Huang等

在大腸桿菌中表達NSP4時發(fā)現(xiàn)NSP4對細菌的細胞膜有破壞作用,進一步研究發(fā)現(xiàn)NSP4第48位氨基酸至91位氨基酸殘基組成的肽段與膜的去穩(wěn)定狀態(tài)密切相關,他們推測這可能與該肽段具有帶負電荷的兩歧性分子的螺旋結構有關，NSP4研究進展Browne等NSP4分子結構中的雙螺旋低聚體化區(qū)域及NSP4114-135肽段對膜的穩(wěn)定狀態(tài)無直接作用,但可以提高NSP448-91肽段對膜的破壞作用。該研究結果提示NSP4在膜的去穩(wěn)定狀態(tài)中起著關鍵的作用及NSP4對哺乳類動物細胞可能具有細胞毒作用。NSP4研究進展

對NSP4與極化的上皮細胞(MDCK-1細胞)之間的相互作用進行了研究：當NSP4作用于上皮細胞的頂端而非基底側時，可降低跨上皮電阻及重新分布絲狀肌動蛋白，同時增大細胞間隙的通透性；并發(fā)現(xiàn)將1nmol的NSP4與極化的上皮細胞溫育20-30h后，跨上皮電阻大幅度降低，當去除NSP4后，上皮組織恢復了它的完整性和跨

上皮電阻。NSP4研究進展Tafazoli等

此外NSP4在上皮細胞緊密連接過程中阻止其相關蛋白ZO-1錨定,因而影響細胞緊密連接和極化上皮形成。由此可見，NSP4可特異性地破壞上皮細胞的細胞膜及細胞間的緊密連接,導致上皮細胞的完整性受到損害及細胞通透性改變。NSP4研究進展5、NSP4基因突變與RV毒力的關系

NSP4基因易突變,而NSP4與RV的毒力密切相關,由此,NSP4基因的突變將可能導致RV株的減毒?；谶@一假設,加之RV無癥狀感染的現(xiàn)象引起人們的重視及輪狀病毒疫苗的開發(fā),許多學者對此進行了大量的研究,但各研究報道不一致。最早Hoshino等在RV感染豬的模型研究中發(fā)現(xiàn)了RV

的毒力與NSP4基因突變有關。NSP4研究進展

經(jīng)在猴腎細胞傳代的減毒HRV89-12株與未傳代的毒株之間只有一個堿基發(fā)生變化,導致NSP445位處的丙氨酸變?yōu)樘K氨酸。由于無癥狀型和有癥狀型HRV株該位點處這兩種氨基酸都存在,不能作為毒力標記,因而認為89-

12RV疫苗株的減毒與NSP4基因突變或NSP4的氨基酸序列變異無關。NSP4研究進展Ward等的研究顯示：

對豬OSU株和Gottfrid株的毒力株及減毒株的NSP4氨基酸序列作了比較,提示NSP4的第131位-140位氨基酸的變異與RV的毒力至關重要,進而用桿狀病毒表達系統(tǒng)分別表達毒力株OSU(OSU-v)和減毒株OSU(OSU-a)的NSP4,并進行比較。NSP4研究進展Zhang等若OSU-V株NSP4第130位處的脯氨酸由OSU-a株NSP4該位點上的絲氨酸取代,則OSU-v株的NSP4失了原有致新生鼠腹瀉能力。Zhang等認為NSP4導致腹瀉的作用可能與NSP4的第114位至140位氨基酸殘基組成的肽段的C端結構有關,而不是特定

位點上的氨基酸變化,NSP4研究進展

由此推測：只有當NSP4的114位至140位處氨基酸的變異引起NSP4的分子結構發(fā)生改變時,NSP4的生物學活性才會受到影響,從而影響RV株的毒力。NSP4研究進展

對HRVWa株(Wa-v株,Wa-a株)、M株(M-v，M-a)及C組輪狀病毒Cowden株(Cowden-v株,Cowden-a株)的NSP4基因進行測序,并比較其對應的NSP4的氨基酸序列。NSP4研究進展Chang等其研究結果顯示：

故認為RV株毒力與NSP4基因突變所致的NSP4氨基酸變異存在一定關系。HRVNSP4氨基酸序列變異處Wa-v株與Wa-a株13，16，34位氨基酸處M-v株與M-a株53，104位氨基酸處Cowden-v株與Cowden-a株50，97位氨基酸處NSP4研究進展

發(fā)現(xiàn)用標準株SA11株建立的NSP4的cDNA1文庫與隨機獲得的SA11株的NSP4的cDNA2文庫之間有差異,即cDNA1文庫中NSP4第47位處的天冬酰胺(Asn)被cDNA2文庫中NSP4

該位點上的組氨酸(His)所代替。NSP4研究進展Tian等

進一步的研究發(fā)現(xiàn)NSP4-Asn和NSP4-His對鈣離子轉運的調(diào)節(jié)有差異,NSP4-Asn對鈣離子轉運的調(diào)節(jié)及細胞毒作用較NSP4-His更強。但Lee等認為無癥狀型和有癥狀型RV株的NSP4基因無差異,

提示RV減毒與NSP4基因突變無關。NSP4研究進展對南非地區(qū)新生兒病房中RV流行株G4P[6](G4P[6]-v,G4P6-a)的NSP4基因的核苷酸和對應的氨基酸序列進行比較,發(fā)現(xiàn)NSP4氨基酸序列有四處變異(82、114、138、169位氨基酸處),同時也發(fā)現(xiàn)兩種RV株的VP8*、VP7蛋白的氨基酸序列也有改變,提示RV毒力不僅與NSP4有關,可

能還與VP8*和VP7有關。NSP4研究進展Pager等

2002年至2004年中的輪狀病毒陽性標本中選取30份標本擴增出NSP4cDNA500bp送測序,結果顯示差異為第76位,137位和139位氨基酸變異位點集中在V-I,R-S,V-I,并用MEGA軟件進行分析,結果顯示NSP4變異同臨床流行癥狀相關性不大,龐偉等人做的動物研究中證實并未發(fā)現(xiàn)NSP4的變異同致

病毒力有明顯關系。NSP4研究進展

NSP4變異與地域及VP7血清型無關,不能夠根據(jù)VP7的血清型來推測NSP4的基因型。NSP4基因變異與輪狀病毒腹瀉臨床癥狀嚴重程度不相關。

NSP4研究進展

目前沒有研究證實NSP4特定位點的氨基酸突變與RV毒力的直接關系,NSP4與RV致病性有關的結構域尚未完全闡述清楚。以上的研究報道不一致,這可能與各研究中所采用的動物模型有關。NSP4研究進展此外,以上研究都僅局限于同一年齡段患兒RV無癥狀感染株和有癥狀感染株的NSP4基因的變異,而未對不同年齡段患兒RV無癥狀感染株NSP4基因的變異,尤其是對新生兒RV無癥狀感染株和年長兒無癥狀感染株的NSP4基因變異進行深入研究,推測以后在該領域將會有新的研究突破。NSP4研究進展四輪狀病毒感染的發(fā)病機制

輪狀病毒感染的發(fā)病機制目前仍不十分明確,但是通過對輪狀病毒感染動物模型的實驗研究,為我們認識輪狀病毒的作用機理提供了一定線索。

輪狀病毒感染任何動物依賴于宿主和病毒兩方面的因素。

輪狀病毒感染宿主后以在小腸粘膜上皮細胞復制為特點,病理學改變表現(xiàn)為:

絨毛變短萎縮

細胞溶解

固有層單核細胞浸潤

內(nèi)質網(wǎng)池膨脹

線粒體腫脹等。

這些組織病理學改變發(fā)生在感染后24-36小時。發(fā)病機制

早期研究認為,腸上皮細胞的破壞引起的吸收功能不良直接導致腹瀉的發(fā)生。隨著研究的深入,有資料表明腸上皮細胞破壞后繼發(fā)的吸收功能不良,尚不足以完全解釋腹瀉的進展,因為在對一些動物的研究發(fā)現(xiàn),腹瀉可以發(fā)生在腸粘膜發(fā)

生病理改變之前；發(fā)病機制

并且在一些感染異源性輪狀病毒的新生鼠中發(fā)現(xiàn),這些鼠發(fā)生了腹瀉,但腸粘膜組織結構沒有明顯變化；研究人員還發(fā)現(xiàn)給輪狀病毒感染的幼豬口服

表皮生長因子對腹瀉的病程沒有明顯作用。

發(fā)病機制

隨著細胞分子水平研究的發(fā)展,病毒的蛋白質結構、毒力、致病性等方面的作用開始受到人們的關注。

VP4和VP7作為輪狀病毒結構蛋白,在維持病毒的穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要作用,VP4對于病毒吸附和進入上皮細胞非常重要。發(fā)病機制 NSP1、NSP2可能與輪狀病毒的復制有關,但具體功能尚未闡明。

NSP4作為輪狀病毒非結構蛋白在作用機制方面成為研究的熱點。發(fā)病機制

研究已發(fā)現(xiàn)NSP4作為一種細胞內(nèi)受體在病毒裝配過程中,介導病毒顆粒進入內(nèi)質網(wǎng)時獲得瞬時包膜,同時NSP4刺激內(nèi)質網(wǎng)貯存池釋放鈣離子(Ca2+),并且維持這一作用過程。更有研究表明NSP4作為輪狀病毒誘導產(chǎn)生的腸毒素,在感染后24小時可能通過細胞溶解從感染的細胞中釋放出來，發(fā)病機制

一方面激活細胞內(nèi)的Ca2+，Ca2+濃度的升高通過磷脂酶C的信號傳導，產(chǎn)生氯離子的跨膜轉運及酶轉運的激活，促進腸腔內(nèi)液體的分泌及吸收的減少，從而產(chǎn)生腹瀉；

另一方面通過改變細胞內(nèi)肌動蛋白的分布和細胞內(nèi)連接進一步加重腹瀉。發(fā)病機制

NSP4致腹瀉的方式與一些細菌毒素相似，不引起組織學改變，只影響腸道的分泌功能。給鼠注射純化NSP4114—135氨基酸殘基組成的肽段可致幼鼠腹瀉，證實了NSP4在腹瀉發(fā)生中的重要作用。發(fā)病機制

除了腹瀉早期NSP4對粘膜的直接作用外,已有研究表明腸袢神經(jīng)系統(tǒng)直接參與了腹瀉的進展。固有的宿主介導的防御機制,可以通過病毒復制或NSP4誘導的Ca2+活化進一步激活,從而維持

腹瀉的進展。發(fā)病機制

在幼鼠感染48-60小時后,局部腸粘膜可以發(fā)現(xiàn)典型的反應性充血的病理變化：組織水腫、血管擴張,這可能與腸袢系統(tǒng)粘膜神經(jīng)反射的激活有關。另有數(shù)據(jù)顯示66%輪狀病毒誘導的腸腔液體分泌是

通過腸神經(jīng)系統(tǒng)分泌介導的。發(fā)病機制 目前對于輪狀病毒感染后，NSP4與腸袢神經(jīng)系統(tǒng)激活以及釋放神經(jīng)活性物質之間是否存在聯(lián)系等問題,在細胞水平上仍亟待解決,有待于進一步深入研究。發(fā)病機制五輪狀病毒感染與免疫機制

輪狀病毒感染人體后的免疫機制目前尚未闡明。盡管輪狀病毒感染動物模型與人體有一定不同,但是對這些模型的研究能為我們提供一些輪狀病毒介導的機體免疫反應的線索。感染輪狀病毒后,宿

主的免疫反應包括：體液免疫細胞免疫粘膜免疫

對鼠模型研究發(fā)現(xiàn)在輪狀病毒感染后,可以在小腸周圍組織如：集合淋巴結、腸系膜淋巴結中發(fā)現(xiàn)輪狀病毒,在這些部位最先出現(xiàn)的是大量不依賴于T細胞的B細胞。免疫機制Sarah等

在感染后四天，最先出現(xiàn)輪狀病毒特異性IgM，而IgA在感染后10天排毒近乎停止時才出現(xiàn)。對人及兔的研究也發(fā)現(xiàn)，輪狀病毒特異性IgM在輪狀病毒感染后早期先升高(感染后7天內(nèi)),隨后逐

漸下降,此時IgA、IgG水平才開始升高。免疫機制

研究了IgA敲除幼鼠也發(fā)現(xiàn)，這類幼鼠與IgA正常幼鼠相比，清除輪狀病毒的能力無明顯差異，這可能通過代償性地增強輪狀病毒特異性IgM、IgG亞群生成有關。免疫機制Neal等

這些都提示了輪狀病毒感染早期腸粘膜表面B淋巴細胞介導了重要的免疫反應，輪狀病毒特異性IgA對于感染早期輪狀病毒清除作用不大。對兒童感染輪狀病毒研究顯示輪狀病毒特異性IgA在

預防再次感染方面具有重要作用。免疫機制免疫機制Velazquez等

動態(tài)研究了200例墨西哥從出生至2歲兒童的血清輪狀病毒IgA、IgG水平,結果顯示:

血清中抗輪狀病毒IgA滴度>1:800時,嬰兒感染輪狀病毒和發(fā)生相關性腹瀉的危險性均較低；

IgG滴度>1:6400時其感染輪狀病毒的危險明顯較低,但無抗腹瀉作用。

研究表明輪狀病毒特異性IgA可以作為預防輪狀病毒感染及發(fā)生腹瀉的免疫標志。

CD8+細胞的效應器功能和CD4+細胞的細胞毒T細胞,在動物模型中已證實參與輪狀病毒清除及再感染的免疫保護作用。免疫機制 牛感染輪狀病毒后,小腸粘膜淋巴細胞亞群數(shù)目增加,上皮內(nèi)CD4+細胞和固有層CD8+細胞明顯增加。對限菌豬的研究發(fā)現(xiàn)感染輪狀病毒后,腸系膜淋巴結等腸道組織較早出現(xiàn)T細胞反應,外周血單個核細胞(PBMCs)的輪狀病毒特異性T細胞反應,可以認為

是腸道T細胞反應的指標。免疫機制

腸道T細胞反應與全身T細胞反應同時在輪狀病毒感染中參與重要的角色。不同T淋巴細胞亞群在輪狀病毒感染后發(fā)揮各自的作用。

CD8+細胞在抑制病毒生長和控制輪狀病毒感染等方面，通過充當病毒特異性細胞毒性淋巴細胞發(fā)揮作用；

CD4+細胞對產(chǎn)生粘膜和全身輪狀病毒特異性抗體及再次感染的恢復起作用。免疫機制

對于輪狀病毒腹瀉患兒研究也表明急性期存在細胞免疫的異常,顯示了細胞免疫在輪狀病毒感染后參與了重要的免疫反應。免疫機制

抗病毒的細胞因子如白介素2(IL-2)、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、腫瘤壞死因子(TNF)、干擾素(IFN)等在輪狀病毒感染中也發(fā)揮重要的免疫作用,這些細胞因子是由CD4+細胞、CD8+細胞和巨噬細胞等分泌的。免疫機制

對輪狀病毒腹瀉患兒的PBMCs研究發(fā)現(xiàn)IL-2及其受體急性期反應較低,恢復期明顯升高。

報道輪狀病毒腹瀉患兒的血清和大便IL-6水平在急性期明顯升高,

表明粘膜局部分泌產(chǎn)生的IL-6,參與了炎癥的病理過程。免疫機制姚英民等楊會鎖等

對輪狀病毒感染體外培養(yǎng)的腸上皮細胞研究,發(fā)現(xiàn)了IL-8mRNA的表達和其分泌的IL-8,IL-8的分泌量與病毒感染時間和感染量有關。

也報道了輪狀病毒腹瀉患兒急性期血清和大便IL-8均顯著升高,與病情程度密切相關。免疫機制Casola等李惠民等此外有報道表明IL-12參與了輪狀病毒腹瀉的免疫保護作用。Azim等

對輪狀病毒感染兒童及發(fā)展成遷延性腹瀉的兒童研究了血清IL-10、IFN、TNF-α水平,顯示IL-10、TNF-α在感染的急性期明顯增高,IFN在遷延性腹瀉兒童中明顯升高,表明IL-10可能通過刺激輪狀病毒特異性IgA分泌發(fā)揮免疫保護作用,IFN與發(fā)展為遷延性腹瀉有一定聯(lián)系。免疫機制

其它一些細胞因子如表皮生長因子和轉化生長因子，對于輪狀病毒感染后小腸上皮的恢復可能起一定作用。

報道了自然感染輪狀病毒后對再發(fā)感染、腹瀉、嚴重腹瀉的保護率分別為38%、77%、87%。

盡管自然感染后僅產(chǎn)生部分免疫作用,但是對其免疫機制的深入研究對于輪狀病毒感染的預防和治療具有重要意義。免疫機制Velazquez等六輪狀病毒感染與臨床表現(xiàn)

輪狀病毒感染與臨床表現(xiàn)的輕重程度有關,可以表現(xiàn)為亞臨床感染或者伴隨嚴重脫水表現(xiàn)的急性腹瀉。

輪狀病毒感染與其它病原菌引起的腹瀉相比

不同之處在于：臨床表現(xiàn)嘔吐持續(xù)時間長次數(shù)頻繁脫水發(fā)生率高住院時間較長

輪狀病毒感染的潛伏期約為2-4天,因此一部分病人由于機體的免疫保護機制可以表現(xiàn)為無癥狀感染,但是仍有部分病人在癥狀出現(xiàn)1-3天內(nèi),因合并嚴重水電解質紊亂而死亡。臨床表現(xiàn) 輪狀病毒感染機體經(jīng)過短暫的潛伏期后,開始出現(xiàn)癥狀,最早表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉，至少50%病例在腹瀉之前先發(fā)生嘔吐。Rodriguez等研究表明嘔吐通常持續(xù)2.6天,腹瀉持續(xù)約1-9天,平均5天。臨床表現(xiàn)

大便性狀為水樣蛋花湯樣便,每天10-20次,有時可含少許粘液,但大便鏡檢紅、白細胞則少見。大便中輪狀病毒排出高峰在病程的第三天,通常68%病人伴有發(fā)熱癥狀,但只有40%病人體溫超過39℃。臨床表現(xiàn) 輪狀病毒感染后依據(jù)嘔吐、腹瀉的程度決定是否合并脫水,通常合并等滲性脫水,但仍有部分病人表現(xiàn)為嚴重煩渴的高滲性脫水,可以通過血氣分析、血清尿素氮水平及各種電解質指標來反映脫

水情況。臨床表現(xiàn)輪狀病毒感染后合并脫水后住院時間平均為4天,但在部分乳糖不耐受、營養(yǎng)不良、免疫缺陷病人可發(fā)展為遷延性腹瀉,這與病毒復制周期延長和排毒時間延長有關。臨床表現(xiàn)

盡管輪狀病毒感染作為自限性疾病在大部分病人可完全痊愈,但是近年來各國研究人員發(fā)現(xiàn),輪狀病毒感染不僅可以引起腸道內(nèi)感染,而且在腸道外其它器官可以發(fā)現(xiàn)輪狀病毒感染,這些發(fā)現(xiàn)逐步引起人們的關注。臨床表現(xiàn)

最初人們發(fā)現(xiàn)輪狀病毒感染后會出現(xiàn)血清轉氨酶的升高，并且在一例肝膿腫患兒的肝膿液中分離出類似輪狀病毒的顆粒。隨著分子生物技術的發(fā)展，輪狀病毒感染引起的腸道外損傷進一步得到證實。臨床表現(xiàn)

在一例懷疑輪狀病毒腦炎的患兒的腦脊液和血清中，應用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)及補體結合試驗發(fā)現(xiàn)輪狀病毒特異性IgG,并且通過監(jiān)測抗體濃度的變化證實輪狀病毒腦炎的存在。后來他們從輪狀病毒腦炎患兒腦脊液、血清、糞便中用逆轉錄聚合酶鏈(RT-PCR)方法發(fā)現(xiàn)相同

VP7基因序列。臨床表現(xiàn)Ushijima等

應用核酸雜交及免疫組織化學的方法,對2例輪狀病毒感染后死亡患兒進行研究,在毛細血管、小靜脈、小動脈、心肌組織、大腦實質、小神經(jīng)膠質、神經(jīng)元、腸道、膀胱的內(nèi)皮細胞中都發(fā)現(xiàn)了輪狀病毒RNA,而且在大腸、近端小腸上皮細胞中也發(fā)現(xiàn)了輪狀病毒RNA,兩種方法結果一致,推測患兒死亡可能與輪狀病毒感染引起的內(nèi)皮炎有

關,特別是心臟、腦的損傷。臨床表現(xiàn)Morrison等

研究也證實了輪狀病毒存在多系統(tǒng)感染，并且在輪狀病毒感染死亡患兒的肺泡細胞內(nèi)和肝、腎組織等處檢測到了輪狀病毒。臨床表現(xiàn)李寧等

從1975年到2000年,輪狀病毒感染引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀報道很多,其中19例在腦脊液中發(fā)現(xiàn)輪狀病毒或者其特異性抗體,有的表現(xiàn)為高熱驚厥、腦炎、瑞氏綜合征、格林巴利綜合征、類脊髓灰質炎綜合征等。

對德國、臺灣、日本、美國的調(diào)查表明大約有4%輪狀病毒感染患兒會出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。這些癥狀多數(shù)不需治療,可經(jīng)過幾天至一月時間恢復,但少數(shù)仍有嚴重后遺癥和死亡的報道,推測可能是通過淋巴細胞攜帶輪狀病毒擴散,進入血腦

屏障引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染。臨床表現(xiàn)

有報道4例嚴重免疫缺陷合并輪狀病毒感染患兒用直接免疫過氧化物酶的方法研究發(fā)現(xiàn),在他們的肝細胞、腎集合管、近端小管胞漿及核周發(fā)現(xiàn)病毒的非結構蛋白,推測這些組織可能具有病毒受體,使病毒基因特異性表達,并且認為輪狀病毒感染的肝趨向性并非血清特異性,輪狀病毒容易通過

受損的肝細胞在肝組織中進一步復制。臨床表現(xiàn) 對20例先天性肝外膽道閉鎖的患兒研究發(fā)現(xiàn)，

C組輪狀病毒感染可能與先天性膽管閉鎖有關。

也報道了2例胰腺炎可能與輪狀病

毒感染有關。臨床表現(xiàn)Rubia等

另外有資料表明輪狀病毒感染后40%伴有呼吸道癥狀，有的出現(xiàn)在輪狀病毒腹瀉之前，有的甚至不出現(xiàn)腹瀉。輪狀病毒感染累及呼吸道癥狀表現(xiàn)為鼻炎、咽炎、喉炎及下呼吸道炎癥，在輪狀病毒感染的冬春季節(jié)支氣管炎患兒的支氣管分泌物中也發(fā)現(xiàn)了輪狀病毒，推測輪狀病毒可能為冬春季節(jié)呼吸道感染的病原之一。臨床表現(xiàn)

此外，輪狀病毒感染引起中耳炎、頸淋巴結炎、良性肌炎、川崎病、嬰兒猝死綜合征、腸套疊等也有報道。

臨床表現(xiàn)

輪狀病毒感染新生兒引起腸道外癥狀也很多。有報道輪狀病毒感染引起新生兒呼吸暫?！膭舆^緩發(fā)作情況，推測二者可能具有一定關系。臨床表現(xiàn)

報道了新生兒感染輪狀病毒死亡的病例，在患兒的肺組織、腦脊液、腹水中檢測出RV抗原，另外輪狀病毒感染引起中毒性休克、出血性壞死性小腸結腸炎也有報道。臨床表現(xiàn)湯耀斌等輪狀病毒感染引起的腸道外損傷的機制目前仍不清楚,推測可能與感染早期病毒排出高峰期發(fā)生病毒血癥有關,輪狀病毒通過感染淋巴細胞進入血液循環(huán),引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)及其它系統(tǒng)癥狀。對于輪狀病毒和腸道外感染的關系仍有待于進一步深入研究,這對預防及早期發(fā)現(xiàn)腸道外損傷及治療

具有重要意義。臨床表現(xiàn)綜上所述，輪狀病毒常在每年的秋冬季流行,其感染的主要部位是小腸粘膜上皮細胞,可造成細胞損傷,引起滲透性腹瀉。其臨床表現(xiàn)為發(fā)燒、嘔吐、腹痛以及解黃色水樣便,癥狀可持續(xù)3～8天。臨床表現(xiàn)感染嚴重時,會發(fā)生致命性的脫水及電解質平衡紊亂。輪狀病毒感染不僅可以引起腸道內(nèi)感染,而且在腸道外其它器官可以發(fā)現(xiàn)輪狀病毒的感染。臨床表現(xiàn)七

診斷

診斷輪狀病毒感染需要將臨床癥狀與特異性實驗室檢查結合起來。實驗室檢查SDS透射電鏡乳膠凝集試驗核酸探針技術ELISART-PCR

PAGE和ELISA可以直接檢測糞便提取物中的病毒RNA,前者可以檢測出103/ml病毒顆粒。后者較前者敏感性更高,可以檢測出105-106/ml的病毒顆粒,并且簡便快捷,成為臨床上使用廣泛的檢測手段。乳膠凝集試驗也是比較簡單經(jīng)濟的方法。診斷

核酸探針技術及RT-PCR技術可以直接擴增大便中輪狀病毒RNA,這是通過將輪狀病毒RNA逆轉錄為cDNA,再

將cDNA通過特異性引物擴增后進行測序分析,這種方法不但可以檢測出腦脊液、血中濃度很低的輪狀病毒,而且可以分析其血清型。診斷

除了這些方法外,通過監(jiān)測大便中輪狀病毒特異性IgA濃度變化,

可以間接觀察腸道中輪狀病毒復制情況。盡管有很多血清學方法檢測輪狀病毒感染,但是輪狀病毒特異性IgM在癥狀出現(xiàn)后5-6天才表現(xiàn)陽性,對于輪狀病毒感染的診斷意義不大。

細胞培養(yǎng)技術在體外已獲成功,但仍局限在臨床實

驗室中,不適宜廣泛推廣使用。診斷八治療小兒輪狀病毒腹瀉治療的重點是合理喂養(yǎng)和糾正水電解質平衡紊亂。自從世界衛(wèi)生組織推薦使用口服補液鹽以來,輪狀病毒感染的病死率已明顯下降,但是對于嚴重脫水病人還需要靜脈補液。 最近引起人們關注的是口服抗體治療胃腸道感染,盡管這些抗體容易在胃腸道分解,但是分解片段仍具有中和病毒的活性。有報道單次口服γ-球蛋白可以明顯縮短腹瀉持續(xù)時間,減少輪狀病毒排泌,縮短住院時間。治療但是用牛免疫的輪狀病毒抗體初乳治療輪狀病毒感染研究發(fā)現(xiàn)，雖然腹瀉持續(xù)時間縮短、大便中病毒數(shù)量輕度減少，但是與對照組相比無顯著差異。用含有輪狀病毒抗體人乳治療遷延性腹瀉已有成功的報道。治療現(xiàn)在很多研究表明一些細菌復合物可以治療輪狀病毒感染，如口服乳酸桿菌制劑可以縮短輪狀病毒腹瀉的時間，也有雙盲安慰組研究表明亞水楊酸鉍劑治療輪狀病毒腹瀉有效。治療國外有資料顯示腦啡肽酶抑制劑可以減輕腹瀉時間，這是通過抑制胃腸粘膜內(nèi)腦啡肽分解，從而阻止CAMP水平增高，減少氯離子跨膜轉運而發(fā)揮作用的。治療

在一些體外研究也顯示前列腺素A可以抑制輪狀病毒復制,改變病毒腸毒素NSP4糖蛋白結構,此外其它復合物包括唾液酸衍生物和各種腺嘌呤類似物對于輪狀病毒腹瀉有一定作用,仍有待于進一步

研究輔助治療效果。其它藥物如干擾素、思密達及中藥馬蹄香等都有報道顯示對于輪狀病毒腹瀉有一定的治療效果。治療八輪狀病毒疫苗的研制

輪狀病毒疫苗的研制始于80年代早期，經(jīng)過20年的努力，目前已取得了較大的進展與突破。

然而，輪狀病毒流行呈現(xiàn)出新的趨勢：不同年度流行優(yōu)勢株轉變異常毒株的出現(xiàn)G9型毒株全球流行混合感染比例增加

尤其是異常毒株的出現(xiàn)、G9型毒株全球流行迫切需要發(fā)展相應的疫苗?，F(xiàn)將分別闡述目前研制的疫苗。疫苗RRV-TVVLPs疫苗DNA疫苗疫苗的研制（一）四價恒河猴-人類重配輪狀病毒疫苗（RRV-TV）

RRV-TV疫苗(rhesusrotavirus(RRV)tetravalent(TV)

vaccine,RRV-TV)是通過恒河猴型輪狀病毒(RRV)MNU18006株(G3)和人輪狀病毒D株(G1)、DS-1株(G2)和ST3株(G4)共同感染細胞,經(jīng)過交叉選擇產(chǎn)生雜交株D×RRV、DS-1×RRV和ST3×RRV，疫苗的研制RRV的VP7基因分別被人輪狀病毒VP7基因(G1、G2和G4)替換,其余10個基因保留恒河猴輪狀病毒的基因,加上恒河猴輪狀病毒本身為G3型,從而構成四價輪狀病毒疫苗。疫苗的研制該疫苗針對世界范圍內(nèi)流行優(yōu)勢株G1-G4來預防RV腹瀉,在美國、芬蘭、委內(nèi)瑞拉的臨床試驗中:

對輪狀病毒腹瀉的保護效率為48%-68%,

對重型輪狀病毒腹瀉的保護效率超過80%,

并可持續(xù)兩年。疫苗的研制

美國FDA曾于1999年批準了惠氏公司研發(fā)的一種恒河猴輪狀病毒與人輪狀病毒重配的4價疫苗(取名RotaShield),用于預防輪狀病毒感染。該疫苗是用重配技術制備的一種重配(reassortant)疫苗,由一個G3型恒河猴RV與另三個分別含有G1、G2、G4

型VP7基因的人輪狀病毒重配株構成。疫苗的研制

該疫苗在美國、芬蘭、委內(nèi)瑞拉等腰三角形國的1萬余名兒童中進行臨床試驗中顯示很好的免疫原性,可使腹瀉發(fā)病率至